呂　倩，王顏顏，劉濤華，牟麗麗，陳　燕，康穎倩

(貴州醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)教研室，貴州貴陽　550004)

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念珠菌RPB1基因片段PCR擴(kuò)增條件的優(yōu)化*＊?

呂倩，王顏顏，劉濤華，牟麗麗，陳燕，康穎倩＊＊

(貴州醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)教研室，貴州貴陽550004)

［摘要］目的:優(yōu)化念珠菌RNA聚合酶Ⅱ大亞基(RPB1)基因片段的PCR擴(kuò)增條件，篩選適宜念珠菌RPB1 的PCR擴(kuò)增體系。方法:使用改良CTAB法提取念珠菌基因組DNA，分別調(diào)整念珠菌RPB1基因片段PCR擴(kuò)增過程中ddH2O含量、DNA模板含量、退火溫度或循環(huán)次數(shù)，比較不同反應(yīng)體系的PCR擴(kuò)增效果。結(jié)果:在26 μL 的PCR反應(yīng)體系中，DNA模板含量2 μL、退火溫度為56℃、循環(huán)40次時(shí)是念珠菌RPB1基因片段最穩(wěn)定的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系，擴(kuò)增得到24條皺褶念珠菌RPB1基因片段序列，上傳至GenBank。結(jié)論:優(yōu)化PCR擴(kuò)增條件后，念珠菌RPB1基因片段的目的條帶更明亮、清晰，為基因測(cè)序及深入研究念珠菌的工作奠定了基礎(chǔ)。

［關(guān)鍵詞］念珠菌屬; RPB1基因片段; CTAB;基因擴(kuò)增

＊＊通信作者E-mail: joycekangtokyo@ qq.com

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間: 2016－02－23網(wǎng)絡(luò)出版地址: http: / /www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160223.2106.062.html

近年來，由于免疫抑制劑和廣譜抗生素的濫用，以及艾滋病患者的增多，人群感染念珠菌呈明顯上升趨勢(shì)［1］。目前，除了間隔區(qū)和核糖體大亞基序列被廣泛應(yīng)用于念珠菌菌屬的分類鑒定之外，RPB1基因片段與其他基因片段(如ITS、ACT1)相結(jié)合也廣泛地應(yīng)用于真菌研究中［2］。RPB1基因片段是負(fù)責(zé)編碼RNA聚合酶Ⅱ最主要的功能亞基，具有單拷貝和進(jìn)化速率慢的特點(diǎn)［3］，Ku等［4－5］認(rèn)為以RPB1基因作為物種之間鑒定的標(biāo)準(zhǔn)比核糖體基因有優(yōu)勢(shì)。本課題前期研究發(fā)現(xiàn)，多位點(diǎn)序列分型方法對(duì)皺褶念珠菌RPB1基因擴(kuò)增后往往會(huì)出現(xiàn)目的條帶不清晰、擴(kuò)增特異性差等情況，不利于測(cè)序及序列分析，因此，此次研究通過探索RPB1基因片段擴(kuò)增的條件，以找到最佳PCR反應(yīng)體系，為今后對(duì)念珠菌RPB1基因片段的研究提供可靠的試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1　材料與方法

1.1菌種與試劑

24株經(jīng)間隔區(qū)和核糖體大亞基序列鑒定過的皺褶念珠菌，由荷蘭真菌多樣性研究中心惠贈(zèng)，見表1。CTAB緩沖液: 1 mol/L Tris-HCl (pH8.0) 50 mL + NaCl 40.91 g + 0.5 mol/L EDTA(pH8.0) 20 mL + CTAB10 g，ddH2O定容至500 mL; SEVAG(氯仿∶異丙醇= 24∶1)，異丙醇，6Xloading Buffer (0.25%溴酚藍(lán))。TE(pH8.0) : 10 mmol/L Tris-HCl (pH8.0) +1 mmol/L EDTA(pH8.0)。PDA培養(yǎng)基購自日本Ltd公司，PCR Mix及DNA marker購自永博鑫生物技術(shù)公司。

表1　24株試驗(yàn)皺褶念珠菌種Tab.1 24 isolates of C.rugosa species included in the study

1.2提取念珠菌DNA

采用CTAB法［6］提取念珠菌基因組DNA:取菌體約60 mg于1.5 mLEP管中，加入CTAB-buffer-2X 490 μL及10%聚乙烯吡咯烷酮100 μL，Mo-Bio漩渦器充分混勻10 min，60℃水浴箱60 min，冰箱片刻使其快速降到室溫，待菌落溶解后，加入SEVAG 500 μL，震蕩2 min，形成乳濁液，14 000 r/ min離心10 min，收集上清液于1 mL EP管中，加入冰預(yù)冷異丙醇(體積為上清液的2/3)，混勻，上下顛倒離心管，－20℃過夜培養(yǎng)，14 000 r/min離心10 min，棄上清，加入冰預(yù)冷70%乙醇1 mL，輕輕混勻，14 000 r/min離心2 min，棄乙醇，重復(fù)兩次，室溫干燥后加入1×TE 50 μL，于－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3調(diào)整C.pseudorugosa擴(kuò)增條件

根據(jù)參考文獻(xiàn)［7］RPB1基因片段擴(kuò)增條件，對(duì)可能影響擴(kuò)增效果的因素DNA模板量、ddH2O、退火溫度及循環(huán)次數(shù)進(jìn)行單因素調(diào)整試驗(yàn)。以念珠菌(CBS12857)基因組DNA為模板，以Chaves［7］擴(kuò)增引物(GenBank編號(hào)EF599409) rbp1F-5'CATGTGAGCTGGTGTGTATGC和rbp1R-5' CGAGCTTGAACGTCAAATCA分別為前后引物，用PCR beads (Ready-To-Go; Amersham Pharmacia Co.Ltd.，Piscataway，NJ，USA)在26 μL反應(yīng)體系中擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系含Mix 13 μL，ddH2O 10 μL，前后引物各1 μL，DNA模板濃度分別為1、1.5、2、2.5及3 μL，梯度PCR(7個(gè)不同退火溫度: 53、54、55、56、57、58 及59℃) 45 s;循環(huán)次數(shù)分別為35、36、37、38、39、40次。擴(kuò)增結(jié)束將產(chǎn)物于1.0%瓊脂糖凝膠電泳(電壓100 V)，紫外燈下觀察，并將PCR產(chǎn)物送測(cè)序公司測(cè)序。

2　結(jié)果

PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示，擴(kuò)增的目的條帶在400 bp左右。當(dāng)反應(yīng)體系為Mix 13 μL、前后引物各1 μL、ddH2O 9 μL、DNA模板量2 μL、退火溫度56℃、循環(huán)次數(shù)為40次時(shí)，PCR產(chǎn)物條帶最清晰明亮，且大小完整，無明顯拖帶，見圖1－C6;當(dāng)DNA模板量為1 μL、ddH2O 10 μL時(shí)，擴(kuò)增目的條帶相對(duì)較淡，稍有雜帶，見圖1－A2;當(dāng)退火溫度為56℃時(shí)，雖然目的條帶清晰明亮，但有明顯雜帶，見圖1－B4，不能用于念珠菌RPB1的直接測(cè)序分析。本研究成功擴(kuò)增出24株念珠菌RPB1基因片段，測(cè)序結(jié)果峰圖效果理想，沒有出現(xiàn)套峰現(xiàn)象。序列長(zhǎng)度約為460 bp，GenBank登錄號(hào)見表2。

表2　24株念珠菌RPB1基因擴(kuò)增片段在GenBank中的菌株及序列登錄號(hào)Tab.2　Strains and sequence registration number of 24 strains of Candida RPB1 gene amplification fragment in GenBank

3　討論

本課題前期研究發(fā)現(xiàn)，RPB1基因在PCR擴(kuò)增過程中，會(huì)出現(xiàn)目的條帶不清晰、擴(kuò)增特異性差等情況。推測(cè)RPB1基因末端的CTD結(jié)構(gòu)域(C-terminal domain)在酵母菌中拷貝時(shí)，由于拷貝數(shù)量的改變引起細(xì)胞生長(zhǎng)缺陷或死亡。因此，為保證在提取基因組DNA之前的菌株活性，選用營(yíng)養(yǎng)條件稍高的馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng)，在37℃條件下活化兩次。本次研究采用改良CTAB方法提取菌株DNA，通過利用冰凍試劑快速析出DNA，－20℃過夜，冰預(yù)冷2次，除去雜質(zhì)，吹干后利用TE進(jìn)行稀釋，提高了DNA純度。

注: 1、3、5為DNA marker; 2為DNA模板量1 μL; 4為DNA模板量2 μL，退火溫度55℃; 6為DNA模板量2 μL，退火溫度56℃圖1　念珠菌RPB1基因擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果Fig.1　Result of PCR gel electrophoresis of Candida RPB1 gene

PCR反應(yīng)是對(duì)皺褶念珠菌進(jìn)行測(cè)序分析中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，它的擴(kuò)增效果是反應(yīng)體系和反應(yīng)程序綜合作用的結(jié)果［8］。本研究通過在其他因素不變的情況下，變化其中的一個(gè)因素，得到最適宜的RPB1基因片段的PCR擴(kuò)增條件。首先通過改變反應(yīng)體系中模板DNA的體積以找到最適的模板DNA量，試驗(yàn)結(jié)果表明通常加入的模板DNA體積為2μL時(shí)，擴(kuò)增出的目的條帶清晰。由此可見，模板DNA含量的高低會(huì)影響PCR反應(yīng)的結(jié)果。模板DNA量過低，會(huì)導(dǎo)致PCR產(chǎn)物的濃度也過低，目的條帶暗淡;模板DNA量過高時(shí)會(huì)導(dǎo)致模板與引物競(jìng)爭(zhēng)，模板與模板之間互相結(jié)合，雜帶增多。PCR反應(yīng)程序中變性溫度與DNA模板中G－C含量有關(guān)，G－C間由三個(gè)氫鍵相連，而A－T間只有兩個(gè)氫鍵相連，相比較來說，G－C結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定。所以當(dāng)模板G－C含量較高時(shí)，往往需要較高的解鏈溫度或添加一定量的二甲基亞砜(DMSO)。試驗(yàn)中的引物長(zhǎng)度為21 bp，G－C含量約為52%，不需要加入DMSO，采用常用變性溫度94℃。退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素，退火溫度太低，會(huì)導(dǎo)致目的條帶不出現(xiàn)、不清晰或出現(xiàn)非目的條帶;退火溫度太高，擴(kuò)增量會(huì)減少，有可能導(dǎo)致目的條帶的缺失。因此適宜的退火溫度能夠提高擴(kuò)增的特異性，在理想狀態(tài)下，退火溫度足夠低，以保證引物同目的序列有效退火，同時(shí)還要足夠高，以減少非特異性結(jié)合［9］。循環(huán)次數(shù)決定PCR擴(kuò)增程度，一般選在30～40次之間，循環(huán)次數(shù)越多，非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多。Mg2 +、Taq DNA酶、dNTP濃度對(duì)PCR反應(yīng)體系的影響也很大。Taq DNA酶濃度過高可引起非特異性擴(kuò)增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少; dNTP濃度過低會(huì)降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量、影響擴(kuò)增效率，濃度過高時(shí)又能與Mg2 +結(jié)合，使游離的Mg2 +濃度降低。本試驗(yàn)直接使用的是PCR Mix(由試劑公司將Mg2 +、Taq DNA酶、dNTP等成分混合在一起合成)，降低了配制試劑過程中出現(xiàn)誤差的幾率，減少試驗(yàn)時(shí)間，提高實(shí)驗(yàn)效率。

綜上，在26 μL的PCR反應(yīng)體系中，DNA模板含量為2 μL、退火溫度為56℃、循環(huán)40次，所得PCR產(chǎn)物條帶最清晰明亮。在此擴(kuò)增條件下，本研究成功得到了24株念珠菌的RPB1基因序列。

4　參考文獻(xiàn)

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(2015－10－27收稿，2015－12－30修回)

中文編輯:戚璐;英文編輯:趙毅

Optimization of PCR Amplification Condition of Candida RPB1

LV Qian，WANG Yanyan，LIU Taohua，MOU Lili，CHEN Yan，KANG Yingqian
(Department of Micro－biology，Guizhou Medical University，Guiyang 550004，Guizhou，China)

［Abstract］Objective: To optimize PCR amplification condition of Candida RNA polymeraseⅡrbcl (RPB1) gene fragment，screening appropriate PCR amplification system of Candida RPB1.Methods: Adopting modified CTAB method to extract Candida genome DNA，adjusting ddH2O content of Candida RPB1 gene fragment PCR amplification process，DNA mould content，annealing or number of cycles respectively; comparing PCR amplification effect of different response system.Results: In 26 μL PCR response system，Candida RPB1 gene fragment was in the most stable PCR amplification amplification when DNA mould content was 2 μL，annealing was 56℃and number of cycles was 40; amplification yielded 24 strains of Candida rugosa RPB1 gene fragment sequence and uploaded to GenBank.Conclusion: After optimizing PCR amplification conditions，target band of Candida RPB1 gene fragment was obvious and clear，which laid the foundation of gene sequencing and in-depth research of Candida.

［Key words］Candida; RPB1 gene fragment; CTAB; gene amplification

*［基金項(xiàng)目］國(guó)家自然科學(xué)基金(31060006，31260029) ;貴州省社會(huì)發(fā)展科技攻關(guān)項(xiàng)目［黔科合SY字(2011) 3017號(hào)］;貴陽市科技局社會(huì)發(fā)展與民生計(jì)劃［筑科合同(201103) 16號(hào)］

［中圖分類號(hào)］R34－33

［文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼］A

［文章編號(hào)］1000-2707(2016) 02-0135-04