白　碩，王冬香，朱鵬娜，唐正龍＊＊

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)附院口腔頜面外科，貴州貴陽　550004; 2.杭州市口腔醫(yī)院，浙江杭州　310000)

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不同劑量甲狀旁腺素對下頜骨牽張成骨新骨質(zhì)量的影響*＊?

白碩1，2，王冬香1，朱鵬娜1，唐正龍1＊＊

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)附院口腔頜面外科，貴州貴陽550004; 2.杭州市口腔醫(yī)院，浙江杭州310000)

［摘要］目的:研究不同劑量重組人甲狀旁腺素(rhPTH)對下頜骨牽張成骨新骨形成及質(zhì)量的影響。方法:日本大耳白兔45只，隨機(jī)均分為對照組和實(shí)驗(yàn)A、B、C、D組，在前牙和第一磨牙交界處垂直于下頜骨下緣，用慢速裂鉆作截骨線，牽張延長下頜骨10 mm，對照組動物隔日皮下注射生理鹽水1 mL，實(shí)驗(yàn)A、B、C及D組分別隔日皮下注射rhPTH 10、20、30、40 μg/kg，在固定期第1、7及14天時(shí)行牽張區(qū)新骨組織形態(tài)學(xué)研究和骨密度檢測。結(jié)果:各固定期實(shí)驗(yàn)組的成骨細(xì)胞數(shù)量、骨小梁面積和骨密度均較高，與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05) ;在固定期第1天時(shí)實(shí)驗(yàn)C組的平均成骨細(xì)胞數(shù)量和骨密度最高，隨固定期延長，各組新骨骨密度和骨小梁面積逐漸升高，而成骨細(xì)胞數(shù)量逐漸減少。結(jié)論:間斷皮下注射rhPTH可以促進(jìn)下頜骨牽張成骨新骨生成，不同劑量rhPTH促進(jìn)下頜骨牽張成骨可能存在劑量效應(yīng)差異。

［關(guān)鍵詞］重組人甲狀旁腺素;牽張成骨;下頜骨;骨密度;成骨細(xì)胞

＊＊通信作者E-mail: zhenglongtang@ hotmail.com

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間: 2016－02－23網(wǎng)絡(luò)出版地址: http: / /www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160223.1849.012.html

加速牽張成骨(distraction osteogenesis，DO)新骨生成并縮短牽張成骨療程是當(dāng)前口腔熱點(diǎn)研究課題。新骨的形成和代謝受多種因素的調(diào)節(jié)，包括激素及其受體、細(xì)胞因子等。甲狀旁腺素(parathyroid hormone，PTH)是甲狀旁腺主細(xì)胞分泌的維持機(jī)體內(nèi)鈣磷代謝平衡的一種重要的調(diào)鈣激素，能夠調(diào)節(jié)骨骼的合成代謝和分解代謝過程。目前尚未見應(yīng)用不同劑量PTH促進(jìn)頜骨牽張成骨的文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過建立下頜骨牽張成骨模型，并間斷性皮下注射不同劑量的重組人甲狀旁腺素(recombinant human parathyroid hormone，rhPTH)，采用組織學(xué)形態(tài)計(jì)量學(xué)觀察分析和骨密度檢測，研究不同劑量rhPTH對下頜骨牽張成骨新骨形成及成骨質(zhì)量的影響，為應(yīng)用PTH促進(jìn)頜骨牽張成骨提供理論支持和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物與分組

選用日本SPF級大耳白兔45只，5月齡，雌雄不限，質(zhì)量(2.5±0.2) kg，由貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，動物合格證號為SCXK(渝) 2007－0005。大耳白兔飼養(yǎng)在SPF級動物室中，室溫(22 ±2)℃、濕度(50±10) %、換氣次數(shù)≥14次/h、人工照明12 h，分籠飼養(yǎng);每只白兔每天供應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料350 g，自由飲用流動自來水。動物實(shí)驗(yàn)方案獲得貴州醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)倫理委員會的審查批準(zhǔn)，45只兔隨機(jī)分為對照組、實(shí)驗(yàn)A、B、C及D組，每組9只。

1.2方法

1.2.1下頜骨牽張成骨模型實(shí)驗(yàn)動物取仰臥位，四肢固定于手術(shù)臺上，3%戊巴比妥鈉按1 mL/ kg體質(zhì)量靜脈麻醉，手術(shù)區(qū)剪毛后碘伏消毒手術(shù)區(qū)皮膚，做平行于下頜骨下緣長約2.5 cm切口，切開皮膚及皮下組織，分離肌肉及骨膜，沿骨面剝離顯露下頜骨外側(cè)面。在前牙后方與第1磨牙前方交界處，以慢速裂鉆作垂直于下頜骨下緣的截骨線，將牽張器(浙江寧波慈北醫(yī)療器械有限公司)放置于骨面，方向與下頜骨下緣平行并固定;生理鹽水沖洗手術(shù)野，充分止血后分層嚴(yán)密縫合切口。術(shù)后第6天開始牽張延長下頜骨，牽張速度為1 mm/d，2次/d，0.5 mm/次，牽張10 d后進(jìn)入固定期。

1.2.2新骨組織標(biāo)本的獲取對照組隔日皮下注射生理鹽水1 mL。實(shí)驗(yàn)A、B、C及D組分別按兔體質(zhì)量隔日皮下注射10、20、30及40 μg/kg的rhPTH。rhPTH購自上海近岸生物科技公司。各組實(shí)驗(yàn)動物在固定期第1天、第7天和第14天時(shí)麻醉后分別處死3只，完整取出牽張側(cè)下頜骨，以4%多聚甲醛固定。

1.2.3骨密度測定骨密度(Bone mineral Density，BMD)測定采用美國GE公司生產(chǎn)的LUNAR DPX雙能X線骨密度測定儀(工作電壓87 kV，工作電流0.8～2.5 mA;筆束式掃描，束點(diǎn)大小1.2 mm×1.2 mm)。測定BMD部位為兩側(cè)骨斷端之間新骨區(qū)域，以數(shù)字式放射吸收測量法測定新骨區(qū)域的骨密度。

1.2.4新骨的組織形態(tài)學(xué)觀察及計(jì)量學(xué)分析新骨組織形態(tài)學(xué)觀察:截取缺損區(qū)的新骨標(biāo)本，EDTA脫鈣液脫鈣2周，系列酒精脫水，二甲苯透明、石蠟包埋，橫斷面切片，片厚5 μm;常規(guī)HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察牽張區(qū)新骨組織形態(tài)學(xué)變化。新骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)分析:采集HE切片圖象并輸入圖像處理分析系統(tǒng)(HMIAS-2000W High definition color graphic analysis management system of medicine，Wuhan Champion Image Technology Company，China)，每例HE切片隨機(jī)選取5個(gè)視場，在200倍光學(xué)顯微鏡下，自動計(jì)數(shù)成骨細(xì)胞數(shù)量;在100倍光學(xué)顯微鏡下，用自動測量法測量骨小梁面積。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2　結(jié)果

2.1 BMD

各組實(shí)驗(yàn)動物下頜骨均成功延長10 mm，牽張間隙內(nèi)均可見新骨組織生成(圖1)。在固定期第1天、第7天和第14天時(shí)，各實(shí)驗(yàn)組平均BMD均高于對照組，實(shí)驗(yàn)組和對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05) ;隨固定期延長，各組牽張區(qū)新骨BMD逐漸升高。在各固定期C組骨密度最高，與B組、A組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，但C組和D組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表1。

圖1　牽張延長后兔下頜骨Fig.1　Gross view of rabbit mandible after distraction osteogenesis

2.2新骨組織形態(tài)學(xué)觀察

固定期第1天，對照組牽張間隙內(nèi)主要以大量的纖維結(jié)締組織為主，可見稀疏的幼稚骨小梁生長，排列紊亂，連續(xù)性差，骨小梁周圍可見成骨細(xì)胞聚集;實(shí)驗(yàn)組牽張間隙內(nèi)基質(zhì)分泌旺盛，有連續(xù)性較好的骨小梁生長，排列方向規(guī)則并出現(xiàn)部分鈣化，密集程度高于對照組，并可見到成骨細(xì)胞在骨小梁周圍帶狀聚集。固定期第7天，各組新骨的骨小梁周圍都有明顯的成骨細(xì)胞帶狀聚集;對照組骨小梁方向規(guī)則，可見少量連續(xù)的新生骨小梁，但骨小梁間隙較大(圖2) ;各實(shí)驗(yàn)組新骨區(qū)有部分骨小梁連接融合，骨小梁更加成熟;實(shí)驗(yàn)C組和D組骨小梁的寬度較大，骨小梁相互連接融合形成大片的編織骨(圖2)。固定期第14天，各實(shí)驗(yàn)組可見大量密度均勻的島狀新生骨組織形成，骨小梁寬大，并相互連接融合，可見到明顯的血管生成;實(shí)驗(yàn)組和對照組成骨活躍，骨小梁邊緣均可見成骨細(xì)胞帶狀排列，但實(shí)驗(yàn)組新骨骨基質(zhì)的鈣化均勻程度和密集程度都明顯高于對照組。

表1　各組實(shí)驗(yàn)動物牽張區(qū)新骨平均BMD(g/cm2，±s) Tab.1　Measurements of the average BMD for new bone in the distraction area for each group

表1　各組實(shí)驗(yàn)動物牽張區(qū)新骨平均BMD(g/cm2，±s) Tab.1　Measurements of the average BMD for new bone in the distraction area for each group

(1)與對照組比較，P＜0.05;(2)與A組比較，P＜0.05;(3)與B組比較，P＜0.05

組別　　下頜骨牽張成骨模型固定期BMD 第1天　　第7天　　第14天對照組0.054±0.008　0.083±0.003　0.174±0.006 A組　0.112±0.003(1)　0.143±0.001(1)　0.202±0.010(1)B組　0.141±0.011(1) (2)　0.166±0.007(1) (2)　0.228±0.010(1) (2)C組　0.173±0.016(1) (2) (3)　0.198±0.018(1) (2) (3)　0.295±0.014(1) (2) (3)D組　0.163±0.008(1) (2) (3)　0.187±0.003(1) (2) (3)　0.275±0.008(1) (2) (3)

圖2　固定1周時(shí)新骨組織形態(tài)學(xué)結(jié)果Fig.2　Histomorphological results on day 7 of the consolidation period after the end of distraction

2.3新骨組織計(jì)量學(xué)結(jié)果

2.3.1骨小梁面積在固定期第1天、第7天和第14天時(shí)，各實(shí)驗(yàn)組平均骨小梁面積均大于對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05) ;隨固定期延長，各組新骨骨小梁面積逐漸增大，實(shí)驗(yàn)C組骨小梁面積最大，其次是D組，但這兩組骨小梁面積比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表2。

表2　各組實(shí)驗(yàn)動物牽張區(qū)新骨平均骨小梁面積(mm2，±s) Tab.2　Measurements of the average trabecular area for new bone in the distraction area for each group

表2　各組實(shí)驗(yàn)動物牽張區(qū)新骨平均骨小梁面積(mm2，±s) Tab.2　Measurements of the average trabecular area for new bone in the distraction area for each group

(1)與對照組比較，P＜0.05;(2)與A組比較，P＜0.05;(3)與B組比較，P＜0.05

組別　下頜骨牽張成骨模型固定期骨小梁面積第1天　　第7天　　第14天對照組0.968±0.012　1.308±0.012　1.515±0.041 A組　1.271±0.002(1)　1.634±0.005(1)　1.789±0.007(1)B組　1.508±0.009(1) (2)　1.636±0.007(1)　1.851±0.005(1) (2)C組　1.637±0.005(1) (2) (3)　1.820±0.006(1) (2) (3)　2.070±0.022(1) (2) (3)D組　1.621±0.005(1) (2) (3)　1.752±0.015(1) (2) (3)　2.051±0.088(1) (2) (3)

2.3.2成骨細(xì)胞數(shù)計(jì)數(shù)在固定期第1天、第7天和第14天時(shí)，各實(shí)驗(yàn)組平均成骨細(xì)胞數(shù)均高于對照組，與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。牽張第1天時(shí)，C組成骨細(xì)胞數(shù)量最高，其次為D組;隨固定期延長，各組成骨細(xì)胞數(shù)量逐漸減少。牽張第1天時(shí)，B組和A組成骨細(xì)胞數(shù)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05) ;固定期第7天時(shí)，B、C、D組成骨細(xì)胞數(shù)量較高，與A組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05) ;固定期第14天時(shí)，C組高于B組和D組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表3。

表3　各組實(shí)驗(yàn)動物牽張區(qū)新骨成骨細(xì)胞數(shù)計(jì)數(shù)結(jié)果(個(gè)，±s)Tab.3　Counts of osteoblasts in new bone in the distraction area for each group

表3　各組實(shí)驗(yàn)動物牽張區(qū)新骨成骨細(xì)胞數(shù)計(jì)數(shù)結(jié)果(個(gè)，±s)Tab.3　Counts of osteoblasts in new bone in the distraction area for each group

(1)與對照組比較，P＜0.05;(2)與A組比較，P＜0.05;(3)與B組比較，P＜0.05;(4)與C組比較，P＜0.05

組別　下頜骨牽張成骨模型固定期成骨細(xì)胞數(shù)第1天　　第7天　　第14天對照組59.2±3.7　55.2±3.1　 40.2±2.2 A組　72.6±3.4(1)　63.4±3.8(1)　47.4±6.4(1)B組　72.8±4.5(1)　65.8±4.1(1) (2)　49.6±2.7(1) (2)C組　77.2±3.6(1) (2) (3)　72.6±2.7(1) (2) (3)50.4±2.7(1) (2)D組　75.2±4.8(1) (2) (3) (4)72.4±5.3(1) (2) (3)49.6±3.0(1) (2)

3　討論

牽張成骨技術(shù)為頜面部發(fā)育不足和獲得性骨缺損畸形提供了一種有效增加骨量的技術(shù)手段，已被廣泛運(yùn)用于頜面外科整復(fù)領(lǐng)域。但牽張延長的新骨需要較長時(shí)間礦化改建才能行使生理功能，因而如何加速牽張區(qū)新骨的形成，縮短治療時(shí)間一直是研究熱點(diǎn)問題。PTH是甲狀旁腺主細(xì)胞分泌的多肽，是調(diào)節(jié)人體鈣磷內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要激素，對調(diào)節(jié)骨代謝具有雙重效應(yīng)。rhPTH商品名為特立帕肽，已應(yīng)用于治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者及促進(jìn)骨折愈合［1－3］。研究發(fā)現(xiàn)PTH影響骨骼代謝主要依賴于PTH給予劑量和方式，持續(xù)高劑量的給予PTH能增加骨吸收，而間斷性小劑量應(yīng)用PTH具有成骨效能［4－8］。既往研究顯示［9－13］，在牽張成骨期間，間隙性皮下注射PTH可使?fàn)繌垍^(qū)新骨骨密度和骨礦化濃度增加，骨小梁數(shù)量明顯增多，提高新骨礦化成熟速度和生物力學(xué)性能。在顱頜面骨研究方面發(fā)現(xiàn)，間斷性應(yīng)用PTH可促進(jìn)顱骨、下頜骨骨礦化沉積、牙槽嵴骨形成和下頜骨骨折愈合［8，14－17］。本研究通過建立兔下頜骨牽張成骨實(shí)驗(yàn)動物模型，在牽張期間斷性皮下注射不同劑量PTH，應(yīng)用骨密度測定和形態(tài)計(jì)量學(xué)觀察分析PTH對牽張區(qū)新骨形成的影響，結(jié)果顯示應(yīng)用PTH后各實(shí)驗(yàn)組骨小梁的厚度、面積和骨密度均高于對照組，說明應(yīng)用PTH可加速下頜骨牽張區(qū)新骨的形成和礦化。

Seebach［13］等研究顯示，在大鼠股骨牽張延長期間，間斷性給予PTH 60 mg/kg可提高新骨機(jī)械強(qiáng)度和生物力學(xué)性能。Aleksyniene等［9－11］的研究顯示25 μg/(kg·d)和5 μg/(kg·d)兩種劑量PTH均可提高兔脛骨牽張區(qū)新骨礦化程度，但同時(shí)發(fā)現(xiàn)25 μg(kg·d)皮下注射對新骨的礦化程度更有效。Ali等［12］通過建立大鼠下頜牽張成骨模型，每周3次皮下注射PTH 60 μg/kg，作牽張區(qū)新骨Micro CT檢測，結(jié)果顯示應(yīng)用PTH組牽張區(qū)新骨平均骨容量大于對照組。有研究顯示絕經(jīng)后骨折患者分別注射特立帕肽40 μg/d和20 μg/d，兩組在縮短骨折愈合時(shí)間上無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但注射20 μg/d特立帕肽縮短骨折愈合時(shí)間明顯優(yōu)于對照組。本研究將rhPTH給予劑量分為4組，各實(shí)驗(yàn)組固定期第1、7、14天時(shí)新骨平均骨密度高于對照組。給予rhPTH的實(shí)驗(yàn)組動物牽張區(qū)骨性骨痂與骨樣組織的礦化出現(xiàn)時(shí)間早于對照組，同時(shí)各個(gè)時(shí)期骨小梁面積和新骨成熟程度均優(yōu)于對照組。而在30 μg /kg組中骨密度在各時(shí)間段最高，骨鈣沉積作用更快速，說明隔日皮下注射PTH 30 μg /kg促進(jìn)兔下頜骨牽張成骨效應(yīng)更好。

骨合成代謝依賴成骨細(xì)胞的參與，新骨生成速度與成骨細(xì)胞的功能活性狀態(tài)密切相關(guān)。外源性小劑量PTH間斷給予后，可能通過刺激骨髓微環(huán)境中成骨活性基因表達(dá)，增加成骨細(xì)胞數(shù)量，延緩成骨細(xì)胞凋亡而延長其壽命，從而促進(jìn)骨合成代謝［18－19］。唐正龍等［20］在應(yīng)用PTH促進(jìn)下頜骨缺損修復(fù)的研究中發(fā)現(xiàn)，PTH可通過增加成骨細(xì)胞數(shù)量并加速骨轉(zhuǎn)換代謝而發(fā)揮促進(jìn)頜骨缺損修復(fù)。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)在固定期第1、7、14天時(shí)各實(shí)驗(yàn)組成骨細(xì)胞數(shù)高于對照組，提示間斷性低劑量應(yīng)用rhPTH可促進(jìn)成頜骨牽張成骨過程中成骨細(xì)胞的分化，推測PTH對頜骨牽張成骨的促進(jìn)作用是通過有效增加新骨區(qū)成骨細(xì)胞數(shù)并促進(jìn)其礦化過程而實(shí)現(xiàn)的。

綜上，外源性應(yīng)用rhPTH可能通過某種信號途徑刺激成骨細(xì)胞活性，增加成骨細(xì)胞的數(shù)量，同時(shí)促進(jìn)新骨骨小梁的形成和鈣化，從而加速新骨形成質(zhì)量。本研究觀察時(shí)間在骨生長活動最活躍的牽張結(jié)束到固定期2周內(nèi)，研究結(jié)果僅反映了PTH促進(jìn)下頜骨牽張成骨的早期調(diào)控階段。同時(shí)由于劑量分組較少，且觀察時(shí)間較短，尚不能得出加速下頜骨牽張成骨的最適宜PTH給予劑量。

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(2015－12－09收稿，2016－01－30修回)

中文編輯:吳昌學(xué);英文編輯:劉華

The Influence of Different Doses of Parathyroid Hormone on Differences of New Bone Formation During Mandibular Distraction Osteogenesis

BAI Shuo1，2，WANG Dongxiang1，ZHU Pengna1，TANG Zhenglong1
(1.Department of Oral＆Maxillofacial Surgery，the Affiliated Hospital of Guizhou Medical University，Guiyang 550004，Guizhou，China; 2.Stomatological Hospital，Hangzhou 310000，Zhejiang，China)

［Abstract］Objective: To investigate the effects of parathyroid hormone (PTH) on new bone formation during mandibular distraction osteogenesis (DO).Methods: Forty-five Japnese rabbits were divided into control group，receiving a subcutaneous injection of 1 ml of saline every other day and experimental groups A，B，C and D，receiving subcutaneous injections of 10，20，30 and 40 μg/kg of rhPTH，respectively，every other day.On the 1(st)，7(th)，14(th)day of the consolidation period after the mandibular distraction had been completed，new bone in the distraction region was examined through histomorphometric investigation and bone mineral density (BMD) was detected.Results: On the 1(st)，7(th)，14(th)day of the fixation period，number of osteoblasts，trabecular bone area and BMD were significantly greater in each experimental group than their counterparts in control group (P＜0.05).On 1st day of the consolidation period，the average gnumber of osteoblasts and BMD in group C were highest.With the fixation period to extend，in each experimental group，BMD of new bone and trabecular bone area increased gradually while number of osteoblasts decreased.Conclusions: Intermittent subcutaneous injections of rhPTH can promote new bone formation during mandibular DO.Different doses of rhPTH can promote mandibular DO and there may exist differences in dose effect.

［Key words］recombinant human parathyroid hormone; distraction osteogenesis; mandible; bone mineral density; osteoblast

*［基金項(xiàng)目］國家自然科學(xué)基金(No: 81160130)

［中圖分類號］R782.05

［文獻(xiàn)標(biāo)識碼］A

［文章編號］1000-2707(2016) 02-0145-05