張少毅

【摘要】萊姆病是一種通過(guò)蜱叮咬人、獸傳播的人獸共患病，致病病原體主要是伯氏疏螺旋體，對(duì)萊姆病診斷方法的研究將對(duì)萊姆病的治療起到指導(dǎo)性作用。

【關(guān)鍵詞】萊姆??；伯氏疏螺旋體；檢測(cè)

【中圖分類號(hào)】R4 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】1671-8801（2016）02-0018-01

1 前言

萊姆病是一種全球性自然疫源性傳染病，人感染伯氏疏螺旋體后主要對(duì)人體多系統(tǒng)、多器官造成損害，該病臨床表現(xiàn)呈多樣性，因此容易與其他疾病相混淆，因而實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)結(jié)果對(duì)臨床疾病診斷具有重要的指導(dǎo)意義。目前主要的檢驗(yàn)方法可分為病原學(xué)診斷、特異性抗體及分子生物學(xué)檢測(cè)。

2 直接檢測(cè)

直接檢測(cè)即直接分離菌體用BSK培養(yǎng)基培養(yǎng)，生長(zhǎng)14天后，暗視野相差顯微鏡觀察其形態(tài)，但因其生長(zhǎng)緩慢，培養(yǎng)條件高，且長(zhǎng)期抗生素治療的慢性病人血培養(yǎng)常為陰性，因此不用于常規(guī)臨床診斷。但是如果分離培養(yǎng)出螺旋體，可視為“金標(biāo)準(zhǔn)”[1]。

3 免疫學(xué)技術(shù)檢測(cè)

3. 1間接免疫熒光抗體試驗(yàn)

伯氏疏螺旋體的表面有大量具有免疫原性的抗原成分，如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、脂蛋白、糖類等。伯氏疏螺旋體具有7～11個(gè)特征性抗原結(jié)構(gòu)的周鞭毛，含有具有免疫原性的鞭毛素，能夠引起強(qiáng)烈的抗原-抗體反應(yīng)。在免疫學(xué)診斷中萊姆病螺旋體的幾種主要抗原有鞭毛相關(guān)蛋白FlaB、鞭毛外鞘蛋白FlaA、OSPC和VlsE[2]。其中鞭毛蛋白FlaB感染萊姆病螺旋體幾天后即可出現(xiàn)強(qiáng)烈的IgM和IgG反應(yīng)。目前已經(jīng)建立了很多特異性檢測(cè)方法，最常用的是酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、酶聯(lián)熒光試驗(yàn)、蛋白印跡法，也有免疫層析法和斑點(diǎn)試驗(yàn)等。

3.2 ELISA

ELISA實(shí)驗(yàn)是一種間接診斷方法，菌株作為抗原時(shí)需要細(xì)菌表面能夠表達(dá)OspC，同時(shí)作為抗原物質(zhì)的還有DbpA、全細(xì)胞抗原、重組抗原和合成抗原。ELISA技術(shù)對(duì)萊姆病患者IgG和IgM抗體進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)重組抗原OspC、鞭毛蛋白抗原片段以及全細(xì)胞抗原進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)重組抗原檢測(cè)敏感性優(yōu)于全細(xì)胞抗原[2]。感染萊姆病的動(dòng)物臨床癥狀通常容易被忽視，檢測(cè)血清抗體對(duì)于動(dòng)物中萊姆病的診斷顯得比較重要，且血清抗體可以在感染動(dòng)物體內(nèi)存在數(shù)年。

3.3 免疫印跡法

免疫印跡法廣泛應(yīng)用于血清和血漿中有抗體出現(xiàn)的傳染性疾病的診斷，用免疫印跡法對(duì)萊姆病特異性抗體進(jìn)行檢測(cè)，其特異性高于ELISA和IFA。免疫印跡法的結(jié)果用特異性條帶來(lái)表示，美國(guó)建立了兩種診斷標(biāo)準(zhǔn)：IgM蛋白印跡陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)是在3條特異帶（OSPC，41kDa或39kDa）中存在2條即可；IgG蛋白印跡陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)是在10條特異帶中存在5條即可[3]。近年來(lái)有很多研究對(duì)免疫印跡法的進(jìn)一步發(fā)展對(duì)臨床上萊姆病螺旋體的診斷提供了更加可靠的診斷方法，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)了很多抗體檢測(cè)都具有潛在的診斷價(jià)值。

3.4 蛋白質(zhì)芯片技術(shù)

過(guò)去的十幾年里，DNA芯片技術(shù)為全方位的基因研究提供了有力的工具，也在不同的領(lǐng)域發(fā)揮著很多作用，同時(shí)作為疾病檢測(cè)技術(shù)引導(dǎo)了生物醫(yī)學(xué)研究方向的轉(zhuǎn)變。采用蛋白質(zhì)芯片技術(shù)對(duì)不同生理和病理狀態(tài)下蛋白質(zhì)的作用和表達(dá)進(jìn)行分析，這將會(huì)加速對(duì)生理作用過(guò)程和疾病作用機(jī)制的理解，找到更有效的疾病治療新策略。有研究[4]用金箔玻璃芯片用N-羥基琥珀酰亞胺進(jìn)行修飾，通過(guò)修飾作用，使蛋白質(zhì)及多肽側(cè)鏈上含有游離氨基基團(tuán)的氨基酸如賴氨酸，精氨酸等可以通過(guò)共價(jià)鍵結(jié)合到芯片表面，以達(dá)到臨床免疫血清檢測(cè)的目的。

4 分子生物技術(shù)檢測(cè)

4.1 常規(guī)PCR

普通PCR檢測(cè)主要通過(guò)檢測(cè)患者尿液中伯氏疏螺旋體DNA的陽(yáng)性率，臨床標(biāo)本伯氏疏螺旋體DNA檢測(cè)的靈敏度差異可能取決于疾病器官表現(xiàn)、病程階段和樣品分析方法，采取患者尿液標(biāo)本取上清，根據(jù)rrf3和rrf5端利用引物設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)引物，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增， PCR檢測(cè)患者尿液伯氏疏螺旋體DNA是診斷萊姆病一個(gè)有價(jià)值的工具[5]。

4.2 熒光定量PCR

熒光定量PCR融合了PCR高靈敏性、DNA雜交的高特異性和光譜技術(shù)的高精確定量等優(yōu)點(diǎn)，通過(guò)直接探測(cè)PCR過(guò)程中熒光信號(hào)的高中低三種熒光信號(hào)不同變化來(lái)獲得定量的結(jié)果，不需要一邊拿PCR的后處理以及電泳檢測(cè)，克服了常規(guī)PCR技術(shù)的一些問(wèn)題。根據(jù)相關(guān)基因mRNA表達(dá)量的不同對(duì)伯氏疏螺旋體可判斷病菌的致病性。

4.3 巢式PCR

在伯氏疏螺旋體的眾多相關(guān)基因中，rrf（5S）～rrl（23S）rRNA基因間隔區(qū)巢式PCR可用于疑似萊姆病患者血清標(biāo)本檢測(cè)，從病原學(xué)角度支持萊姆病的診斷。巢式PCR采用兩對(duì)引物，一對(duì)引物序列在模板的外側(cè)，另一對(duì)引物序列在模板的內(nèi)側(cè)，第一對(duì)引物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物作為第二對(duì)引物退火的模板，這樣可以使檢測(cè)的靈敏度得以提高，而且大大提高了PCR的特異性。

近年來(lái)，芯片技術(shù)的不斷優(yōu)化，也為萊姆病的診斷提供了新的方法，能夠針對(duì)大樣本和應(yīng)用微量稀釋抗體和血清進(jìn)行高通量的檢測(cè)，這些都為萊姆病的檢測(cè)開拓了更加廣闊的前景。

參考文獻(xiàn)：

[1]李新軍， 張啟恩， 張泮河， 等. 重組伯氏疏螺旋體鞭毛抗原用于萊姆病血清學(xué)診斷方法的研究[J]. 中國(guó)公共衛(wèi)生， 2000， 16（11）： 1013-1014.

[2]譚毓繪， 劉勇， 孫荷， 等. 聚合酶鏈法檢測(cè)萊姆病患者尿液中伯氏疏螺旋體 DNA （N17 例報(bào)道）[J]. 中國(guó)臨床神經(jīng)科學(xué)， 2012， 20（4）： 372-376