楊冬雪+孫大慶+李洪飛+李芬

摘 要：為了開發(fā)雜糧酵素發(fā)酵劑菌種，以淀粉酶活力為評價指標(biāo)，從雜糧發(fā)酵酸面團(tuán)中分離、篩選具有高產(chǎn)淀粉酶活力的酵母菌，并且利用分子生物學(xué)方法鑒定其菌種分類。研究結(jié)果顯示，從雜糧酸面團(tuán)中共分離出36株酵母菌，其中NCCC7和NCCC31菌株淀粉酶活力最高，分別為453.13U/mL和463.79U/mL，經(jīng)26S rDNA鑒定，NCCC7和NCCC31均為釀酒酵母菌種。

關(guān)鍵詞：雜糧酵素；釀酒酵母；淀粉酶

中圖分類號 S816.7 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-7731（2016）08-25-03

Abstract：In order to develop coarse cereals enzymes starter，amylase activity as the evaluation index，high amylase producing yeast were isolated and screened from coarse cereals sourdough，and classified by molecular biology techniques. Research results showed that 36 strains of yeast were isolated from coarse cereals sourdough，the amylase activity of NCCC7 and NCCC31 strains was the highest，453.13U/mL and 463.79U/mL respectively，and both NCCC7 and NCCC31 strains were identified as Saccharomyces cerevisiae by 26S rDNA gene.

Key words：Coarse cereals enzymes；Saccharomyces cerevisiae；Amylase

酵素是有益微生物通過發(fā)酵食材而產(chǎn)生的富含多種生物活性酶的健康保健食品，近年來越來越受到消費(fèi)者的青睞[1]。市場中現(xiàn)有酵素食品原料多集中于果蔬、菇類、中草藥等非糧食食材[2-3]，糧食中只有糙米進(jìn)行了酵素食品的開發(fā)[4-5]，并獲得了極大的成功，然而雜糧酵素食品開發(fā)尚屬空白，因此雜糧酵素食品及其保健品的研究開發(fā)具有良好的市場前景和應(yīng)用價值。本研究從自然發(fā)酵雜糧酸面團(tuán)中分離、篩選和鑒定高產(chǎn)淀粉酶的酵母菌，進(jìn)而期望為雜糧酵素食品的開發(fā)提供優(yōu)良的酵母菌菌種資源。

1 試驗(yàn)材料

1.1 原料 小米、黑米、薏苡、蕎麥、蕓豆、高粱，市售。

1.2 試劑及培養(yǎng)基 酵母菌基因組提取試劑盒、Taq酶，購自上海生工生物工程有限公司；淀粉酶試劑盒，購自南京建成生物工程研究所；碘液、可溶性淀粉等均購自哈爾濱無限峰科技有限公司。YPD培養(yǎng)基：葡萄糖2.0%，酵母提取物2.0%，蛋白胨2.0%。YEPD培養(yǎng)基：葡萄糖2.0%，酵母提取物2.0%，蛋白胨2.0%，瓊脂2.0%。酵母菌篩選培養(yǎng)基：酵母提取物0.5%，蛋白胨1.0%，NaCl0.5%，可溶性淀粉0.2%，瓊脂2.0%。

1.3 主要儀器設(shè)備 壓力蒸汽滅菌器，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠生產(chǎn)；超凈工作臺，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司生產(chǎn)；生化培養(yǎng)箱，上海姚氏儀器設(shè)備廠生產(chǎn)；全溫振蕩培養(yǎng)器，上海智誠分析儀器制造有限公司生產(chǎn)；精密分析天平，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠生產(chǎn)；臺式離心機(jī)，武漢世紀(jì)超杰實(shí)驗(yàn)儀器有限公司生產(chǎn)。

2 試驗(yàn)方法

2.1 檢測方法 淀粉酶活力采用分光光度計(jì)檢測方法，具體操作按照南京建成生物工程研究所的淀粉酶試劑盒說明書進(jìn)行。

2.2 自然發(fā)酵雜糧面團(tuán)的制作方法 將6種雜糧粉各100g進(jìn)行混合，邊混合邊加入400mL水，搓揉成面團(tuán)，溫度28℃和濕度75%條件下，在醒發(fā)箱中發(fā)酵5h。

2.3 酵母菌的分離純化 取1g雜糧發(fā)酵面團(tuán)，用無菌水梯度稀釋后涂布于YEPD培養(yǎng)基平板，28℃培養(yǎng)48h后，多次分離劃線得到單菌落，接種于YPD培養(yǎng)基中28℃培養(yǎng)24h后，加甘油保存于-80℃冰箱，備用。

2.4 高產(chǎn)淀粉酶酵母菌的篩選 將分離和純化后的菌種涂布于篩選培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)24h后加稀碘液，靜置5min后觀察透明圈，測量透明圈直徑大小。測量后將透明圈較大的單菌落接種于YPD培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)48h后檢測淀粉酶活力。

2.5 酵母菌菌種的分子生物學(xué)鑒定 以待測菌種的基因組DNA為模板，以NL-1（5′-GCATATCAATAAGCGGA GGAAAAG-3′）和NL-4（5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′）為引物進(jìn)行酵母菌26S rDNA基因D1/D2片段擴(kuò)增。待測菌種的基因組DNA采用酵母菌基因組提取試劑盒制備。PCR擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性5min，1個循環(huán)；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30個循環(huán)；72℃延伸5min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物由上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序。測序得到的26S rDNA基因D1/D2片段序列利用BLAST進(jìn)行檢索，找到序列同源性最高的已知菌種，選取該菌屬內(nèi)有代表性的多種模式菌株26S rDNA基因D1/D2片段序列，利用MEGA6.0軟件[6]中Neighbor Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。利用Bootsdrap1000次檢驗(yàn)進(jìn)化樹置信度[7]。

3 結(jié)果與分析

3.1 酵母菌分離和純化 通過梯度稀釋、涂布平板和多次劃線分離純化，共得到疑似酵母菌36株，結(jié)果如圖1所示。

3.2 酵母菌產(chǎn)淀粉酶能力 分離純化酵母菌株的透明圈測量結(jié)果見表1。由表1可知，在分離的36株酵母菌中，只有4個菌株沒有透明圈，其余32個菌株均有不同大小的透明圈出現(xiàn)，這表明雜糧發(fā)酵酸面團(tuán)環(huán)境下分離的酵母菌大多數(shù)都具有淀粉酶合成能力，其中5株酵母菌透明圈大于4mm。

將透明圈大于4mm的5個酵母菌菌株進(jìn)行淀粉酶活力的測定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。由表2可以看出，NCCC7和NCCC31菌株產(chǎn)淀粉酶能力最強(qiáng)，淀粉酶活力分別可達(dá)453.13U/mL和463.79U/mL，其余3株酵母菌也表現(xiàn)出較強(qiáng)的產(chǎn)淀粉酶能力。

3.3 酵母菌菌種分子生物學(xué)鑒定 對產(chǎn)淀粉酶能力最強(qiáng)的NCCC7和NCCC31菌株進(jìn)行26S rDNA基因D1/D2區(qū)域的PCR，擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖2。由圖2可知，NCCC7和NCCC31菌株均擴(kuò)增出1條約500bp的目的條帶，與預(yù)期酵母菌26S rDNA基因D1/D2區(qū)域片段大小一致，可用于后續(xù)測序?qū)嶒?yàn)。

NCCC7和NCCC31菌株的26S rDNA基因D1/D2區(qū)域DNA片段經(jīng)上海生工生物工程有限公司測序，測序結(jié)果經(jīng)NCBI網(wǎng)站的BLAST軟件比對，獲得相似性最高的菌種均是釀酒酵母，序列相似性分別為98.9%和99.2%。2個菌株的26S rDNA基因D1/D2區(qū)域DNA序列與其他模式菌株26S rDNA基因D1/D2區(qū)域DNA序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果見圖3。由圖3可知，NCCC7和NCCC31菌株26S rDNA基因均與釀酒酵母聚類為一支，親緣關(guān)系最近，同時與奇異酵母菌沒有聚類為一支，表明親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。因此，根據(jù)序列比對分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，NCCC7和NCCC31菌株均屬于釀酒酵母菌種，因此將其命名為釀酒酵母NCCC7和NCCC31。

4 結(jié)論

本研究從自然發(fā)酵的雜糧酸面團(tuán)中分離純化出36株酵母菌疑似菌株，其中大多數(shù)菌株具有產(chǎn)淀粉酶能力[8]。測定了5株酵母菌的淀粉酶活力，其中NCCC7和NCCC31產(chǎn)淀粉酶活力最高，分別為453.13U/mL和463.79U/mL。之后利用分子生物學(xué)方法對NCCC7和NCCC31的26S rDNA基因進(jìn)行了菌種鑒定，根據(jù)序列比對分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，結(jié)果顯示，NCCC7和NCCC31均為釀酒酵母菌種，可以用于今后雜糧酵素食品開發(fā)的候選發(fā)酵劑。

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（責(zé)編：張宏民）