蔡建星，軒慧勇，夏利寧

(新疆農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院，烏魯木齊 830052)

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不同部位分離的豬源葡萄球菌的耐藥情況分析

蔡建星，軒慧勇，夏利寧

(新疆農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院，烏魯木齊 830052)

摘要：【目的】調(diào)查新疆昌吉州的某規(guī)模化豬場,生豬不同部位(鼻腔和直腸)分離的葡萄球菌耐藥情況。【方法】采用微量肉湯稀釋法,對不同部位分離出的葡萄球菌,進行臨床9種常用抗菌藥物的藥敏試驗；對耐藥結(jié)果使用SPSS軟件進行卡方檢驗，比較不同部位分離出的葡萄球菌耐藥的差異性。【結(jié)果】鼻腔分離的葡萄球菌主要對氧氟沙星(89.5%)和克林霉素(89.0%)的耐藥率較高。直腸分離的葡萄球菌主要對克林霉素(84.5%)、氧氟沙星(81.0%)和阿米卡星(81.0%)耐藥率較高。通過卡方檢驗分析發(fā)現(xiàn)，直腸分離的葡萄球菌對阿米卡星和慶大霉素的耐藥率顯著高于鼻腔分離的葡萄球菌的耐藥率(P<0.05)。鼻腔分離的葡萄球菌僅對苯唑西林的耐藥率顯著高于直腸分離的葡萄球菌的耐藥率(P<0.05)。多藥耐藥差異性結(jié)果顯示：鼻腔分離的葡萄球菌以6耐(11.75%)和7耐(9.5%)為主，直腸分離的葡萄球菌以8耐(11.5%)為主。且在8耐和9耐中，直腸分離的葡萄球菌多藥耐藥率顯著高于鼻腔分離的葡萄球菌多藥耐藥率(P<0.05)?！窘Y(jié)論】直腸分離的葡萄球菌對大部分被檢抗菌藥物的耐藥率比鼻腔分離的葡萄球菌耐藥率更高，直腸分離的葡萄球菌耐藥率比鼻腔分離的葡萄球菌多藥耐藥情況更加嚴重。抗菌藥物在呼吸道和腸道兩種不同感染途徑中，腸道耐藥率更加嚴重，在臨床用藥方面，可結(jié)合感染部位的不同，科學的更換抗菌藥物。

關(guān)鍵詞：豬；不同部位；葡萄球菌；抗菌藥物；耐藥率

0引 言

【研究意義】葡萄球菌廣泛存在于自然環(huán)境中。健康動物的皮膚、腸道等都有葡萄球菌存在，同時是環(huán)境中的常在微生物。豬葡萄球菌病是造成規(guī)?；B(yǎng)豬場仔豬經(jīng)濟損失的主要疾病之一[1]。由于葡萄球菌種類較多，對其所引起的疾病多采用抗菌藥物；加之葡萄球菌是革蘭氏陽性菌中最易產(chǎn)生耐藥性的細菌，導致耐藥葡萄球菌越來越普遍[2]，不但削弱臨床療效，造成大量藥物殘留和毒副作用，而且耐藥細菌有在動物和人之間傳播的風險，對人類健康造成潛在威脅，已引起全球關(guān)注[3]。【前人研究進展】目前，國內(nèi)很多省市如河南[4]、廣州[5]、青島[6]、寧夏[7]、廣東[8]等地對不同來源葡萄球菌的耐藥情況進行調(diào)查，結(jié)果顯示不同地區(qū)不同來源葡萄球菌菌對抗菌藥物的耐藥情況不同，且多數(shù)研究表明葡萄球菌的耐藥率呈現(xiàn)較高的趨勢?！颈狙芯壳腥朦c】盡管耐藥性研究很多，但鮮見對不同部位分離的葡萄球菌耐藥情況研究的相關(guān)報道，耐藥情況不明，是否存在呼吸道與腸道相互交叉感染，導致耐藥率升高，尚不清楚。試驗以新疆昌吉州的某規(guī)模化豬場生豬不同部位分離的葡萄球菌為研究對象，對其進行臨床常用抗菌藥物的藥敏試驗?！緮M解決的關(guān)鍵問題】了解同一豬場不同部位分離的葡萄球菌耐藥差異性比較，獲取耐藥譜，與其他地區(qū)葡萄球菌耐藥情況做比較，并指導臨床合理用藥。

1 材料與方法

1.1材 料

1.1.1葡萄球菌

試驗于2014年7月在新疆昌吉州某規(guī)?；B(yǎng)豬場進行葡萄球菌樣品采集。主要是采集同一頭豬的直腸肛拭子樣和鼻腔鼻拭子樣(一豬兩樣)各200份。標準質(zhì)控菌(ATCC29213)購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.1.2培養(yǎng)基

Mueller-Hinton(MH)培養(yǎng)基、BP(Baird-Parker)瓊脂基礎、亞硫酸鉍卵黃增菌液和普通肉湯均購自北京奧博星生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 試驗藥品

β-內(nèi)酰胺類：阿莫西林(Amoxicillin)(MOX，含量86.6%)/克拉維酸(Clavulanic Acid)(A/C，含量100%)、苯唑西林(Benzene)(OX，含量99.5%)；氨基糖苷類：慶大霉素(Gentamicin)(GEN，含量99.5%)、阿米卡星(Amikacin)(AMK，含量65.5%)；喹諾酮類：氧氟沙星(Levofloxacin)(DF，含量99%)；酰胺醇類：氟苯尼考(Florfenicol)(FFC，含量98%)；四環(huán)素類：四環(huán)素(Tetracycline)(TE，含量95%)；林可胺類：克林霉素(Clindamycin)(CM，含量80%)；福霉素類：利福平(Rifampicin)(RP，含量98.7%)。上述藥品均購自中國獸藥監(jiān)察所。

1.2方 法

1.2.1葡萄球菌的分離鑒定

將采集的樣品置于滅菌的7.5%氯化鈉營養(yǎng)肉湯中，37℃培養(yǎng)18～24 h，初步篩選葡萄球菌。然后用接種環(huán)挑取菌液劃線轉(zhuǎn)接種在BP瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)24～48 h，葡萄球菌在BP瓊脂平板上呈圓形，表面光滑、凸起、濕潤的菌落，顏色呈灰色至黑色，挑取可疑單個菌落保存。最后將可疑單個菌落進行革蘭氏染色，鏡檢革蘭氏陽性染色為紫色，呈葡萄串狀排列，無芽胞，無莢膜，即為葡萄球菌。將確定為葡萄球菌的菌株保菌，以備后期實驗用。

1.2.2藥物敏感性試驗

按美國臨床實驗室標準委員會(clinical and laboratory standards institute，CLSI)推薦的微量肉湯稀釋法進行，對分離的400株葡萄球菌進行上述9種抗菌藥物最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)值測定，結(jié)果判定參照CLSI(2012，2013)[9,10]標準。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計

耐藥結(jié)果差異統(tǒng)計采用SPSS20軟件進行卡方檢驗。

2結(jié)果與分析

2.1不同部位葡萄球菌的分離鑒定結(jié)果

葡萄球菌是自然界中廣泛存在的革蘭氏陽性菌。鼻腔和直腸采集的樣品中葡萄球菌的分離率均為100%。表1

表1豬源葡萄球菌分離結(jié)果Table 1The isolates results of swineStaphylociccus

采集部位Samplesite采樣數(shù)Numberofsamples分離率(分離數(shù)/采樣數(shù))Separationrate(thenumberofisolates/samples)鼻腔樣Nasalswab(N)200100%(200/200)直腸樣Analswab(A)200100%(200/200)

2.2 不同部位分離的葡萄球菌對9種抗菌藥物的耐藥差異性比較

研究表明，鼻腔分離的葡萄球菌主要對氧氟沙星(89.5%)和克林霉素(89.0%)的耐藥率較高，而對慶大霉素(18.5%)耐藥率較低；直腸分離的葡萄球菌對克林霉素(84.5%)、阿米卡星(81.0%)和氧氟沙星(81.0%)的耐藥率較高，對慶大霉素(36.0%)耐藥率較低。對苯唑西林和利福平鼻腔分離的葡萄球菌的耐藥率顯著高于直腸分離的葡萄球菌的耐藥率(P<0.05)；對阿米卡星、慶大霉素和利福平直腸分離的葡萄球菌的耐藥率顯著高于鼻腔分離的葡萄球菌的耐藥率(P<0.05)。然而，對于四環(huán)素、氟苯尼考、阿莫西林/克拉維酸和克林霉素不存在顯著變化(P>0.05)。除了對克林霉素和氧氟沙星外，直腸分離的葡萄球菌的耐藥率高于鼻腔分離的葡萄球菌耐藥率，耐藥情況更加嚴重。表2

表2不同部位分離的葡萄球菌對被檢藥物的耐藥率差異顯著性比較Table 2Comparison of significant difference of resistance rate of swineStaphylociccusat different site to detected drugs

耐藥率Resistancerate(%)AMKGENTEFFCRPDFOXA/CCM鼻腔樣N53.3B18.5B57.5a46.5a40.0B89.5B65.0B53.0a89.0a直腸樣A81.0C36.0C67.0a54.5a51.5C81.0C59.5C70.5a84.5aN-A-27.7-17.5-9.5-5-11.5+8.5+5.5-17.5+4.5

注：同列數(shù)據(jù)肩標不同大寫字母表示差異顯著(P<0.05)；肩標相同字母或無字母標記表示差異不顯著(P>0.05)。下同

Note: Peer data shoulder marked differences in capital letters differ significantly (P<0.05); shoulder marked with the same letter or no letter mark indicates that the difference was not significant (P>0.05)

2.3不同部位分離的葡萄球菌對9種抗菌藥物多藥耐藥差異性比較

鼻腔分離的葡萄球菌主要以6耐(11.75%)和7耐(9.5%)為主，直腸分離的葡萄球菌以8耐(11.5%)為主。在1耐、4耐、5耐和6耐中，鼻腔分離的葡萄球菌多藥耐藥率顯著高于直腸分離的葡萄球菌多藥耐藥率(P<0.05)；在2耐、8耐和9耐中，直腸分離的葡萄球菌多藥耐藥率顯著高于鼻腔分離的葡萄球菌多藥耐藥率(P<0.05)。表3

表3不同部位分離的葡萄球菌多藥耐藥差異顯著性比較
Table 3Comparison of significant difference of drug resistance ofStaphylococcusin different sites

耐藥率Resistancerate(%)0耐1耐2耐3耐4耐5耐6耐7耐8耐9耐鼻腔樣N0.5a2.25B2.75B5.25a7.25B6.5B11.75B9.5a3.5B0.75B直腸樣A0.0a0.5C3.5C6.5a4.5C4.5C6.5C9.0a11.5C3.5CN-A+0.5+1.75-0.75-1.25+2.75+2.0+5.25+0.5-8-2.75

2.4不同部位分離的葡萄球菌多藥耐藥譜型結(jié)果

400株葡萄球菌對所檢測的9種抗菌藥物存在154種耐藥譜型，鼻腔分離的葡萄球菌耐藥譜型主要是6耐和7耐，共85株。6耐的耐藥譜型是TE-RP-DF-A/C-OX-CM(12/85，14.1%)，7耐2種譜型分別為TE-FFC-RP-DF-A/C-OX-CM(12/85，14.1%)、AMK-TE-RP-DF-A/C-OX-CM(6/85，7.1%)。直腸分離的葡萄球菌耐藥譜型主要是8耐和9耐，共63株。8耐2種耐藥譜型分別為AMK-TE-RP-DF-A/C-OX-CM(13/63，20.6%)、AMK-GEN-TE-FFC-DF-A/C-OX-CM(13/63，20.6%)。9耐耐藥譜型AMK-TE-FFC-RP-DF-A/C-OX-CM達到14株，占22.2%。表4

表4不同部位分離的葡萄球菌耐藥譜型檢出結(jié)果
Table 4The main drug resistance phenotype of swine Staphylociccus isolates from different site

采集部位Samplesite耐藥類型Drug-resistanttype耐藥譜型Typeofdrugresistance株數(shù)Strains比率Rate(%)鼻腔樣N6TE-RP-DF-A/C-OX-CM1214.17TE-FFC-RP-DF-A/C-OX-CM1214.17AMK-TE-RP-DF-A/C-OX-CM67.1直腸樣A8AMK-TE-FFC-RP-DF-A/C-OX-CM1320.68AMK-GEN-TE-FFC-DF-A/C-OX-CM1320.69AMK-TE-FFC-RP-DF-A/C-OX-CM1422.2

3討 論

3.1不同部位分離的葡萄球菌對被檢抗菌藥物耐藥結(jié)果分析

不同部位豬源葡萄球菌對被檢抗菌藥物有不同程度的耐藥，其中直腸分離的葡萄球菌的耐藥問題最為嚴重，尤其對臨床常用的抗菌藥物，如直腸分離的葡萄球菌除對克林霉素外8種抗菌藥物的耐藥率均高于鼻腔分離的葡萄球菌耐藥率。直腸分離的葡萄球菌對阿米卡星、氧氟沙星和克林霉素3種抗菌藥物高度耐藥；鼻腔分離的葡萄球菌對氧氟沙星和克林霉素高度耐藥。值得注意的是，直腸分離的葡萄球菌對除慶大霉素外，其余8種抗菌藥物的耐藥率均高達50%以上。試驗的結(jié)果與高璐琰等調(diào)查結(jié)果[11]相比，動物攝入的抗菌藥中有很大一部分通過動物的糞尿排泄。大部分抗菌藥物在動物體內(nèi)殘留很少，其中約30%～90%的獸藥以原藥的形式排泄，其余以代謝物的形式排泄。由此證明了此次結(jié)果：肛拭子葡萄球菌的耐藥率比鼻拭子葡萄球菌耐藥率高。如果這部分抗菌藥物及其代謝物有可能在動物排泄物排放及農(nóng)用過程中進入環(huán)境，污染環(huán)境，那么進入生態(tài)環(huán)境的抗菌藥物及其代謝物再次感染動物鼻腔，使其鼻腔的耐藥率也增加。這點也符合研究的數(shù)據(jù)：不同部位分離的葡萄球菌耐藥率都比較高的現(xiàn)象。

3.2不同部位分離的豬源葡萄球菌多藥耐藥差異性分析

經(jīng)多重耐藥分析發(fā)現(xiàn)，鼻腔分離的葡萄球菌主要以6耐和7耐為主；直腸分離的葡萄球菌以8耐和9耐為主。直腸分離的葡萄球菌在8耐和9耐顯著高于鼻腔分離的葡萄球菌的多藥耐藥率(P<0.05)。直腸分離的葡萄球菌對9種被檢抗菌藥物都耐藥的菌株是14株，占3.5%。直腸分離的葡萄球菌多藥耐藥情況比鼻腔分離的葡萄球菌多藥耐藥嚴重。多藥耐藥結(jié)果與葡萄球菌的耐藥率結(jié)果相比，都說明直腸分離的葡萄球菌耐藥情況嚴重于鼻腔分離的葡萄球菌耐藥情況。正如上所述大部分抗菌藥物是以原藥或者其代謝物的形式排出動物體內(nèi)，排泄物進入生態(tài)環(huán)境，污染周圍環(huán)境，又再次通過各種途徑進入腸道，無論是環(huán)境中污染/自然界存在的葡萄球菌還是由于使用抗菌藥物而產(chǎn)生的耐藥葡萄球菌都會再次通過腸道排泄。這樣使得呼吸道與腸道相互交叉污染，更是加重了腸道的污染。那么直腸分離的葡萄球菌多藥耐藥比鼻腔分離的葡萄球菌多藥耐藥嚴重也被證實。

3.3不同部位分離的豬源葡萄球菌與國內(nèi)其他動物源性葡萄球菌耐藥性比較

國內(nèi)大部分地區(qū)葡萄球菌對抗菌藥物的耐藥情況比較嚴重。耐藥情況最為嚴重的為河南[4]地區(qū)，其對慶大霉素、四環(huán)素、氧氟沙星、阿莫西林/克拉維酸、氟苯尼考和林克林霉素6種抗菌藥物的耐藥率集中在99.2%～100%；其次為廣東[8]地區(qū)，主要在75%～100%；比較嚴重的是廣州[5]地區(qū)，耐藥率在40.0%～100%；耐藥情況最輕的是寧夏[7]地區(qū)，耐藥率主要在15.45%～40.45%；鼻腔分離的葡萄球菌耐藥率在18.5%～89.5%；直腸分離的葡萄球菌耐藥率在36.0%～84.5%。此研究與我國其他地區(qū)葡萄球菌耐藥情況相比，直腸分離的葡萄球菌比鼻腔分離的葡萄球菌耐藥問題更嚴重。全國范圍內(nèi)葡萄球菌對抗菌藥耐藥問題十分嚴重的主要原因是在生產(chǎn)當中用藥不規(guī)范、療程不當、用量不足，長期使用同一類藥物或長期在飼料、飲水中加入預防性用藥，均可使細菌產(chǎn)生抗藥性[12]。

3.4產(chǎn)生耐藥的原因

隨著抗菌藥物的大量廣泛使用，使得耐藥菌株不斷增加。很多細菌對藥物由敏感變?yōu)槟退?，或由低水平耐藥轉(zhuǎn)變?yōu)楦咚侥退?，由單一耐藥發(fā)展到多重耐藥[13]。試驗的比較說明，不同地區(qū)，不同動物源菌株耐藥性雖存在一定的差異性，但是對于臨床常用藥物，慶大霉素、四環(huán)素、氟苯尼考、苯唑西林和克林霉素來自不同背景的結(jié)果，均表現(xiàn)較高的耐藥性。

4結(jié) 論

該養(yǎng)豬場直腸分離的葡萄球菌對阿米卡星、慶大霉素、四環(huán)素、氟苯尼考、利福平和阿莫西林/克拉維酸6種抗菌藥物的耐藥率均比鼻腔分離的葡萄球菌的耐藥率高27.7%、17.5%、9.5%、5%、11.5%和17.5%。直腸分離的葡萄球菌8耐和9耐的多藥耐藥率比鼻腔分離的葡萄球菌多藥耐藥率高8%和2.75%?？傊?，直腸分離的葡萄球菌耐藥情況比鼻腔分離的葡萄球菌耐藥情況嚴重。

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Analysis of Drug-resistance ofStaphylociccusIsolated from Pigs at Different Sites

CAI Jian-xing, XUAN Hui-yong, XIA Li-ning

(CollegeofVeterinaryMedicine,XinjiangAgriculturalUniversity,Urumqi830052，China)

Abstract：【Objective】 In order to investigate commonly used antimicrobial drug-resistance of Staphylociccus isolated from pigs at different sites (nasal and anal) in a farm in Changji, Xinjiang.【Method】 The minimal inhibitory concentrations (MIC) of the nine antimicrobial drugs to Staphylociccus were isolated from pigs at different sites. The broth dilution method was used to detect nine antibacterials' resistance of Staphylociccus and difference of drug-resistance rate was analyzed by SPSS. 【Result】 Results showed that the main resistance of Staphylococcus isolates from nasal rates to levofloxacin and clindamycin were 89.5%, 89%. The main resistance of Staphylococcus isolates from anal rates to clindamycin (84.5%), levofloxacin (81%) and amikacin (81.0%) were high. Through the chi square test analysis found that the resistance rates of Staphylococcus isolates from anal to amikacin and gentamicin were significantly higher than the isolated Staphylococcus isolates from nasal swabs (P<0.05). The drug resistance rate of Staphylococcus isolated from the nasal cavity was significantly higher than that of Staphylococcus (P<0.05). Multi drug resistance results displayed that the Staphylococcus isolated from the nasal cavity was 6 (11.75%), and the rectal isolates were 8 (11.5%). And in the 8 and 9 resistance, the resistance rate of Staphylococcus isolated from the nasal was significantly higher than that of the isolated from anal Staphylococcus isolated from anal swabs (P<0.05).【Conclusion】 The resistance rate of Staphylococcus isolated from the anal to most of the antimicrobial agents was higher than that of Staphylococcus isolated from the nasal. The multi drug resistance results described that the resistance rate of Staphylococcus isolated from the anal was more serious than that of the Staphylococcus isolated from the nasal. The drug resistance rate is more serious in the two kinds of different infection ways of respiratory tract and intestinal tract, and can be combined with different infection sites in clinical medicine, and scientific replacement of antimicrobial agents.

Key words:pig; different sites; Staphylococcus; antibacterial; resistance rate

中圖分類號：S855

文獻標識碼：A

文章編號：1001-4330(2016)03-0563-06

作者簡介:蔡建星(1991-)，女，新疆人，碩士研究生，研究方向為獸醫(yī)藥理與毒理學，(E-mail)cjx609231608@163.com通訊作者:夏利寧(1975-)，女，湖南寧鄉(xiāng)人，副教授，博士，碩士生導師，研究方向為獸醫(yī)藥理與毒理學，(E-mail)xln750530@163.com

基金項目:新疆維吾爾自治區(qū)自然科學基金項目(2014211A030)

收稿日期：2015-10-14

doi:10.6048/j.issn.1001-4330.2016.03.024

Fund project:Supported by the Natural Science Fund Projects of Science and Technology Department of Xinjiang Uygur Autonomous Region(2014211A030)