花俊麗， 楊 輝， 杜 丁， 馮麗琴

(陜西科技大學 食品與生物工程學院， 陜西 西安 710021)

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海紅果酒多糖的結構鑒定及降血糖活性驗證

花俊麗， 楊 輝， 杜 丁， 馮麗琴

(陜西科技大學 食品與生物工程學院， 陜西 西安 710021)

海紅果酒經(jīng)過濃縮、超濾、醇沉，離心得到海紅果酒粗多糖，依次用AB-8大孔樹脂吸附法、流水透析法和Sephadex-20葡聚糖凝膠層析法對粗多糖進一步純化得到精制多糖，并對其結構進行了初步研究，同時還驗證了海紅果酒多糖的降血糖活性.結果表明：海紅果酒多糖的相對分子質量為3.3×105Da，由鼠李糖、甘露糖、阿拉伯糖、葡萄糖及葡萄糖醛酸5種單糖組成；經(jīng)紅外檢測證實具有多糖的特征吸收峰；海紅果酒多糖具有一定的降血糖活性，且精制多糖的降血糖活性優(yōu)于粗多糖.

海紅果酒； 多糖； 分離純化； 結構分析 ；降血糖活性

0 引言

多糖，是一類由大量單糖通過有支鏈或無支鏈的糖苷鍵鏈接起來的碳水化合物[1]，具有貯存能量、結構支撐、抗氧化、抗炎，抗癌等生物效能[2].近年來，植物多糖的調節(jié)免疫功能、抗衰老、抗腫瘤、抗病毒、降血糖等功效也越來越受到人們的重視.

海紅果是我國稀有的果樹資源，果實成熟后為鮮紅色，肉脆多汁，酸甜爽口，營養(yǎng)豐富，含人體必需氨基酸和多種礦物質元素.中藥大辭典記載[3]：“海紅，為薔薇科蘋果屬西府海棠的果實；味酸、甘、平，無毒；功能主治：澀腸止痢，主治泄瀉，痢疾”.常食能健胃消食，去腥除膩，解除疲勞，軟化血管，醒腦提神，同時還具有通宣肺氣、止咳化痰、和胃健脾，美容養(yǎng)顏等功效[4].此外，海紅果是一種耐旱、抗寒、耐薄、病蟲少，管理簡便的高產(chǎn)水果，無論是在沙地、硬黃土、山坡，還是丘陵地帶，海紅果均能正常生長，所以在水土流失嚴重的貧困山區(qū)，僅靠天然降水，無需人工灌溉，海紅果也可以獲得高產(chǎn)，具有重要的生態(tài)和經(jīng)濟雙重效益[5,6].

目前，對海紅果的提取工藝[7-9]、化學成分[10,11]，以及藥用價值[12-14]的研究取得了一定的成果，但對于海紅果酒的研究報道卻僅限于釀造工藝[15,16].本研究對海紅果酒多糖的結構進行初步鑒定，并驗證了其降血糖功能，以期為海紅果酒的進一步研究提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實驗原料與儀器

1.1.1 主要原料

海紅果酒,陜西省府谷縣聚金邦農(nóng)產(chǎn)品開發(fā)有限公司;AB-8樹脂、Sephadex-2，Pharmacia公司；四氧嘧啶、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖醛酸，美國Sigma公司；鹽酸苯乙雙胍、 尿糖試紙，購于醫(yī)藥超市；三氯甲烷、正丁醇、無水乙醇、95%乙醇、丙酮、溴化鉀，均為分析純.

1.1.2 主要儀器

紫外分光光度計，尤尼柯(上海)儀器有限公司；高效凝膠滲透色譜儀，美國Agilent公司；Beckman P/ACETM MDQ高效毛細管電泳儀，美國Beckman公司；FT-IR8400傅里葉變換紅外光譜儀(配有DTGS/KBr檢測器)，德國Bruker公司；BS-300全自動生化分析儀，深圳邁瑞公司.

1.2 試驗動物

選擇4周齡昆明種雄性小鼠(由第四軍醫(yī)大學動物研究中心提供)作為試驗動物，體重25±2 g，在陜西中醫(yī)學院標準動物房飼養(yǎng)，飼以第四軍醫(yī)大學試驗動物中心提供的專用飼料.

1.3 實驗方法

1.3.1 海紅果酒多糖純品的制備

海紅果酒1 000 mL，經(jīng)旋轉蒸發(fā)濃縮至200 mL，采用超濾膜過濾除去蛋白質和核酸等生物大分子，采用透析袋透析48 h，濃縮，加入95%沉淀(乙醇濃度達到80%)，4 ℃靜置48 h，離心分離.離心所得沉淀依次用無水乙醇、丙酮和正丁醇分別洗滌3次，真空干燥至恒重，可得淺褐色多糖粗品.

將多糖粗品用去離子水重新溶解，過AB-8大孔樹脂層析柱(2.6 cm×45.7 cm)，蒸餾水洗脫，濃縮洗脫液，流水透析48 h，再經(jīng)過Sephadex-20葡聚糖凝膠柱(2.6 cm×45.7 cm)純化，蒸餾水洗脫，真空冷凍即得無味潔白的粉末狀海紅果酒多糖純品.

1.3.2 海紅果酒多糖的相對分子質量的測定

海紅果酒多糖的相對分子量采用高效凝膠滲透色譜儀法測定[17](HPGPC).HPGPC設備配有Agilent1100檢測系統(tǒng)和G4000SW的凝膠色譜柱(7.8 mm×300 mm).流動相用0.5%的NaNO3，流速為0.6 mL/min.

1.3.3 海紅果酒多糖的單糖組成

海紅果酒多糖的單糖組成采用高效毛細管電泳確定[18].

(1)單糖標準品的α-萘胺衍生化

衍生試劑的配制：稱取α-萘胺143.2 mg和NaBH3CN 35 mg，溶于450μL無水甲醇中，再加入41μL冰乙酸，置于冰箱中待用.

單糖的α-萘胺衍生：用超純水配成濃度為20 mg/mL的各種單糖標準溶液，各取200μL，加入40μL衍生試劑置于安瓿管中封管，80 ℃恒溫2 h衍生化.然后各加入三氯甲烷和重蒸水各1 mL，反復離心萃取3次，取上層水相過濾后，冷藏備用.

(2)海紅果酒多糖水解樣品的制備

取海紅果酒精制多糖20 mg，加入1 mol/L H2SO41 mg，封管100 ℃恒溫水解8 h，冷卻后用碳酸鋇完全中和，靜置過夜，過濾取200μL，依照單糖的衍生方法衍生化.

(3)單糖及海紅果酒多糖的測定

將衍生化的標準品及海紅果酒精制多糖試液經(jīng)孔徑0.45μm的微濾膜過濾后，進行毛細管電泳，根據(jù)各吸收峰的峰面積計算單糖組成的相對比例.

1.3.4 海紅果酒多糖的紫外光譜分析

稱取海紅果酒精制多糖1 mg，配制成0.1 mg/mL的溶液，以蒸餾水為對照，在190～700 nm范圍內進行紫外光譜掃描，觀察吸收峰.

1.3.5 海紅果酒多糖的紅外光譜分析

稱取海紅果酒精制多糖1 mg，與100 mg的KBr混勻研磨后壓片，采用紅外光譜儀掃描分析，波長范圍為4 000～400 cm-1，初步確定多糖的結構.

1.3.6 海紅果酒多糖降血糖活性的驗證[19]

(1)空白對照小組

將小鼠嚴格禁食24 h，用尿糖試紙測尿糖，取尿糖呈陰性的小鼠20只作為正常小鼠對照組.

(2)高血糖小鼠模型的建立

將小鼠嚴格禁食24 h，尾靜脈注射劑量為200 mg/kg mb的四氧嘧啶，72 h后，用尿糖試紙預測空腹尿糖，選取尿糖呈陽性+++的小鼠80只，隨機分為4組，分別為陽性對照組，西藥對照組、粗多糖對照組和純多糖對照組，斷尾取血用BS-300全自動生化分析儀測定血糖值.

(3)多糖降血糖試驗

正常小鼠組：以0.2 mL/10 g mb的生理鹽水灌胃；陽性對照組：以0.2 mL/10 g mb的生理鹽水灌胃；西藥對照組：以200 mg/kg mb的鹽酸苯乙雙胍水溶液灌胃；粗多糖對照組：以200 mg/kg mb的粗多糖水溶液灌胃；純多糖對照組：以200 mg/kg mb的精制多糖水溶液灌胃.持續(xù)給藥14 d，禁食12 h后，摘眼球取血，測血糖值.

2 結果與討論

2.1 海紅果酒多糖的相對分子質量的測定

從圖1所示，海紅果酒多糖在大約17 min時有一個吸收峰，表明海紅果酒多糖是一種均質的多糖.海紅果酒多糖的平均相對分子質量為3.3×105Da.

圖1 海紅果酒多糖的高效 凝膠滲透色譜圖

2.2 海紅果酒多糖的單糖組成分析

圖2(a)為鼠李糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖及葡萄糖醛酸標準品的高效毛細管電泳圖。從圖2(b)可看出，海紅果酒多糖由鼠李糖、甘露糖、阿拉伯糖、葡萄糖及葡萄糖醛酸5種單糖組成.其中以葡萄糖和葡萄糖醛酸的含量較多，甘露糖的含量較少.根據(jù)峰面積計算出海紅果酒多糖的組成比例為：Rha∶Man∶Glc∶Ara∶GluA=1.4∶1.0∶3.5∶2.2∶2.7.

(a)單糖標準品毛細管電泳圖

(b)海紅果酒多糖的毛細管電泳圖圖2 高效毛細管電泳圖譜

2.3 海紅果酒多糖的紫外光譜分析

由圖3可知，在200 nm處海紅果酒多糖有吸收峰，此處為多糖的特征吸收峰；在260～280 nm處沒有出現(xiàn)吸收峰，表明不含核酸和蛋白質生物大分子.

圖3 海紅果酒多糖的紫外光譜圖

2.4 海紅果酒多糖紅外光譜測定

如圖4所示，紅外光譜在3 410 cm-1處有吸收峰，說明有糖類存在的O-H伸縮振動；2 935 cm-1處的吸收峰表明，含有多糖類C-H2和C-H的非對稱伸縮振動；1 743 cm-1和1 610 cm-1兩處的吸收峰表明C=O和COO-[20]的非對稱伸縮振動； 1 743 cm-1、1 610 cm-1和1 428 cm-1處的三個吸收峰表明了MWPS含有糖醛酸；1 428 cm-1和1 240 cm-1處的吸收峰也表明海紅果酒多糖含有C-H鍵；此外，1 092 cm-1和1 022 cm-1處的吸收峰說明MWPS存在C-O-H鍵以及C-O-C糖苷鍵；400～905 cm-1處的吸收峰表明了海紅果酒多糖具有吡喃糖環(huán)的骨架結構[21]；而在890～900 cm-1處的吸收峰則表明MWPS具有β-D-吡喃糖苷鍵(C1-H)的構型.

圖4 海紅果酒多糖的紅外光譜圖

2.5 海紅果酒多糖的降血糖試驗驗證

注射四氧嘧啶成功建模的小鼠體重明顯降低，較正常組小鼠消瘦，且被毛雜亂，毛色暗淡，出現(xiàn)多飲、多食、多尿以及掉毛現(xiàn)象.在灌胃初期，各試驗小組的小鼠體重仍出現(xiàn)下降趨勢，從給藥第5天起，各試驗小組與陽性對照組相比，攝食量、飲水量明顯降低，小鼠的體重也趨于穩(wěn)定，試驗結束時，體重有所回升.其中純多糖對照組小鼠的平均體重高于粗多糖對照組，精神狀態(tài)也優(yōu)于粗多糖組.測得各組小鼠的血糖值、體重和飲食量的對照數(shù)據(jù)見表1所示.

表1 各試驗小組小鼠血糖值、體重和飲食量的對照

3 結論

海紅果酒經(jīng)濃縮、超濾、醇沉、AB-8大孔樹脂吸附、流水透析及葡聚糖凝膠純化可得到純度較高的多糖；經(jīng)過α-萘胺衍生化，利用高效毛細管電泳可測定海紅果多糖的單糖組分，此方法簡單易操作，且需要樣品量少；經(jīng)紫外光譜和FT-IR掃描，可初步斷定海紅果多糖具有典型的多糖特征；海紅果酒多糖可以明顯改善糖尿病小鼠多飲、多食，以及消瘦的癥狀，經(jīng)過灌胃海紅果多糖的糖尿病小鼠明顯比陽性對照組的小鼠精神活躍，且精制海紅果酒多糖的降血糖功能優(yōu)于粗多糖.

[1] Zong A,Cao H,Wang F.Anticancer polysaccharides from natural resources:A review of recent research[J].Carbohydrate Polymers,2012,90(4):1 395-1 410.

[2] Hu Dj,Cheong Kl,Zhao J,et al.Chromatography in characterization of polysaccharides from medicinal plants and fungi[J].Journal of Separation Science,2013,36(2):1-19.

[3] 南京中醫(yī)藥大學.中藥大辭典(下冊)[M].上海:上海科學技術出版社，2006.

[4] 趙 亮.海紅果的藥用價值初步研究[D].太原：山西醫(yī)科大學，2006.

[5] 趙 亮，李青山.海紅果[J].食品與藥品，2007，9(7)：71-72.

[6] 溫仲清，韓 燕.稀有地方果樹種質資源——海紅子[J].北方果樹，1992(2)：36-37.

[7] 徐玉霞，王華斌.酶法提取海紅果總黃酮工藝及海紅果黃酮粗提物對HeLa細胞的增殖作用[J].中國農(nóng)業(yè)大學學報，2013，18(1):119-127.

[8] 佟海龍. 海紅果皮中花青素提取工藝的研究[J].科技創(chuàng)新，2014，16(1)：3-4.

[9] 吳 敬，王麗英，包海泉，等.海紅果多糖的超聲提取工藝研究[J].內蒙古農(nóng)業(yè)大學學報，2013，34(3):141-145.

[10] 楊翠玲.海紅果化學成分的研究[D].太原：山西醫(yī)科大學，2007.

[11] 梁 杰，趙福詩，遇艷萍，等.速凍與緩凍貯藏對不同成熟度海紅果主要化學成分的影響[J].內蒙古農(nóng)業(yè)科技，2012(1)：44-46.

[12] 王 猛，王 敏，李環(huán)宇，等.海紅果酚類物質種類及其抗氧化能力的研究[J].現(xiàn)代食品科技，2013，29(11)：2 633-2 637.

[13] 郝志鵬，馬麗杰，吳 敬，等.海紅果多糖提取工藝及體外抗氧化活性研究[J].食品科學，2012,33(18)：88-92.

[14] 黃永清，馬麗杰，吳 敬.海紅果多糖對衰老模型小鼠腦細胞凋亡的影響[J].內蒙古醫(yī)科大學學報，2013，35(3):192-197.

[15] 李龍柱，張富新，賈潤芳，等.海紅果果酒發(fā)酵工藝研究[J].農(nóng)產(chǎn)品加工(學刊)，2013(1)：16-19.

[16] 楊 輝，黨翠紅.5°海紅果酒發(fā)酵工藝的優(yōu)化[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2014，40(11)：148-153.

[17] Hu H,Liang H,Wu Y.Isolation, purification and structural characterization of polysaccharide from Acanthopanax brachypus[J].Carbohydrate Polymers,2015，127(1):94-100.

[18] 馬海寧，華玉娟，屠春燕，等.毛細管電泳法分析藏紅花植物細胞多糖中的單糖組成[J].色譜，2013，30(3)：304-308.

[19] 花俊麗.桑葉DNJ和多糖的提取分離及活性研究[D].西安：陜西科技大學，2009.

[20] Gnanasambandam R.Protctor.Determinnation of pectin of esterification by diffuse reflectance fourier transform infrared spectroscopy[J].Food Chemistry,2000,68(3):327-332.

[21] Cai W,Xie L,Chen Y,et al.Purification, characterization and anticoagulant activity of the polysaccharides from green tea[J].Carbohydr Polymers,2013,92(2):1 086-1 090.

【責任編輯：蔣亞儒】

Structure and hypoglycemic activity characterization of polysaccharide from Malus micromalus Makino wine

HUA Jun-li, YANG Hui， DU Ding, FENG Li-qin

(School of Food and Biological Engineering, Shaanxi University of Science & Technology, Xi′an 710021, China)

A water-soluble polysaccharide from Malus micromalus Makino wine was obtained by successive purification using Macro porous resin AB-8 and Sephadex LH-20 gel-filtration chromatography.The structural characterization of the purified polysaccharide fraction was evaluated in this paper.The result showed that polysaccharide of Malus micromalus Makino wine was a homogeneous heteropolysaccharide including rhamnose, mannose,glucose,arabinose and glucuronic acid, with an average molecular weight of 3.3×105Da.Characterization of polysaccharide by FT-IR analysis showed the typical absorption of polysaccharide.And polysaccharide can significantly reduce blood glucose levels, and has potential use an anti-diabetic agent.

Malus micromalus Makino wine; polysaccharide; separation and purification; structural analysis; hypoglycemic activity

2016-03-16

陜西省科技廳科學技術研究發(fā)展計劃項目(2014SJ-06-02)

花俊麗(1979-)，女，陜西華陰人，在讀博士研究生，研究方向：生物大分子的分離提取

1000-5811(2016)05-0129-04

TS262.7

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