王晉蜀，王偉佳，王 婷，張 彥△

(1.重慶醫(yī)科大學檢驗醫(yī)學院/臨床檢驗診斷學教育部重點實驗室，重慶 400016；

2.中山市人民醫(yī)院檢驗醫(yī)學中心，廣東中山 528403)

·論 著·

ICAT干擾慢病毒表達載體構建及穩(wěn)轉HL60細胞株的建立*

王晉蜀1，王偉佳2，王 婷1，張 彥1△

(1.重慶醫(yī)科大學檢驗醫(yī)學院/臨床檢驗診斷學教育部重點實驗室，重慶 400016；

2.中山市人民醫(yī)院檢驗醫(yī)學中心，廣東中山 528403)

目的 構建ICAT基因的干擾慢病毒表達載體，建立穩(wěn)定轉染的HL60細胞系。方法 人工設計、合成針對ICAT基因干擾序列，退火后連接到PGLV3干擾載體上，與PG-p1-VSVG、PG-p1-REV、PG-p1-RRE共轉染293T細胞，包裝產(chǎn)生慢病毒顆粒并測定病毒滴度，感染HL60細胞，建立穩(wěn)定細胞株；應用RT-PCR和Western Blot技術檢測HL60穩(wěn)定細胞中ICAT基因和蛋白表達情況，并與對照組進行比較。結果 成功構建了針對ICAT基因的RNAi慢病毒表達載體，病毒滴度為2×108TU/mL；建立穩(wěn)定轉染的HL60細胞株。有效干擾驗證顯示,shICAT能明顯降低ICAT的mRNA及蛋白水平 (P<0．001)。結論 成功構建ICAT基因的shRNA慢病毒表達載體，建立穩(wěn)定干擾ICAT表達的HL60細胞株。

ICAT基因； RNA干擾； HL60細胞

Wnt信號傳導途徑的調(diào)控失常是導致多種類型細胞發(fā)生癌變的主要原因之一，該途徑成員之一beta-連環(huán)蛋白和T細胞因子4激活可發(fā)生癌變，而另一成員beta-連環(huán)蛋白和T細胞因子4抑制子(inhibitor of beta-catenin and TCF-4，ICAT)通過抑制beta-連環(huán)蛋白和T細胞因子4復合物的形成而對Wnt 信號傳導途徑進行負調(diào)控來發(fā)揮抑癌作用。

本研究構建針對ICAT基因的shRNA慢病毒干擾表達載體，感染HL60細胞，建立穩(wěn)定干擾ICAT的細胞株，為進一步ICAT在白血病中的功能研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑 人早幼粒細胞白血病細胞系HL60細胞購自中國科學院上海生命科學研究所細胞庫；293T細胞為本實驗室凍存；細胞培養(yǎng)采用IMDM、DMEM(Hyclone USA)和胎牛血清(Gibco USA)；慢病毒載體系統(tǒng)：PGLV3、PG-p1-VSVG、PG-p1-REV、PG-p1-RRE為重慶威斯騰生物構建制備；DNA內(nèi)切酶(BamHI、EcoRI)、DNA連接酶、DNA marker購至MBI Fermentas；RT-PCR試劑盒購至大連寶生物有限公司(Takara,Japan)；兔抗人的ICAT抗體購自Abcam公司；cyclinD1、c-myc、TCF1抗體購于Santa Cruz公司；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗、山羊抗鼠二抗、鼠抗人β-actin單抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 ICAT siRNA靶序列的設計 針對 NCBI 上已經(jīng)提交的ICAT基因序列并進行分析，遵循siRNA的設計原則，尋找合適的干擾靶點，將DNA oligo分別用TE(pH8.0)溶解，濃度為100 μmol/L。取相應的正義鏈和反義鏈oligo溶液。在PCR儀上按照如下程序進行退火處理：95 ℃ 5 min;85 ℃ 5 min;75 ℃ 5 min;70 ℃ 5 min;4 ℃保存。退火處理后得到濃度為10 μM的shRNA模板。將所得模板溶液稀釋50倍，終濃度為200 nM，用于連接反應。

1.3 ICAT shRNA 和對照shNC 序列 ICAT shRNA 序列為5′-GCA GGT GTT CTG CTG ATA TCA-3′，正義鏈：5′-GAT CCG CAG GTG TTC TGC TGA TAT CAT TCA AGA GTG ATA TCA GCA GAA CAC CTG CTT TTT TG- 3′，反義鏈5′-AAT TCA AAA AAG CAG GTG TTC TGC TGA TAT CAT CTC TTG AAT GAT ATC AGC AGA ACA CCT GCG-3′，對照shNC:靶序列為：5′-TTC TCC GAA CGT GCA CGT- 3′，正義鏈：5′-GAT CCG TTC TCC GAA CGT GTC ACG TTT CAA GAG AAC GTG ACA CGT TCG GAG AAC TTT TTT G- 3′，反義鏈5′-AAT TCA AAA AAG TTC TCC GAA CGT GCA CGT TCT CTT GAA ACG TGA CAC GTT CGG AGA ACG-3′。

1.4 載體構建 慢病毒載體PGLV3經(jīng)EcoRi和BamHi對目的基因片段進行酶切及片段回收，用T4DNA ligase連接雙酶切得到的基因片段和線性化載體，22 ℃連接2 h，22 ℃ 1 h轉化感受態(tài)細胞。將抽提好的質(zhì)粒進行單酶切電泳鑒定，對陽性克隆進行測序做最后確認。

1.5 病毒包裝及細胞感染 慢病毒包裝細胞用蛋白酶消化對數(shù)生長期的293T細胞，重新接種于10 cm細胞培養(yǎng)皿，并在10 cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)至80%～90%融合時胰酶消化，加入2 mL含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液，吹打使細胞形成單細胞懸液培養(yǎng)過夜。在一支無菌的5 mL離心管中加入1.5 mL無血清DMEM，按此比例加入含目的序列的穿梭質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒(PG-p1-VSVG、PG-p1-REV、PG-p1-RRE)，混勻，取另一只無菌的15 mL離心管，加入1.5 mL無血清DMEM，再加入300 μL RNAi-Mate，混勻，室溫放置5 min后將2管混合，室溫放置25 min后除去培養(yǎng)液，再加入8 mL無血清的DMEM 培養(yǎng)液。將轉染混合物逐滴加入15 cm 培養(yǎng)皿中，并在培養(yǎng)箱中溫育4～6 h后吸棄轉染液，加入10 mL含10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)液，再繼續(xù)培養(yǎng)72 h。將培養(yǎng)皿中細胞上清液吸到15 mL離心管中，低速離心后，將離心管上清液用0.45 μm過濾器過濾。隨后采用10%FBS的DMEM培養(yǎng)液系列稀釋慢病毒原液，感染293T細胞測定病毒滴度。

1.6 感染HL60細胞并篩選穩(wěn)轉細胞株 接種狀態(tài)良好的HL60細胞到6孔板，每孔(2～4)×105個細胞，每孔加入polybrene多聚賴氨酸使終濃度為6 μg/mL，30 min后加入(4～6)×106/單位病毒；12 h后換液，培養(yǎng)96 h后在熒光觀察，然后收集細胞懸液，調(diào)整細胞密度至(5～8)×106個/mL過濾細胞：將染色后的細胞懸液于300目無菌的濾網(wǎng)過濾，收集濾液，移入流式管，避光放置冰上送檢。

1.7 ICAT干擾效果的RT-PCR和Western Blot的鑒定 RT-PCR：收集shNC對照組和shICAT組細胞，按照Invitrogen公司TRIzol產(chǎn)品說明書提取細胞總RNA。瓊脂糖凝膠電泳確定RNA完整性，紫外分光光度計檢測RNA的濃度和純度(OD260/OD280:1.8～2.0)；ICAT引物序列 5′-ATG AAC CGC GAG GGA GCA CC-3′，5′-CTA CTG CCT CCG GTC TTC CG-3′，250 bp；β-actin引物序列5′-CAC CAC ACC TTC TAC AAT GAG C-3′,5′-GTG ATC TCC TTC TGC ATC CTG T-3′，700 bp；逆轉錄后經(jīng)過95 ℃ 5 min 預變性，循環(huán)內(nèi)95 ℃ 30 s 變性，56 ℃退火30 s，32個循環(huán)擴增。產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，在BIO-RAD凝膠成像儀上觀察并采用Quantity One 4.6.2 軟件對 PCR 電泳結果進行灰度值分析，分析基因表達水平。Western Blot：同樣的收集shNC對照組和shICAT組細胞用細胞裂解液進行裂解，提取總蛋白，用Bradford法進行蛋白定量。取100 μg蛋白進行15%SDS-PAGE凝膠電泳，蛋白分離后，濕轉至聚偏二氟乙烯膜，用含 5% 小牛血清的封閉液封閉 2 h，加入一抗ICAT，稀釋比例為1∶5 000；4 ℃過夜；洗膜，加入二抗，稀釋比例為1∶5 000，37 ℃ 反應 1 h；洗膜，按照電化學發(fā)光試劑盒說明進行顯影。采用Quantity One 4.6.2 軟件對各組電泳條帶進行灰度值分析。以目的蛋白與內(nèi)參條帶灰度值的比值反映各關鍵分子的蛋白相對表達水平。

1.8 統(tǒng)計學處理 結果通過統(tǒng)計軟件SPSS11.5分析。均值間比較使用t檢驗分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。結果中的PCR和蛋白印跡灰度比為目的基因灰度值與各自內(nèi)參灰度值之比。

2 結 果

2.1 ICAT shRNA 重組載體的酶切 LV3載體經(jīng)BamHI、EcoRi酶酶切后電泳圖(圖1A)，用BamHI和EcoRI對目的基因片段進行酶切，酶切完成后，進行目的片段回收；將酶切后的目的基因片段與線性化的載體進行連接后，PCR初步鑒定(圖1B)；將重組質(zhì)粒進行單酶切鑒定，在目的條帶大小對應區(qū)域有酶切得到的條帶對應的克隆即為陽性克隆(圖1C)。

A：L3載體酶切；B：重組載體質(zhì)粒圖；C：重組載體的酶切鑒定圖；D：Maker Lambda DNA/Eco130I。

圖1 限制酶切分析結果

2.2 ICAT shRNA 重組載體的測序 通過上述的酶切結果表明，被EcoRI切開的可能是陽性克隆，將克隆進行測序鑒定，測序結果見圖2,結果顯示，序列正確。

A:shICAT重組載體的測序結果；B：shNC重組載體的測序結果。

圖2 重組載體的測序

2.3 慢病毒包裝和感染HL60細胞 制備編碼慢病毒顆粒的重組病毒質(zhì)粒及其3種輔助包裝原件載體質(zhì)粒，3種質(zhì)粒載體分別進行高純度無內(nèi)毒素抽提，用轉染試劑RNAi-Mate 進行共轉染293T 細胞包裝慢病毒，包裝成功后感染HL60細胞，見圖3。

2.4 ICAT shRNA穩(wěn)定HL60細胞株干擾效果鑒定 Real-time PCR 檢測結果顯示，干擾組ICAT mRNA 的表達量(0.36±0.02)較對照組(1.57±0.11)明顯下調(diào)(P<0.001,圖4A、B)。Western Blot 結果顯示，干擾組ICAT的蛋白表達(0.56±0.06)較對照組(1.44±0.045)明顯下調(diào)(P<0.001,圖4C、D),這說明所構建的慢病毒介導的ICAT shRNA能明顯抑制ICAT基因水平和蛋白水平的表達。

A、B：白光下觀察shNC組和shICAT組HL60細胞；C、D：熒光顯微鏡下的shNC組和shICAT組HL60細胞(20×)。

圖3 轉染細胞的熒光圖片

A、B：RT-PCR檢測穩(wěn)轉 HL60細胞中ICAT基因的表達；C、D：Western Blot 檢測穩(wěn)轉HL60細胞中ICAT蛋白的表達(**P<0.001)。

圖4 穩(wěn)定細胞株干擾效果驗證

3 討 論

ICAT是Tago 等[1]用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選鼠胚胎cDNA文庫時發(fā)現(xiàn)的一個蛋白質(zhì)基因，基因定位于染色體1P36.1-1P36.2D1S214H～D1S244之間。在鼠胚胎發(fā)育過程中，ICAT的mRNA表達相當恒定。ICAT是目前發(fā)現(xiàn)為數(shù)不多的能夠直接負向調(diào)節(jié)beta-連環(huán)蛋白的基因。其cDNA序列分析顯示，它編碼一個含81個氨基酸殘基，相對分子質(zhì)量為9×103的蛋白質(zhì)[1]。

ICAT的尾巴能與beta-連環(huán)蛋白結合并排斥后者與T細胞因子4結合，ICAT阻止beta-連環(huán)蛋白/T細胞因子4復合物形成的能力可能是它在細胞質(zhì)中的主要的功能，而它的三螺旋束為結合beta-連環(huán)蛋白的結構域[2-4]。

ICAT作為beta-連環(huán)蛋白/T細胞因子4抑制子，在腫瘤當中的作用也有大量的報道，它可以通過抑制經(jīng)典Wnt信號通路達到抑制腫瘤細胞的增殖[1]；目前有報道ICAT高表達會促進黑色素瘤的轉移和侵襲[5]，但也有報道表明通過高表達ICAT能抑制Wnt/β-catenin信號通路活性從而抑制子宮肌瘤細胞的增殖[6]、抑制膠質(zhì)母細胞瘤細胞的增殖與遷移等[7],ICAT與胰腺癌的發(fā)展也有密切聯(lián)系[8]。通過這些文獻報道可知ICAT在腫瘤細胞的發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用。

RNA干擾(RNA interference,RNAi)是正常生物體內(nèi)抑制特定基因表達的一種現(xiàn)象,是指在進化過程中高度保守的、由雙鏈RNA(double-stranded RNA,dsRNA)誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。這種現(xiàn)象發(fā)生在轉錄后水平,又稱為轉錄后基因沉默(post-transcriptional gene silencing,PTGS)。雙鏈RNA經(jīng)酶切后會形成很多小片段,稱為siRNA,這些小片段一旦與信使RNA(mRNA)中的同源序列互補結合,會導mRNA失去功能,即不能翻譯產(chǎn)生蛋白質(zhì),也就是使基因“沉默”[9-10]。

本研究成功構建了ICAT shRNA表達載體，通過構建慢病毒干擾體,感染HL60細胞，建立了穩(wěn)定細胞株。應用real-time PCR、Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)ICAT mRNA與蛋白水平表達均受抑制。為進一步研究ICAT基因對HL60 細胞功能的影響奠定基礎。

[1]Tago K,Nakamura T,Nishita M,et al.Inhibition of Wnt signaling by ICAT,a novel beta-catenin-interacting protein[J].Genes Dev,2000,14(14):1741-1749.

[2]Graham TA,Clements WK,Kimelman D,et al.The crystal structure of the beta-catenin/ICAT complex reveals the inhibitory mechanism of ICAT[J].Mol Cell,2002,10(5):563-571.

[3]Daniels DL,Weis WI.ICAT inhibits beta-catenin binding to Tcf/Lef-family transcription factors and the general coactivator p300 using independent structural modules[J].Mol Cell,2002,10(5):573-584.

[4]Choi HJ,Huber AH,Weis WI.Thermodynamics of beta-catenin-ligand interactions:the roles of the N-and C-terminal tails in modulating binding affinity[J].J Biol Chem,2006,281(9):1027-1038.

[5]Domingues MJ,Rambow F,Job B,et al.Beta-catenin inhibitor ICAT modulates the invasive motility of melanoma cells[J].Cancer Res,2014,74(7):1983-1995.

[6]Ono M,Yin P,Navarro A,et al.Inhibition of canonical WNT signaling attenuates human leiomyoma cell growth[J].Fertil Steril,2014,101(5):1441-1449.

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[8]Campos ML,Sánchez-Arévalo Lobo VJ,Rodolosse A,et al.ICAT is a novel Ptf1a interactor that regulates pancreatic acinar differentiation and displays altered expression in tumours[J].Biochem J，2013，451(3):395-405.

[9]de la Fuente J,Kocan KM.RNA interference for the study and genetic manipulation of ticks[J].Trends Parasitol，2007，23(9):427-433.

[10]Yang M,Mattes J.Discovery,biology and therapeutic potential of RNA interference,microRNA and antagomirs[J].Pharmacol Ther，2008，117(1):94-104.

Construction of ICAT interference lentivirus expression vector and establishment of stable HL60 cell lin*

WangJinshu1,WangWeijia2,WangTing1,ZhangYan1△

(1.KeyLaboratoryofLaboratoryMedicalDiagnosticsofMinistryofEducation,SchoolofLaboratoryMedicine,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China；2.LaboratoryMedicalCenterr,ZhongshanMunicipalPeople′sHospital,Zhongshan,Guangdong528403,China)

Objective To construct the ICAT gene interference lentivirus expression vector targeting and to establish stable transfected cell line HL60.Methods The interference sequence targeted at human ICAT gene was designed and synthesized,after annealing,which was connected to PGLV3 interference vector and with PG-p1-VSVG,PG-p1-REV,PG-p1-RRE were co-transfected into 293T cells The lentivirus particles were packaged and generated.The virus titer was detected.HL60 cells were transfected for establishing the stable cell line; RT-PCR and Western Blot techniques were used to detect ICAT gene and protein expression in stable HL60 cells,then the results were compared with those in the control group.Results The lentivirus expression vector targeted at ICAT was successfully constructed and the virus titer was 2×108U/mL.Stable transfected HL60 cell line was established.The effective interference verification revealed that shICAT could significantly reduce the mRNA and protein level of ICAT (P<0.001).Conclusion The shRNA lentiviral expression vector of ICAT gene is successfully constructed and the HL60 cell line stably interfering ICAT expression is established.

ICAT gene; RNA interference; HL60 cell

國家自然科學基金資助項目(81301492)。

2.中山市人民醫(yī)院檢驗醫(yī)學中心，廣東中山 528403)

王晉蜀，女，初級(師)，主要從事白血病藥物機制研究。

2.中山市人民醫(yī)院檢驗醫(yī)學中心，廣東中山 528403)

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，E-mail:zy2753@hotmail.com。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.07.004 文獻標識碼：A 文章編號：1673-4130(2016)07-0875-03

2015-11-15)