李樂(lè)，馬瑤，李亭亭，慕雪盼，王苗，劉陶，馬小魁，*（.富平中學(xué)，陜西渭南7700；.藥用資源與天然藥物化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室／西北瀕危藥材資源開(kāi)發(fā)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西西安7000）

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低溫低壓法提取桑黃菌絲體活性多糖

李樂(lè)1，馬瑤2，李亭亭2，慕雪盼2，王苗2，劉陶2，馬小魁2，*
（1.富平中學(xué)，陜西渭南711700；2.藥用資源與天然藥物化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室／西北瀕危藥材資源開(kāi)發(fā)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西西安710100）

摘要：首次通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在低溫低壓條件下提取桑黃菌絲體活性多糖，并利用響應(yīng)面法對(duì)提取條件進(jìn)行了優(yōu)化。在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，分別以多糖得率和其總抗氧化活性為響應(yīng)值，使用Minitab 16軟件對(duì)提取時(shí)間、壓力、液料比進(jìn)行了優(yōu)化，并通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化器對(duì)同時(shí)獲得高活性高產(chǎn)率桑黃多糖的條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果顯示，在提取時(shí)間、壓力和液料比分別為1.8 h、0.059 MPa和52.5∶1（mL/g）的最優(yōu)提取條件下，從桑黃菌絲體中獲得多糖的得率和抗氧化活性（TEAC）分別可達(dá)到4.41%和6.33mM。證實(shí)低溫低壓法提取真菌活性多糖的方法是可行的。

關(guān)鍵詞：旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；低溫低壓法；響應(yīng)面優(yōu)化；多糖得率；抗氧化活性

桑黃又名鮑氏層孔菌（Phellinus igniarius），屬擔(dān)子菌亞門（Basidiomycota）、層菌綱（Hymenomycetes）、非褶菌目（Aphyllophorales）、銹革孔菌科（Hymenochaetaceae）、針層孔菌屬（Phellinus）[1]，具有抗腫瘤[2-3]、抗氧化[4-7]、降血糖[8-9]、消炎[10-12]和增強(qiáng)免疫活性[13-15]等藥理作用。桑黃是在生物抗癌領(lǐng)域中國(guó)際公認(rèn)的效果最佳的藥用菌，也是國(guó)際醫(yī)藥界與保健品行業(yè)抗癌產(chǎn)品生產(chǎn)的原料[16]，市場(chǎng)潛力巨大。但桑黃在自然界中很難形成子實(shí)體，并且人工栽培技術(shù)還不成熟，市場(chǎng)供應(yīng)嚴(yán)重不足。多糖作為桑黃菌的一種非常重要的活性物質(zhì)，具有非常好的藥效作用[17]。桑黃菌絲體多糖提取方法主要有熱水浸提法、超聲破碎法等。郭霞[18]等對(duì)利用熱水提取法、復(fù)合酶法、超聲波提取法等提取桑黃菌絲體多糖的提取條件進(jìn)行了研究。但是，這些方法存在提取溫度高，物理破碎劇烈的缺點(diǎn)，從而導(dǎo)致獲得的多糖活性差，產(chǎn)率低。

響應(yīng)面設(shè)計(jì)法（RSM）是采用多元二次回歸擬合方程以及多種統(tǒng)計(jì)方法分析多因素系統(tǒng)中最佳條件的數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)方法[19]，是建立一個(gè)包括各因素的一次項(xiàng)、平方項(xiàng)和任何兩個(gè)因素之間的一級(jí)交互作用項(xiàng)的數(shù)學(xué)模型，也是目前國(guó)外較廣泛使用的優(yōu)化方法，近年來(lái)在國(guó)內(nèi)也日益受到重視[20-23]。在我們成功建立高效液體培養(yǎng)桑黃菌的基礎(chǔ)上[24-25]，本試驗(yàn)通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀建立了一種低溫低壓法提取桑黃菌絲體高活性多糖的方法，并通過(guò)RSM對(duì)其提取條件進(jìn)行了優(yōu)化。該試驗(yàn)結(jié)果為大規(guī)模利用這一珍稀藥用資源提供了理論和技術(shù)基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

菌種：桑黃（Phellinus sp.P0988），保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，編號(hào)為CCTCC NO：M 2012080。

RE-6000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；JA2603B精密電子天平：上海精科儀器；Epoch超微量微孔板分光光度計(jì)：美國(guó)BioTek。

1.2方法

1.2.1工藝流程

桑黃菌種活化、發(fā)酵→發(fā)酵液→9 000 r/min離心15 min棄上清，取菌絲體→清水沖洗→過(guò)濾除去水分→低溫低壓法提取→收集提取液→濃縮、醇沉→冷凍干燥得到粗多糖

1.2.2桑黃菌絲體多糖提取得率和多糖抗氧化活性（TEAC）測(cè)定

多糖含量的測(cè)定：苯酚-硫酸法[26]，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)得470 nm處標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為：y = 0.001 9x + 0.006 4，R2= 0.990 4。

桑黃多糖得率計(jì)算：桑黃多糖得率/ %=桑黃多糖含量/提取菌絲量×100。

多糖抗氧化活性測(cè)定：使用總抗氧化能力檢測(cè)試劑盒，以Trolox為標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)得734 nm處標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為：y = 0.140 3x + 0.028 9，R2= 0.996 4。

1.2.3單因素及響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀為提取儀器，分別以提取時(shí)間、壓力和液料比3個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)。提取時(shí)間分別設(shè)定為1、2、3、4、5 h；提取壓力分別設(shè)定為0.01、0.03、0.05、0.07、0.09 MPa；液料比分別設(shè)定為：30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1（mL/g）。測(cè)定桑黃菌絲多糖得率及TEAC，每個(gè)試驗(yàn)均設(shè)3個(gè)重復(fù)，結(jié)果取平均值。

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，使用Minitab 16軟件，采用中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)（CCD）的方法分析壓力、液料比、和時(shí)間對(duì)響應(yīng)值的影響，對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，擬合多元二次回歸方程模型，確定提取桑黃菌絲多糖的最佳工藝參數(shù)。多元二次回歸方程模型擬合的性質(zhì)由R2表達(dá)，其統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性由P值檢驗(yàn)。并以Minitab 16軟件的響應(yīng)面優(yōu)化器對(duì)同時(shí)獲得高產(chǎn)率和活性的多糖提取條件進(jìn)行優(yōu)化。

2　結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1提取時(shí)間對(duì)桑黃多糖得率和抗氧化活性的影響

以旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀為提取儀器，分別設(shè)定壓力值為0.05 MPa、液料比為40∶1（mL/g）、提取溫度為60℃，研究提取時(shí)間分別為1、2、3、4、5 h時(shí)對(duì)多糖得率及抗氧化活性的影響，結(jié)果如圖1（A）所示。結(jié)果表明，當(dāng)提取時(shí)間為2 h時(shí)，多糖得率和抗氧化活性均達(dá)到最大。隨著時(shí)間的增加，多糖得率降低，這是由于多糖處于一定溫度的時(shí)間越長(zhǎng)，多糖受到的破壞越大。隨著時(shí)間的增加，抗氧化活性也降低，而這則是由于多糖得率降低造成的。

2.1.2提取壓力對(duì)桑黃多糖得率和抗氧化活性的影響

以旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀為提取儀器，分別設(shè)定時(shí)間值為2h、液料比為40∶1（mL/g）、提取溫度為60℃，研究提取壓力分別為0.01、0.03、0.05、0.07、0.09 MPa時(shí)對(duì)多糖得率及抗氧化活性的影響，結(jié)果如圖1（B）所示。結(jié)果顯示，隨著壓力的增加，多糖得率和抗氧化活性均明顯增加，當(dāng)壓力為0.05 MPa時(shí)，多糖得率和抗氧化活性均達(dá)到最大。隨著壓力的進(jìn)一步增大，均有所降低，這是由于壓力過(guò)大會(huì)使多糖的結(jié)構(gòu)遭到破壞，從而影響多糖得率，造成抗氧化活性也隨之降低，但抗氧化活性變化并不大，這是由于提取溫度相對(duì)較低，使得已獲得的多糖仍具有完整的結(jié)構(gòu)。

2.1.3提取液料比對(duì)桑黃多糖得率和抗氧化活性的影響

以旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀為提取儀器，分別設(shè)定時(shí)間值為2h、壓力為0.05 MPa、提取溫度為60℃，研究提取液料比分別為30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1（mL/g）時(shí)對(duì)多糖得率及抗氧化活性的影響，結(jié)果如圖1（C）所示。結(jié)果顯示，隨著液料比的增加多糖得率明顯增加，抗氧化活性隨著多糖得率的變化而變化，當(dāng)液料比為50∶1（mL/g）時(shí)，多糖得率和抗氧化活性均達(dá)到最大。隨著液料比的進(jìn)一步增大，多糖得率明顯下降，這是由于液料比過(guò)大不利于多糖物質(zhì)的溶出，但抗氧化活性變化不大，這是由于已溶出的多糖仍具有完整的結(jié)構(gòu)。

單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，分別在提取時(shí)間為2 h，提取壓力為0.05 MPa，提取液料比為50∶1（mL/g）時(shí)，桑黃菌絲體多糖提取的產(chǎn)率和抗氧化活性最高。但各個(gè)單因素最優(yōu)條件的簡(jiǎn)單組合并不一定能獲得最高的試驗(yàn)效果[10-12]，這還需要通過(guò)響應(yīng)面設(shè)計(jì)方法進(jìn)一步確定最優(yōu)的提取條件。

圖1　提取時(shí)間、壓力、液料比對(duì)多糖得率和抗氧化活性（TEAC）的影響Fig.1 The effect of individual extraction time，extraction pressure，solvent-solid ratio on polysaccharide yield and TEAC

2.2響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.2.1響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)2.1的單因素試驗(yàn)結(jié)果，以提取時(shí)間（X1）、提取壓力（X2）、提取液料比（X3）為主要因素，選取X1為1、2、3 h，X2為0.03、0.05、0.07 MPa，X3為40∶1、50∶1、60∶1（mL/g）為因素的水平范圍，分別以多糖得率（Y1）和多糖抗氧化活性（Y2）為響應(yīng)值，根據(jù)中心復(fù)合試驗(yàn)（CCD）設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)三因素三水平試驗(yàn)。各因素的低、中、高水平以-1、0、1為編碼設(shè)計(jì)試驗(yàn)，試驗(yàn)因素和水平的編碼如表1所示。CCD試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表2所示。

表1　三因素三水平中心復(fù)合試驗(yàn)因素水平編碼表Table 1 The central composite experiment factor level table of three factors and three levels

表2　CCD試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experimental design and results of CCD test

2.2.2以多糖得率為響應(yīng)值的擬合回歸方程的方差分析

使用Minitab 16分析軟件對(duì)表2中Y1的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)和ANOVA分析，分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表3　以響應(yīng)值為多糖得率擬合回歸方程的方差分析Table 3 ANOVA analysis for regression equation using polysaccharide yield as response values

擬合多糖得率Y1與各自變量關(guān)系的多元二項(xiàng)式回歸方程模型如下：

Y1= 4.42 - 0.018X1+ 0.034X2+ 0.134X3- 0.542X12-0.022 3X22-0.062 3X32+0.04X1X2+0.005X1X3+0.017 5X2X3

式中：Y1為胞外多糖得率；X1、X2、X3分別為提取時(shí)間、提取壓力、提取液料比的編碼值。

以響應(yīng)值為多糖得率擬合回歸方程的方差分析見(jiàn)表3。由方差分析得到模型的回歸系數(shù)為R2=0.985 1，說(shuō)明方程模型與試驗(yàn)數(shù)據(jù)的擬合度為98.51 %，誤差為1.49 %，調(diào)整后的R2adj=0.971 6，說(shuō)明模型和實(shí)際擬合程度較好。P值用于檢驗(yàn)各系數(shù)的顯著性，P值越小，相關(guān)系數(shù)的顯著性越大。由表3可知，各系數(shù)的P< 0.000 1，則此模型具有顯著性和統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而失擬檢測(cè)項(xiàng)（0.592>0.05）不顯著，則不顯著，說(shuō)明回歸方程的擬合非常理想。各因素的交互作用P<0.000 1，說(shuō)明各因素交互作用對(duì)多糖得率的影響顯著。

根據(jù)擬合方程，獲得最佳提取多糖產(chǎn)量的工藝參數(shù)為：提取時(shí)間2.03 h、壓力0.04 MPa、料液比60.2∶1 （mL/g）。此工藝參數(shù)預(yù)測(cè)多糖得率為4.47 %，對(duì)預(yù)測(cè)的工藝參數(shù)和結(jié)果以旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀為提取儀器進(jìn)行3次試驗(yàn)驗(yàn)證，取平均值，測(cè)得多糖得率為4.32 %，SD值為0.27，說(shuō)明以多糖得率為響應(yīng)值的擬合方程預(yù)測(cè)準(zhǔn)確。

2.2.3以多糖抗氧化活性（TEAC）為響應(yīng)值的擬合回歸方程的方差分析

使用Minitab 16分析軟件對(duì)表2中多糖抗氧化活性的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)和ANOVA分析，分析結(jié)果見(jiàn)表4。

表4　以響應(yīng)值為多糖抗氧化活性（TEAC）的擬合回歸方程的方差分析Table 4 ANOVA analysis for regression equation using TEAC as response value

擬合得到多糖抗氧化活性Y2與各自變量關(guān)系的多元二項(xiàng)式回歸方程模型如下：

Y2= 6.15-0.42X1+0.42X2+0.36X3-0.97X12-0.37X22-0.47X32+0.4X1X2+0.375X1X3+0.225X2X3

式中：Y2為多糖抗氧化活性；X1、X2、X3分別為提取時(shí)間、提取壓力、提取液料比的編碼值。

以響應(yīng)值為多糖抗氧化活性（TEAC）的擬合回歸方程的方差分析見(jiàn)表4。由方差分析得到模型的回歸系數(shù)R2=0.977 7，說(shuō)明方程模型與試驗(yàn)數(shù)據(jù)的擬合度為97.77 %，誤差為2.23 %，調(diào)整后的R2adj=0.957 7，說(shuō)明模型和實(shí)際擬合程度較好。P值檢驗(yàn)各系數(shù)的顯著性，由表4可知，各系數(shù)的P<0.000 1，則此模型具有顯著性和統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，失擬檢測(cè)項(xiàng)（0.681>0.05）不顯著，說(shuō)明回歸方程的擬合非常理想。由方差分析得到各因素的交互作用P<0.000 1，說(shuō)明各因素交互作用對(duì)多糖抗氧化活性影響顯著。

根據(jù)擬合方程，獲得較高的多糖抗氧化活性的提取工藝參數(shù)為：提取時(shí)間1.8 h、壓力0.063 MPa、料液比51.5∶1（mL/g）。此工藝參數(shù)預(yù)測(cè)得到的多糖抗氧化活性為6.37 mM，對(duì)預(yù)測(cè)的工藝參數(shù)和結(jié)果以旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀為提取儀器進(jìn)行3次試驗(yàn)驗(yàn)證，取平均值，測(cè)得多糖抗氧化活性為6.21 mM，SD值為±0.35，說(shuō)明以多糖抗氧化活性為響應(yīng)值的擬合方程預(yù)測(cè)準(zhǔn)確。

2.3雙響應(yīng)值優(yōu)化

采用Minitab 16分析軟件優(yōu)化器對(duì)同時(shí)獲得高產(chǎn)率和高活性的多糖提取條件進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。優(yōu)化結(jié)果如圖2所示。

圖2　響應(yīng)優(yōu)化器優(yōu)化圖Fig.2 The optimization plot of response optimizer

當(dāng)響應(yīng)優(yōu)化的合意性達(dá)到0.974 21時(shí)，說(shuō)明優(yōu)化結(jié)果合理。優(yōu)化的最佳工藝參數(shù)為：提取時(shí)間1.8 h、壓力0.059 MPa、料液比52.5∶1（mL/g），預(yù)測(cè)多糖得率可達(dá)到4.37 %，抗氧化活性可達(dá)到6.35 mM。對(duì)預(yù)測(cè)的工藝參數(shù)和結(jié)果以旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀為提取儀器進(jìn)行3次試驗(yàn)驗(yàn)證，取平均值，測(cè)得多糖得率為4.41 %，SD值為±0.31，多糖抗氧化活性為6.33 mM，SD值為±0.26。說(shuō)明對(duì)多糖得率和抗氧化活性的雙響應(yīng)值優(yōu)化的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確。

3　討論

本試驗(yàn)建立了一種從液體培養(yǎng)獲得的桑黃菌絲體中提取桑黃活性多糖的新型提取工藝，即低溫低壓法。在本試驗(yàn)操作中，首次采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀作為提取儀器，集提取和濃縮為一體，并可以大量提取桑黃菌絲體多糖，為獲得大量及高活性的多糖成分提供了試驗(yàn)方法。該方法與傳統(tǒng)提取方法相比，降低了提取溫度，并能在低壓環(huán)境下提取真菌菌絲體多糖。而且本方法在獲得高產(chǎn)量多糖的同時(shí)，可以最大限度的保護(hù)多糖結(jié)構(gòu)，進(jìn)而使獲得的多糖抗氧化活性達(dá)到較高水平，確保所得多糖為高活性多糖。

提取因素及水平對(duì)桑黃菌絲體的多糖得率和抗氧化活性都分別具有一定的影響。為了獲得高產(chǎn)量的活性多糖，本試驗(yàn)在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用Minitab 16分析軟件進(jìn)行CCD試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果先分別以多糖得率和多糖抗氧化能力作為響應(yīng)值擬合多元二次回歸方程，并對(duì)其進(jìn)行方差分析，結(jié)果顯示擬合方程非常理想。然后又同時(shí)以多糖得率和多糖抗氧化活性作為雙響應(yīng)值進(jìn)行優(yōu)化，得到了同時(shí)獲得高產(chǎn)率和活性的最佳優(yōu)化條件的工藝參數(shù)，即提取時(shí)間、壓力和液料比分別為1.8 h、0.059 MPa和52.5∶1（mL/g）。在此提取條件下，經(jīng)過(guò)試驗(yàn)驗(yàn)證，提取的多糖得率和總抗氧化活性分別可達(dá)到4.41 %和6.33 mM。本研究對(duì)桑黃多糖的活性功能的進(jìn)一步研究具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

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Extraction of Active Polysaccharide from Phellinus species by A Low Temperature and Pressure Method

LI Le1，MA Yao2，LI Ting-ting2，MU Xue-pan2，WANG Miao2，LIU Tao2，MA Xiao-kui2，*
（1. Fu Ping High School，Weinan，711700，Shaanxi，China；2. Key Laboratory of Medicinal Resources and Natural Pharmaceutical Chemistry，Ministry of Education/National Engineering Laboratory for Resource Developing of Endangered Chinese Crude Drugs in Northwest of China，College of Life Science，Shaanxi Normal University，Xi'an 710100，Shaanxi，China）

Abstract：The crude polysaccharide with antioxidant activity was firstly extracted from mycelia of Phellinus sp. using a rotary evaporation apparatus under low temperature and low pressure conditions. The extraction conditions including extraction time，pressure and solvent -solid ratio were optimized through response surface method（RSM），in which the individual yield and total antioxidant activity of polysaccharide were chosen as response values. Based on the results of RSM experiments，the response optimizer was further used to simultaneously get high yield and high activity of polysaccharide during extraction. Results showed that the optimum extraction conditions were extraction time 1.8 h，pressure 0.059 MPa，solvent-solid ratio 52.5∶1（mL/g），respectively. The polysaccharide yield and Trolox-Equivalent Antioxidant Capacity（TEAC）reached 4.41 % and 6.33 mM，respectively，under optimum extraction conditions. A new feasible extracting method for crude polysaccharide from mycelia of Phellinus sp. with high yield and high total antioxidant activity has been developed just using a rotary evaporation apparatus.

Key words：the rotary evaporation apparatus；low temperature and pressure method；response surface method；polysaccharide yield，total antioxidant activity

收稿日期：2015-03-03

*通信作者

作者簡(jiǎn)介：李樂(lè)（1988—），女（漢），碩士，研究方向：微生物技術(shù)制藥。

基金項(xiàng)目：陜西省特種資源的開(kāi)發(fā)利用（693102）

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.08.012