于美麗,馬兆越(煙臺(tái)毓璜頂醫(yī)院,山東煙臺(tái)64000；日照市人民醫(yī)院)

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RAD50、CDHR3、CYP27B1基因多態(tài)性與兒童哮喘易感性的關(guān)系

于美麗1,馬兆越2(1煙臺(tái)毓璜頂醫(yī)院,山東煙臺(tái)264000；2日照市人民醫(yī)院)

摘要：目的探討RAD50、CDHR3、CYP27B1基因多態(tài)性與兒童哮喘發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系。方法 采用病例-對(duì)照的研究方法，對(duì)入組的80例哮喘兒童(哮喘組)和80例健康兒童(對(duì)照組)應(yīng)用質(zhì)譜SNP技術(shù)，研究RAD50基因位點(diǎn)rs6871536、CDHR3基因位點(diǎn)rs 6967330、CYP27B1基因位點(diǎn)rs10877012的單核苷酸多態(tài)性，計(jì)算其基因型頻率和等位基因頻率，并分析基因位點(diǎn)的多態(tài)性與兒童哮喘發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)間的關(guān)系。結(jié)果哮喘組與對(duì)照組rs6871536位點(diǎn)基因型及等位基因頻率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；哮喘組與對(duì)照組rs6967330、rs10877012基因型比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。突變等位基因C、T與哮喘有相關(guān)性，TT、CC型的OR(95%CI)分別為0.407(0.231～0.718)、0.677(0.546～0.839)。結(jié)論 RAD50基因rs6871536位點(diǎn)多態(tài)性可能與兒童哮喘相關(guān)；CDHR3基因rs 6967330位點(diǎn)多態(tài)性和CYP27B1基因位點(diǎn)rs10877012位點(diǎn)多態(tài)性可能與兒童哮喘無(wú)相關(guān)性。

關(guān)鍵詞：哮喘；基因多態(tài)性；RAD50；CDHR3；CYP27B1

支氣管哮喘(簡(jiǎn)稱(chēng)哮喘)是一種常見(jiàn)病、多發(fā)病，尤其是在兒童人群之中，其發(fā)病率與病死率不斷上升。目前支氣管哮喘的發(fā)病原因及機(jī)制尚未完全明確，但眾多學(xué)者們認(rèn)為支氣管哮喘是一種由環(huán)境因素和遺傳因素共同參與的Ⅰ型超敏反應(yīng)性疾病[1]。隨著社會(huì)的進(jìn)步，遺傳學(xué)與分子生物學(xué)的不斷成熟，人們將對(duì)疾病病因研究的重點(diǎn)逐漸聚焦到基因水平，哮喘是一種多基因復(fù)雜性疾病，近年來(lái)有關(guān)哮喘易感基因的研究越來(lái)越多[2～5]。CDHR3基因、CYP27B1基因、RAD50基因是近年來(lái)眾多專(zhuān)家較為關(guān)注的與哮喘易感性相關(guān)的基因。2013年3月～2014年10月,我們選取CDHR3基因rs 6967330位點(diǎn)、CYP27B1基因位點(diǎn)rs10877012、RAD50基因rs6871536位點(diǎn)進(jìn)行多態(tài)性研究，以期為哮喘的預(yù)防與治療提供新的思路。

1資料與方法

1.1臨床資料哮喘患兒80例(哮喘組)，男49例、女31例，年齡(7.94±2.11)歲。哮喘患兒均符合《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南》診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]。同時(shí)收集在煙臺(tái)毓璜頂醫(yī)院兒科門(mén)診體檢中心體檢的健康兒童80例為對(duì)照組，男43例、女37例，年齡(8.23±2.17)歲。對(duì)照組兒童及三代以?xún)?nèi)直系親屬均無(wú)哮喘病史及典型的過(guò)敏性疾病病史。兩組研究對(duì)象均來(lái)自煙臺(tái)地區(qū)，相互間無(wú)血緣關(guān)系。兩組對(duì)象均為漢族，性別、年齡構(gòu)成差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2RAD50、CDHR3、CYP27B1基因多態(tài)性檢測(cè)方法對(duì)哮喘患兒及健康兒童均采集肘靜脈血3 mL，3 000 r/min離心5 min，分離血清后置于EP管中，然后嚴(yán)格按照血液基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明進(jìn)行DNA提取，試劑盒來(lái)自北京天根生化科技有限公司。根據(jù)文獻(xiàn)，在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(NCBI)網(wǎng)站上查詢(xún)包括相應(yīng)位點(diǎn)的一段基因序列，確定其突變位點(diǎn)后進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，該過(guò)程由北京六合華大基因科技有限公司深圳分公司完成。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件。經(jīng)校正性別和年齡的影響后，計(jì)算每個(gè)SNP位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率分布，Hardy-Weinberg平衡檢測(cè)用精確檢驗(yàn)，哮喘組和對(duì)照組基因型和等位基因頻率分布比較采用卡方檢驗(yàn)，采用Logistic回歸分析來(lái)計(jì)算其OR和95%CI。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

在校正性別和年齡的影響后，經(jīng)精確檢驗(yàn)，哮喘組與對(duì)照組CDHR3、CYP27B1、RAD50基因型頻率分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0．05)，表明其基因頻率已達(dá)到遺傳平衡，具有群體代表性。

經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，RAD50位點(diǎn)rs6871536、CDHR3位點(diǎn)rs 6967330、CYP27B1位點(diǎn)rs10877012的基因型與等位基因頻率分布分別見(jiàn)表1、2、3。哮喘組與對(duì)照組CDHR3位點(diǎn)rs 6967330和CYP27B1位點(diǎn)rs 10877012的基因型及等位基因頻率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.209，P=0.363；χ2=2.737，P=0.254)。哮喘組與對(duì)照組RAD50位點(diǎn)rs6871536位點(diǎn)基因型及等位基因頻率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.931，P=0.019；χ2=9.986，P=0.002)，突變等位基因C、T與哮喘有相關(guān)性，TT、CC型的OR(95%CI)分別為0.407(0.231～0.718)、0.677(0.546～0.839)。

表1　兩組rs6871536 位點(diǎn)基因型與等位基因頻率比較[例(%)]

表2　兩組rs6967330位點(diǎn)基因型與等位基因頻率比較[例(%)]

表3　兩組rs10877012位點(diǎn)基因型與等位基因頻率比較[例(%)]

3討論

支氣管哮喘是一種多基因參與的復(fù)雜性疾病，具有高度明顯的遺傳性[7]。有研究發(fā)現(xiàn)，如果父親或母親一方患有支氣管哮喘，孩子患哮喘的危險(xiǎn)程度比無(wú)哮喘家庭的孩子高，如果父母均患有哮喘，則孩子患病的風(fēng)險(xiǎn)更大[8]。目前支氣管哮喘的發(fā)病率與病死率不斷上升，發(fā)現(xiàn)與哮喘相關(guān)的易感基因，深入研究其發(fā)病機(jī)理，可為哮喘的預(yù)防和治療提供新的靶點(diǎn)。

支氣管哮喘是一種Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)性疾病，在特異性抗原的刺激下，IgE與肥大細(xì)胞、嗜酸性、嗜堿性粒細(xì)胞上的特異性受體結(jié)合后，釋放大量的炎癥介質(zhì)，引起支氣管平滑肌的痙攣，毛細(xì)血管通透性增加等變態(tài)反應(yīng)，最終導(dǎo)致哮喘的發(fā)生[9]。第三次全基因組關(guān)聯(lián)分析新發(fā)現(xiàn)了一個(gè)與總IgE相關(guān)的基因-RAD50[10]，該基因位于染色體的5q31.1區(qū)域，這一區(qū)域與白細(xì)胞介素等與哮喘相關(guān)的細(xì)胞因子基因區(qū)域接近[11]。RAD50是一種DNA修復(fù)蛋白，能與DNA結(jié)合并能檢測(cè)其有缺陷的部位，其能調(diào)控相鄰的幾個(gè)白細(xì)胞介素基因的表達(dá)[12]。本研究我們選擇RAD50基因的rs6871536 位點(diǎn)作為研究對(duì)象，探討煙臺(tái)地區(qū)RAD50基因多態(tài)性和支氣管哮喘發(fā)病危險(xiǎn)性間的關(guān)系，結(jié)果顯示在哮喘組和對(duì)照組中，rs6871536 位點(diǎn)的基因型和等位基因型頻率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明RAD50基因rs6871536 位點(diǎn)的多態(tài)性可能與煙臺(tái)地區(qū)的兒童支氣管哮喘發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。

已有研究[13]發(fā)現(xiàn)，鈣黏蛋白家族如上皮細(xì)胞鈣黏蛋白、原鈣黏素介導(dǎo)的細(xì)胞受體等與支氣管哮喘有明顯的相關(guān)性。哥本哈根大學(xué)進(jìn)行的一項(xiàng)研究，通過(guò)篩查兒童的DNA，發(fā)現(xiàn)了在極早期哮喘形成中起重要作用的基因-CDHR3，該基因定位于染色體的7q22.3區(qū)域,是最新發(fā)現(xiàn)與支氣管哮喘發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)的基因[14]。CDHR3是一種包含六個(gè)外鈣黏蛋白結(jié)構(gòu)域的跨膜蛋白，其可介導(dǎo)同源性細(xì)胞的黏附，參與細(xì)胞分化、細(xì)胞間相互作用等過(guò)程[15]。其中鈣黏蛋白結(jié)構(gòu)域D5與D6間的兩個(gè)半胱氨酸529和566由于與這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的距離較短，相互之間的作用會(huì)使二硫鍵發(fā)生重組，形成野生型的半胱氨酸突變體[14]。該變體的殘基有可能會(huì)破壞蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)及穩(wěn)定性，因此這可能是CDHR3參與支氣管哮喘發(fā)病的主要機(jī)制。rs6967330位點(diǎn)位于CDHR3基因的最頂端，由于半胱氨酸529的等位基因發(fā)生了A-G突變，導(dǎo)致基因序列和基因型均發(fā)生了變化，該位置編碼的氨基酸由半胱氨酸突變成了酪氨酸。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在哮喘組和對(duì)照組中，CDHR3基因rs6967330位點(diǎn)的基因型和等位基因型頻率的分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明CDHR3基因rs6967330位點(diǎn)的多態(tài)性與煙臺(tái)地區(qū)兒童支氣管哮喘的易感性無(wú)明顯相關(guān)性。

近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明維生素D與支氣管哮喘間存在明顯相關(guān)性[16]。但維生素D必須轉(zhuǎn)化為其活性形式1,25二羥維生素D3才能發(fā)揮其生物學(xué)作用[17]。1α羥化酶是維生素D活化過(guò)程中的關(guān)鍵酶，由CYP27B1編碼。染色體的12q13.1-13.3區(qū)域是CYP27B1基因的所在位置，位于啟動(dòng)子區(qū)域的基因位點(diǎn)rs10877012可發(fā)生G-T突變，導(dǎo)致該基因的序列發(fā)生改變，進(jìn)而影響CYP27B1基因的表達(dá)，體內(nèi)1,25(OH)2D3的水平發(fā)生改變，導(dǎo)致與維生素D缺乏有關(guān)的疾病如支氣管哮喘等的發(fā)生。本研究結(jié)果表明，rs10877012位點(diǎn)與支氣管哮喘的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)間無(wú)明顯相關(guān)性，這可能是由于該位點(diǎn)的G-T突變?yōu)橥N意義的突變，基因的表達(dá)并未受到影響。

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(收稿日期：2015-11-27)

中圖分類(lèi)號(hào)：R256.12

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B

文章編號(hào)：1002-266X(2016)13-0059-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.13.023