蘇新平，朱克儉*，譚旭儀

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南長沙410208；2.湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，湖南長沙410006）

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止痛健骨方對(duì)兔膝骨關(guān)節(jié)炎模型滑膜及軟骨修復(fù)的影響

蘇新平1,2，朱克儉2*，譚旭儀2

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南長沙410208；2.湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，湖南長沙410006）

〔摘要〕目的觀察止痛健骨方對(duì)兔膝骨關(guān)節(jié)炎模型滑膜及軟骨修復(fù)的影響。方法建立兔膝骨關(guān)節(jié)模型，將兔隨機(jī)分為正常對(duì)照組，模型對(duì)照組，骨刺寧組，止痛健骨低、中、高組共6組，每組6只，止痛健骨低、中、高劑量組分別給予4.48、8.96、17.92 g/kg止痛健骨方灌胃，骨刺寧組給予0.504 g/kg骨刺寧膠囊灌胃，正常對(duì)照組、模型對(duì)照組給予蒸餾水灌胃，每次10 mL/kg，每日1次，連續(xù)給藥4周，檢測(cè)各組兔右膝關(guān)節(jié)屈曲活動(dòng)度、關(guān)節(jié)滑膜厚度及軟骨未鈣化厚度/鈣化厚度，以及膝關(guān)節(jié)滑膜液炎性細(xì)胞，并進(jìn)行比較。結(jié)果實(shí)驗(yàn)4周后，模型對(duì)照組較正常對(duì)照組膝關(guān)節(jié)屈曲活動(dòng)度、軟骨未鈣化厚度/鈣化厚度明顯減少，關(guān)節(jié)滑膜厚度、滑膜液炎性細(xì)胞明顯增加（P＜0.05）。與模型對(duì)照組比較，止痛健骨低、中、高劑量組膝關(guān)節(jié)屈曲活動(dòng)度、軟骨未鈣化厚度/鈣化厚度均明顯增加，關(guān)節(jié)滑膜厚度、滑膜液炎性細(xì)胞減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論止痛健骨方能抑制滑膜增生，增加非鈣化軟骨厚度，延緩軟骨退變，增加關(guān)節(jié)屈曲活動(dòng)度，這可能是其治療膝骨關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制。

〔關(guān)鍵詞〕止痛健骨方；膝骨關(guān)節(jié)炎；兔；滑膜；軟骨；當(dāng)歸；白芥子；丹參

止痛健骨方由當(dāng)歸、白芥子、丹參、乳香、沒藥等12味中藥組成，具有活血祛痰、通絡(luò)止痛、強(qiáng)筋健骨的功能，臨床上對(duì)膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）具有較好的療效。本文觀察止痛健骨方對(duì)KOA滑膜、軟骨等影響，探討其對(duì)膝骨關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制，為臨床上治療KOA提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料與方法

1.1動(dòng)物

成年日本大耳白兔38只，雌雄各半，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心代購，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（湘）2009-0012。

1.2藥物與試劑

止痛健骨方由湖南省中醫(yī)藥研究院中藥所提供，藥物由當(dāng)歸、白芥子、丹參、豬牙皂、鹿角霜、鱉甲、黃芪、乳香、沒藥、獨(dú)活、千年健、陸英12味組成。骨刺寧膠囊（功效為活血化瘀、通絡(luò)止通功效，山西忻州市云中制藥廠生產(chǎn)，批號(hào)：20000225）。

1.3動(dòng)物分組及模型制備

將38只白兔按照體質(zhì)量分層隨機(jī)分為正常組7只，模型組31只。模型組白兔參照關(guān)節(jié)制動(dòng)制作骨關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型方法[1]，采用石膏將兔右后膝關(guān)節(jié)伸直位固定，6周后在正常組、模型組各隨機(jī)選擇1只白兔，處死，打開右膝關(guān)節(jié)，驗(yàn)證模型組白兔右后膝骨關(guān)節(jié)炎模型制備成功。此時(shí)將模型組剩余的30只白兔隨機(jī)分為模型對(duì)照組，骨刺寧組，止痛健骨低、中、止痛健骨高劑量組共5組，每組6只，正常對(duì)照組為之前正常組剩余的6只白兔。

1.4藥物干預(yù)

根據(jù)兔與人體表面積方法[2]，計(jì)算得出止痛健骨低、中、高劑量組分別給予止痛健骨方4.48、8.96、17.92 g/kg灌胃（分別相當(dāng)于人臨床等效劑量的1、2、4倍）。骨刺寧組給予骨刺寧膠囊0.504 g/kg灌胃（相當(dāng)于人臨床等效劑量的2倍），正常對(duì)照組、模型對(duì)照組給予蒸餾水灌胃，10 mL/kg。每日給藥1次，連續(xù)給藥4周。

1.5觀察指標(biāo)及方法

1.5.1右膝關(guān)節(jié)屈曲活動(dòng)度各組白兔在造模6周后（即實(shí)驗(yàn)干預(yù)前）、實(shí)驗(yàn)干預(yù)4周后采用雙臂式量角器測(cè)量右膝關(guān)節(jié)活動(dòng)度，方法如下：以雙臂式量角器測(cè)定軸心對(duì)準(zhǔn)關(guān)節(jié)中心點(diǎn)，兩臂對(duì)準(zhǔn)肢段軸線，膝關(guān)節(jié)伸直位為0°。

1.5.2膝關(guān)節(jié)滑膜厚度及軟骨未鈣化厚度/鈣化厚度實(shí)驗(yàn)干預(yù)4周后，耳緣靜脈空氣栓塞處死全部動(dòng)物，立即打開各組白兔右后膝關(guān)節(jié)腔，用螺旋測(cè)微器測(cè)定關(guān)節(jié)滑膜厚度，然后將切取軟骨作HE染色區(qū)別鈣化與未鈣化部分，并分別測(cè)量其厚度，計(jì)算軟骨未鈣化厚度與鈣化厚度的比值。

1.5.3膝關(guān)節(jié)滑膜液炎性細(xì)胞提取右后膝關(guān)節(jié)滑膜液涂片計(jì)數(shù)炎性細(xì)胞，光鏡下觀察記錄。每張涂片隨機(jī)觀察5個(gè)HP（10×40倍）視野，計(jì)算每一視野平均炎性細(xì)胞數(shù)。計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞數(shù)為0個(gè)/HP為“-”，細(xì)胞數(shù)<10個(gè)/HP為“+”，10～20個(gè)細(xì)胞/HP“++”，細(xì)胞數(shù)>20個(gè)/HP為“+++”。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料滿足方差齊性和正態(tài)齊性時(shí)，組間比較采用單因素方差分析（LSD法），組內(nèi)治療前后比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，多組間等級(jí)資料采用Kruskal-wallis H檢驗(yàn)，以P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1各組右膝關(guān)節(jié)屈曲活動(dòng)度比較

各組白兔均完成了4周時(shí)間的實(shí)驗(yàn)干預(yù)，實(shí)驗(yàn)期間無死亡。在實(shí)驗(yàn)干預(yù)前對(duì)各組白兔右后膝關(guān)節(jié)屈曲活動(dòng)度進(jìn)行測(cè)量，模型對(duì)照組、骨刺寧組、止痛健骨低、中、高劑量組分別與正常對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示兔膝骨關(guān)節(jié)炎模型活動(dòng)度較正常減少。實(shí)驗(yàn)干預(yù)4周后，骨刺寧組，止痛健骨低、中、高劑量組較干預(yù)前有增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而正常對(duì)照組、模型對(duì)照組無明顯變化（P＞0.05）。實(shí)驗(yàn)干預(yù)后組間比較，骨刺寧組、止痛健骨低、中、高劑量組分別與模型對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示經(jīng)止痛健骨方干預(yù)后，右膝關(guān)節(jié)屈曲活動(dòng)度得到明顯增加，見表1。

2.2各組右膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)滑膜厚度、軟骨未鈣化厚度/鈣化厚度比較結(jié)果

實(shí)驗(yàn)干預(yù)4周后，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組、骨刺寧組、止痛健骨低、中、高劑量組關(guān)節(jié)滑膜厚度有明顯增加，軟骨未鈣化厚度/鈣化厚度有減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。骨刺寧組，止痛健骨低、中、高劑量組較模型對(duì)照組比較，關(guān)節(jié)滑膜厚度有減少，軟骨未鈣化厚度/鈣化厚度有增加（P＜0.01）。與骨刺寧組比較，止痛健骨低、中劑量組在該兩項(xiàng)指標(biāo)無明顯差異（P＞0.05），但止痛健骨高劑量組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01），表明止痛健骨方對(duì)兔KOA模型滑膜厚度腫脹有抑制作用，能增加軟骨未鈣化與鈣化厚度的比值，見表2。

表1　各組右膝關(guān)節(jié)屈曲活動(dòng)度比較?。ā纒，n=6）

表1　各組右膝關(guān)節(jié)屈曲活動(dòng)度比較?。ā纒，n=6）

注：干預(yù)前，與正常對(duì)照組比較，#P＜0.05，模型對(duì)照組、骨刺寧組、止痛健骨低、中、高劑量組五組兩兩互相比較，P＞0.05；干預(yù)后，與正常對(duì)照組比較，△P＜0.05，與模型對(duì)照組比較，▲P＜0.05，止痛健骨低、中、高劑量組三組兩兩互相比較，P=0.000。組內(nèi)干預(yù)前后比較，☆P＜0.05。

組別正常對(duì)照組模型對(duì)照組骨刺寧組止痛健骨低劑量組止痛健骨中劑量組止痛健骨高劑量組F值P值劑量（g/Kg）0.504 4.48 8.96 17.92干預(yù)前（°）145.61±5.3 101.72±6.1#102.52±5.8#103.05±5.9#102.41±6.0#101.95±5.4#576.883 ＜0.01干預(yù)后（°）146.13±4.9 101.92±8.6△120.48±10.3△▲☆119.70±10.4△▲☆126.85±10.0△▲☆130.24±8.9△▲☆562.818 ＜0.01 t值P值-0.925 -1.012 31.240 29.547 33.876 52.268 0.623 0.571 0.000 0.000 0.000 0.000

表2　各組右膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)滑膜厚度、軟骨未鈣化厚度/鈣化厚度比較　?。ā纒，n=6）

表2　各組右膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)滑膜厚度、軟骨未鈣化厚度/鈣化厚度比較　?。ā纒，n=6）

注：與正常對(duì)照組比較，#P=0.000；與模型對(duì)照組比較，*P=0.000；與骨刺寧組比較，▲P＜0.05。

組別　劑量（g/Kg）正常對(duì)照組模型對(duì)照組骨刺寧組止痛健骨低劑量組止痛健骨中劑量組止痛健骨高劑量組F值P值0.504 4.48 8.96 17.92關(guān)節(jié)滑膜厚度（mm）1.03±0.07 1.54±0.12#1.22±0.09#* 1.23±0.03#* 1.24±0.10#* 1.18±0.03#*▲85.499 ＜0.01軟骨未鈣化厚度/鈣化厚度8.32±0.73 5.11±0.64#7.88±0.78#* 7.85±0.79#* 7.86±0.85#* 8.11±0.81#*▲104.211 ＜0.01

2.3各組右膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)滑膜液炎性細(xì)胞計(jì)數(shù)比較

實(shí)驗(yàn)干預(yù)4周后，各組右膝關(guān)節(jié)滑膜液炎性細(xì)胞計(jì)數(shù)，模型對(duì)照組較正常對(duì)照組滑膜液炎性細(xì)胞明顯增加，骨刺寧組，止痛健骨低、中、高劑量組較模型對(duì)照組明顯減少（P＜0.05），表明止痛健骨方能較好緩解兔KOA模型膝關(guān)節(jié)滑膜的炎性癥狀，見表3。

表3　各組右膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)滑膜液炎性細(xì)胞計(jì)數(shù)比較　（n=6）

3討論

KOA主要臨床表現(xiàn)為膝關(guān)節(jié)部位疼痛、活動(dòng)不利等，好發(fā)于中老年人，對(duì)日常生活與活動(dòng)有較大影響[3-4]。隨著我國社會(huì)老齡化進(jìn)程加快，本病的發(fā)病率逐年上升[5]。有關(guān)中醫(yī)藥治療本病的研究與臨床觀察報(bào)道也較多。一般認(rèn)為，中醫(yī)藥治療骨性關(guān)節(jié)炎療效與西醫(yī)相比副作用少而療效鞏固，因此國內(nèi)外市場(chǎng)也對(duì)治療本病的中醫(yī)藥產(chǎn)品有較好的認(rèn)同[6]。

有關(guān)KOA的具體發(fā)病機(jī)制仍未完全明了，實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)本病主要病理特點(diǎn)是軟骨退變、破壞，并伴關(guān)節(jié)滑膜增生，這在人體和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中均得到可靠證實(shí)。在KOA軟骨病理切片中，非鈣化軟骨厚度下降，鈣化軟骨厚度反而增加，軟骨未鈣化厚度/鈣化厚度比值下降[7]。中醫(yī)學(xué)中并無KOA病名，但根據(jù)其癥狀特點(diǎn)，將KOA歸屬“膝痹”范疇[8]，如《素問·脈要精微論》云：“膝者，筋之府，屈伸不能，行則僂附，筋將憊矣?！北静∪站貌挥?，常有關(guān)節(jié)腫脹、積液之癥，更為痰瘀阻絡(luò)，其舌質(zhì)暗或有瘀斑、瘀點(diǎn)，舌苔滑或膩等皆為痰瘀之證。由此可見，痰瘀阻絡(luò)，肝腎虧虛，屬本虛標(biāo)實(shí)之證[9]。正如《丹溪心法》云：“肥人肢節(jié)痛，多是風(fēng)濕與痰飲流注經(jīng)絡(luò)而痛?！币虼?，對(duì)本病的治療，應(yīng)痰瘀兼顧。

為探討止痛健骨方對(duì)KOA的作用機(jī)制，本課題在成功制備兔KOA模型基礎(chǔ)，觀察其對(duì)兔KOA模型滑膜及軟骨修復(fù)的影響。該方原系湖南省民間以補(bǔ)腎活血為主要功能治療骨質(zhì)增生癥的經(jīng)驗(yàn)方，經(jīng)湖南省中醫(yī)藥研究院朱克儉教授根據(jù)其臨床經(jīng)驗(yàn)及對(duì)骨關(guān)節(jié)炎病因病機(jī)、證候辨治特點(diǎn)，從痰瘀阻絡(luò)，兼肝腎不足立法，對(duì)處方用藥進(jìn)行了較大調(diào)整，臨床應(yīng)用于治療腰、膝等多部位骨性關(guān)節(jié)炎多年，通過初步臨床觀察，提示該方有止痛作用顯著且見效較快、作用較為持久等特點(diǎn)。方中以當(dāng)歸活血祛瘀，通絡(luò)止痛，白芥子豁痰通經(jīng)、消腫止痛，二味共為君藥；方中丹參活血祛瘀止痛，用之以加強(qiáng)當(dāng)歸活血通絡(luò)止痛功能；豬牙皂通竅滌痰，用之以加強(qiáng)白芥子祛痰通經(jīng)的功能；鹿角霜補(bǔ)肝腎以強(qiáng)筋骨，兼顧其本虛。以上三味為臣藥。方中鱉甲滋補(bǔ)肝腎，通絡(luò)散結(jié)。用之佐助君臣藥肝腎、強(qiáng)筋骨，且通絡(luò)而止痛；黃芪健脾而資氣血生化之源，用以補(bǔ)虛損而佐助行血?dú)狻?qiáng)筋骨；乳香、沒藥二藥并用，凡心胃脅腹肢體關(guān)節(jié)諸疼痛皆能治之，二味進(jìn)一步增強(qiáng)全方行血通絡(luò)止痛效果；獨(dú)活、千年健、陸英功能通經(jīng)絡(luò)，消腫痛。七藥皆能佐助君臣藥改善癥狀，故以為佐藥。全方合用，共奏活血祛痰，通絡(luò)止痛，強(qiáng)筋健骨之效，故對(duì)骨性關(guān)節(jié)炎痰瘀阻絡(luò)兼肝腎不足所致腰膝酸脹疼痛、乏力，關(guān)節(jié)腫脹麻木，活動(dòng)不利等癥有效。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，方中藥物具有多種藥理效應(yīng)，如抗血小板聚集、抗炎、鎮(zhèn)痛、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等作用[10-12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，止痛健骨方能抑制滑膜增生和炎癥癥狀，增加非鈣化軟骨厚度，延緩軟骨退變，增加關(guān)節(jié)屈曲活動(dòng)度，且隨著止痛健骨劑量的增加，各指標(biāo)改善明顯，這可能是其治療KOA的作用機(jī)制。然止痛健骨方通過何種信號(hào)通路達(dá)到對(duì)KOA的作用，有待下階段進(jìn)一步研究。

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（本文編輯楊瑛）

Effects of Zhitong Jiangu Decoction on Synovial and Cartilage Repair in Rabbit Models of Knee Oosteoarthritis

SU Xinping1,2, ZHU Kejian2*, TAN Xuyi2
(1.Hunan University of Chinese Medicine, Changsha, Hunan 410208, China; 2. The Affiliated Hospital of Hunan Academy of Chinese Medicine, Changsha, Hunan 410006, China)

Abstract〔〕Objective To observe the effect of Zhitong Jiangu decoction on synovial and cartilage repair in rabbit models of knee osteoarthritis. Methods The rabbits were randomly divided into normal control group, model control group, Gucining group, and low, medium and high dose of Zhitong Jiangu groups, six rabbits in each group, after rabbit models of knee osteoarthritis were successfully established. Rabbits of low, middle, high dose of Zhitong Jiangu were given 4.48, 8.96 17.92 g/kg Zhitong Jiangu decoction, respectively. Gucining group was given 0.504 g/kg Gucining capsule, while normal control group and model control group were given 10 mL/kg distilled water for once per day, continuously administration for 4 weeks. Then right knee flexion mobility, synovium thickness and ratio of noncalcified cartilage with calcified, and synovial fluid inflammatory cells were observed and compared. Results After 4 weeks, compared with normal control group, the right knee flexion mobility and ratio of noncalcified cartilage with calcified of the model control group was decreased, while its synovium thickness and synovial fluid inflammatory cells was increased (P＜0.05). Compared with model control group, the knee flexion mobility and ratio of noncalcified cartilage with calcified of Zhitong JianGu groups were increased, while their synovium thickness and synovial fluid inflammatory cells were decreased, the diffrences were statistically significant (P＜0.05). Conclusion Zhitong Jiangu decoction could inhibit the synovium hyperplasia, thicken noncalcified cartilage, delay cartilage degeneration and increase knee flexion mobility, it may be a mechanism for the treatment of knee osteoarthritis.

Keywords〔〕Zhitong Jiangu decoction；knee osteoarthritis；rabbits；synovium；cartilage；Angelica sinensis；mustard；Salvia miltiorrhiza

〔通訊作者〕*朱克儉，男，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：zkjo0731@263.net。

〔作者簡(jiǎn)介〕蘇新平，男，主任醫(yī)師，在讀博士研究生，主要從事骨關(guān)節(jié)病研究。

〔基金項(xiàng)目〕湖南省中醫(yī)藥科研基金資助項(xiàng)目（2008035）。

〔收稿日期〕2015-09-28

〔中圖分類號(hào)〕R285.5；R681

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕

doi:10.3969/j.issn.1674－070X.2016.04.003