段哲萍，于新江，吳大勇，李菁菁，趙娟

(1河北省人民醫(yī)院，石家莊050051；2河北醫(yī)科大學)

鼠婦水提取物和乙酸乙酯提取物對骨橋蛋白誘導的血管平滑肌細胞增殖的影響及機制

段哲萍1，于新江1，吳大勇1，李菁菁2，趙娟2

(1河北省人民醫(yī)院，石家莊050051；2河北醫(yī)科大學)

目的 觀察鼠婦水提取物和乙酸乙酯提取物對骨橋蛋白(OPN)誘導的血管平滑肌細胞(VSMC)增殖的影響，探討其作用機制。方法 采用常規(guī)貼塊法分離培養(yǎng)SD大鼠VSMC，收集對數(shù)生長期的第3～5代細胞隨機分為14組，對照組常規(guī)培養(yǎng)，OPN組加入終濃度為20 mg/mL的OPN，鼠婦水提取物高、中、低劑量組分別加入終濃度為2、1、0.5 mg/mL的鼠婦水提取物，鼠婦乙酸乙酯提取物高、中、低劑量組分別加入終濃度為1、0.5、0.25 mg/mL的鼠婦乙酸乙酯提取物，OPN+鼠婦水提取物高、中、低劑量組分別加入終濃度為20 mg/mL的OPN及終濃度為2、1、0.5 mg/mL的鼠婦水提取物，OPN+鼠婦乙酸乙酯提取物高、中、低劑量組分別加入終濃度為20 mg/mL的OPN及終濃度為1、0.5、0.25 mg/mL的鼠婦乙酸乙酯提取物，各組均培養(yǎng)24 h；采用MTT法檢測細胞增殖情況(OD值)，采用Western boltting法檢測細胞FAK蛋白相對表達量。結果 OPN組OD值及FAK蛋白相對表達量均高于其他各組(P均<0.05)；OPN+各濃度鼠婦水提取物及OPN+各濃度鼠婦乙酸乙酯提取物組OD值及FAK蛋白相對表達量均低于OPN組(P均<0.05)，各濃度組間比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。結論 鼠婦水提取物和乙酸乙酯提取物對OPN誘導的VSMC增殖均具有抑制作用，抑制FAK胞內(nèi)信號傳導可能是二者共同的作用機制。

鼠婦水提取物；鼠婦乙酸乙酯提取物；骨橋蛋白；血管平滑肌細胞增殖；黏著斑激酶

血管平滑肌細胞(VSMC)向血管內(nèi)膜下遷移、增殖，同時釋放細胞外基質(ECM)是多種血管重塑性疾病，如動脈粥樣硬化、高血壓等的細胞病理學基礎。骨橋蛋白(OPN)可以誘導VSMC的增殖和遷移過程，黏著斑激酶(FAK)在這一過程中發(fā)揮重要作用[1]。鼠婦為無脊椎動物節(jié)肢動物門甲殼綱潮蟲亞目的俗稱，具有解毒、止痛、平喘、破血、利尿、通經(jīng)等作用[2～6]，但其對VSMC增殖的影響未見報道。2015年6～10月，本研究觀察了鼠婦水提取物和乙酸乙酯提取物對OPN誘導的VSMC增殖的影響，現(xiàn)分析結果并探討其作用機制。

1 材料、方法與結果

1.1 材料 雄性SD大鼠1只，體質量90～100 g，購自河北醫(yī)科大學實驗動物中心。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco公司；β-actin多抗、小鼠抗FAK單抗(sc-20019)和化學發(fā)光試劑盒購自Santa Cruz公司；重組鼠OPN購自Sigma公司；鼠婦水提取物及鼠婦乙酸乙酯提取物由河北中醫(yī)學院藥學院制備、鑒定并測定濃度。

1.2 VSMC分離及培養(yǎng) 采用常規(guī)貼塊法分離培養(yǎng)SD大鼠VSMC。SD大鼠腹腔注射25%烏來糖2 mL行全身麻醉，取主動脈弓至腹主動脈分叉處血管離斷，放入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，去除血管周圍脂肪及管腔內(nèi)殘留血液；清洗后的血管轉移到新的含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，縱向剪開血管，將血管壁剪成小于1.0 mm×1.0 mm的小片；將剪好的血管壁小片分成3份，分別貼于干凈的小培養(yǎng)瓶中，倒置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)2～3 h，使貼片穩(wěn)固貼于培養(yǎng)瓶；倒轉小培養(yǎng)瓶，使培養(yǎng)液充分浸潤貼壁的血管小片，定期在顯微鏡下觀察細胞生長狀況；2～3天更換培養(yǎng)液，5～7天將原代細胞經(jīng)胰酶消化后進行傳代。

1.3 鼠婦對VSMC增殖能力的影響 收集對數(shù)生長期的第3～5代VSMC，調整細胞懸液濃度為5×104/mL，包埋于96孔板，隨機分為14組，對照組細胞常規(guī)培養(yǎng)，OPN組細胞加入終濃度為20 mg/mL的OPN，鼠婦水提物高、中、低劑量組分別加入終濃度為2、1、0.5 mg/mL的鼠婦水提取物，鼠婦乙酸乙酯提取物高、中、低劑量組分別加入終濃度為1、0.5、0.25 mg/mL的鼠婦乙酸乙酯提取物，OPN+鼠婦水提取物高、中、低劑量組分別加入終濃度為20 mg/mL的OPN及終濃度為2、1、0.5 mg/mL的鼠婦水提取物，OPN+鼠婦乙酸乙酯提取物高、中、低劑量組分別加入終濃度為20 mg/mL的OPN及終濃度為1、0.5、0.25 mg/mL的鼠婦乙酸乙酯提取物；各組均于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h；采用MTT法檢測細胞增殖情況，步驟參照試劑盒說明書。將各孔細胞置于酶聯(lián)免疫檢測儀，檢測490 nm波長處各孔吸光度值(OD值)。結果顯示，OPN組OD值高于其他各組(P均<0.05)；各濃度鼠婦水提取物及鼠婦乙酸乙酯提取物組OD值與對照組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)；OPN+各濃度鼠婦水提取物及OPN+各濃度鼠婦乙酸乙酯提取物+OPN組OD值均高于對照組(P均<0.05)、均低于OPN組(P均<0.05)；其余組間比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。見表1。

1.4 鼠婦對VSMC FAK蛋白表達的影響 采用Western blotting法。采用RIPA裂解液提取1.3中對照組，OPN組，OPN+鼠婦水提取物高、中、低劑量組，OPN+鼠婦乙酸乙酯提取物高、中、低劑量組，培養(yǎng)24 h的細胞總蛋白，用BCA法測定各組蛋白濃度。每組取80 g蛋白進行SDS-PAGE電泳，PVDF轉膜，5%脫脂奶粉封閉，與特異性FAK一抗(1∶3 000)4 ℃孵育過夜，TTBS洗膜，加入辣根過氧化物酶標記的IgG(1∶5 000)室溫孵育 1 h，洗膜后采用ECL化學發(fā)光法行電泳蛋白條帶顯影，凝膠圖像分析系統(tǒng)記錄每組數(shù)據(jù)，測量各組條帶積分光密度值，與對應的β-actin積分光密度值進行比值，作為目的蛋白的相對表達量。結果顯示，OPN組FAK蛋白相對表達量均高于其他各組(P均<0.05)；OPN+各濃度鼠婦水提取物組及OPN+各濃度鼠婦乙酸乙酯提取物組FAK蛋白相對表達量均低于OPN組(P均<0.05)，各濃度組間比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。見表1。

表1 各組細胞增殖情況及FAK蛋白相對表達量比較±s)

注：與對照組比較，*P<0.05；與OPN組比較，△P<0.05。

2 討論

VSMC的黏附、增殖和遷移等過程均有ECM成分參與，如纖連蛋白(FN)、OPN和多種生長因子等。細胞生物學研究證實，細胞黏附、鋪展及遷移是一系列精確周密的周期性動態(tài)發(fā)展過程，受多種胞內(nèi)信號傳導系統(tǒng)的綜合調控，各條傳導通路之間相互作用、相互交叉。研究發(fā)現(xiàn)，ECM介導的整合素信號通路參與細胞的黏附、遷移過程[7]。整合素是一種跨膜受體，是由α和β兩個亞單位組成的異源二聚受體。VSMC表達整合素αvβ3，結合配體包括FN、OPN和玻連蛋白(VN)等。但是，整合素自身并不具有激酶活性，需經(jīng)由β亞單位胞內(nèi)區(qū)與FAK、整合素連接激酶(ILK)、talin及paxillin等相互作用后將其募集到胞膜內(nèi)側，共同組成黏著斑復合物，由此啟動多條信號轉導通路，引起VSMC的黏附和遷移，參與細胞骨架的重組，完成血管炎性增生和血管重塑等復雜過程[8,9]。

現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，鼠婦的主要藥理成分為蛋白質、糖原、還原糖、黏多糖等多種飽和及不飽和脂肪酸。動物研究發(fā)現(xiàn)，鼠婦可治療小鼠心律失常，對其具有鎮(zhèn)痛、抗炎等作用。臨床亦有用鼠婦治療慢性喘息性氣管炎、骨質增生、尋常疣、口腔炎、癌痛、手術后疼痛等報道[2～6]。目前中藥有效成分的提取方法主要包括蒸餾法、酶提取法、酸堿法等，提取時主要采用葡萄糖、乙醇、水、乙酸乙酯、氯仿等有機溶劑。但不同提取方法、不同提取溶劑、甚至不同濃度的同一種溶劑，提取回收率和有效成分含量存在極大差異[10,11]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，鼠婦水提取物及乙酸乙酯提取物對VSMC凋亡均無影響，本研究結果顯示二者單獨使用對VSMC增殖無明顯影響，說明這兩種鼠婦提取物對于正常生長的細胞是安全無害的；本研究亦發(fā)現(xiàn)，同時給予OPN和鼠婦水提取物或乙酸乙酯提取物，則這兩種提取物均可發(fā)揮抑制細胞增殖的作用。由于兩種方法所提取的有效成分不同，故乙酸乙酯提取物隨濃度增高表現(xiàn)出對OPN刺激VSMC增殖的抑制作用愈強，而鼠婦水提取物隨濃度增高表現(xiàn)為對OPN刺激VSMC增殖的抑制作用愈弱，但組間比較差異均無統(tǒng)計學意義。

FAK是一種非受體型酪氨酸激酶，是細胞內(nèi)諸多信號傳導途徑的匯合點，參與細胞的遷移、黏附、鋪展、增殖和凋亡等過程[12]。在與細胞增殖等密切相關的眾多疾病(如心血管病、纖維類疾病、惡性腫瘤等)的病理發(fā)展過程中，F(xiàn)AK發(fā)揮至關重要的分子生物學作用。在血管再狹窄類疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中，F(xiàn)AK的活化及表達均顯著增加，且FAK蛋白表達增加的程度與新生血管內(nèi)膜過度增生水平密切相關，提示FAK的活化和高表達促進VSMC增殖。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，OPN與位于VSMC表面的整合素相互作用，激活細胞內(nèi)的FAK信號分子，促進細胞增殖、遷移[13，14]。本研究結果顯示，OPN可促進VSMC中FAK蛋白表達，鼠婦乙酸乙酯提取物和水提取物均可抑制OPN的上述作用；提示兩種鼠婦提取物可能均通過抑制FAK胞內(nèi)信號傳導系統(tǒng)而抑制VSMC的增殖。

總之，鼠婦水提取物和乙酸乙酯提取物對OPN誘導的VSMC增殖均具有抑制作用，抑制FAK胞內(nèi)信號傳導可能是其共同作用機制。

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