李小云, 趙喜玲, 李 琪, 宋丹萍, 曾 慧, 張 宏,*

( 1. 四川師范大學 化學與材料科學學院, 四川 成都 610066; 2. 四川師范大學 生命科學學院, 四川 成都 610101; 3. 四川師范大學 植物資源開發(fā)與應用研究所, 四川 成都 610101; 4. 四川省眉山市動物疾病控制中心, 四川 眉山 620010)

食品中10種色素的高效液相色譜同時檢測方法

李小云1, 趙喜玲1, 李 琪2,3, 宋丹萍4, 曾 慧2, 張 宏1,2*

( 1. 四川師范大學 化學與材料科學學院, 四川 成都 610066; 2. 四川師范大學 生命科學學院, 四川 成都 610101; 3. 四川師范大學 植物資源開發(fā)與應用研究所, 四川 成都 610101; 4. 四川省眉山市動物疾病控制中心, 四川 眉山 620010)

采用高效液相色譜法建立食品中10種黃色色素的檢測方法.甲醇作為溶劑對飲料、糖果、糕點3類樣品進行提取,甲醇(A)-0.02 mol/L乙酸銨溶液(B)-乙腈(C)為流動相,Macherey-Nagel C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)為固定相,柱溫25 ℃,流速1.0 mL/min,波長435 nm,進樣量20 μL.結果顯示,10種色素的線性范圍為0.25～160.0 μg/mL,飲料、糖果、糕點樣品中各色素的加標回收率分別在88.0%～103.6%、88.0%～98.3%、81.4%～106.7%之間.該方法重現(xiàn)性好,靈敏度和準確度高,適用于食品中該10種黃色色素的分析.

食用色素; 非食用色素; 高效液相色譜

在食品加工業(yè)中通常加入各種色素以提高食品的色澤,增加食欲.色素按其用途可分為食用色素和非食用色素.大部分食品中使用較多的是黃色色素.色素使用過程中添加過量、違規(guī)添加等現(xiàn)象時有發(fā)生,某些色素過量攝入會危害健康[1].因此,食品中色素的分析測定顯得尤為重要.

色素的檢測方法主要是液相色譜法[2-4]以及液相色譜-質譜聯(lián)用(LC-MS)[5-6].N. Yoshioka等[7]報道了食品中合成色素的檢測方法,其中大部分為非食用色素.目前檢測食品中合成色素的國家標準,基本以聚酰胺吸附法為樣品前處理方法[8-9],而非食用色素的檢測尚未有較為全面的國家標準.由于國家標準方法《食品中禁用物質的檢測——堿性橙染料》[10]僅規(guī)定了堿性橙Ⅱ、堿性橙21、堿性橙22的分析測定;因此,針對非食用色素的分析檢測還不完善.文獻報道的色素處理方法較為繁雜,而能將樣品前處理簡單化,并且能同時檢測含有天然色素、合成色素和非食用黃色色素的液相色譜方法研究較少.本文將允許添加的合成黃色色素檸檬黃、日落黃以及喹啉黃、天然色素姜黃素和非食用色素酸性間胺黃、堿性嫩黃O、堿性橙2、堿性橙21、堿性橙22、酸性橙Ⅱ等10種黃色色素作為研究對象,建立一種能同時檢測多種色素的高效液相色譜法.

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器 檸檬黃(CAS:1934-21-0)、日落黃(CAS:2783-94-0)、酸性間胺黃(CAS:587-98-4)均購于AccuStandard公司,喹啉黃(CAS:8004-92-0)、姜黃素(CAS:458-37-7)、酸性橙Ⅱ(CAS:633-96-5)、堿性嫩黃O(CAS:2465-27-2)均購于Dr.Ehrenstorfer GmbH公司,堿性橙2(CAS:532-82-1)、堿性橙21(CAS:3056-93-7)、堿性橙22(CAS:4657-00-5)購于北京振翔工貿有限公司,甲醇、乙腈(均為色譜純)購于美國BRC公司,其余試劑(分析純)購于科密歐試劑有限公司.

PDA-100液相色譜儀(美國戴安公司),Direct-Q 5型超純水儀(美國Millipore公司),Buchi R-3型旋轉蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠),BP211D型十萬分之一電子天平(德國賽多利斯公司).

1.2 色譜條件 色譜柱:Macherey-Nagel C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);進樣量:20 μL;柱溫:25 ℃;流速:1.0 mL/min;檢測波長:435 nm;流動相:甲醇(A)、0.02 mol/L乙酸銨溶液(B)、乙腈(C);各流動相梯度洗脫的體積分數(shù)見表1.

1.3 實驗方法

1.3.1 標準品溶液制備 準確稱取各色素標準品50.0 mg于25 mL容量瓶中,甲醇溶解并定容,作為質量濃度為2.0 mg/mL的各單色素標準儲備液,待用.取各單標色素的標準儲備液4 mL至50 mL容量瓶,甲醇定容,得到質量濃度160 μg/mL混合儲備液,待用.

表 1 各流動相梯度洗脫的體積分數(shù)

1.3.2 樣品溶液制備 稱取飲料樣品20.0 g,旋至近干,加入20 mL甲醇,超聲20 min,離心15 min,取上層清液旋蒸至近干,甲醇定容至10 mL,溶液過0.45 μm濾膜,待測.

糖果樣品稱取2.5 g,超純水加熱溶解后,加入10 mL甲醇,超聲30 min,離心15 min,取上層清液,剩余殘渣重復上述操作1次,合并2次提取液旋蒸至近干,甲醇定容至20 mL,溶液過0.45 μm濾膜,待測.

糕點、冰淇淋樣品稱取2.5 g,先加入10 mL石油醚,充分攪拌后倒出溶液,再向殘渣加入5 mL石油醚,攪拌后除去油脂干燥.再向樣品中加入30 mL甲醇,超聲20 min,離心15 min,取上層清液,剩余殘渣重復上述操作2次,合并3次提取液旋蒸至近干,甲醇定容至10 mL,溶液過0.45 μm濾膜,待測.

1.3.3 線性范圍的建立 取一定體積的混標儲備液分別配制成質量濃度為0.25、0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、40.0、60.0、100.0、160.0 μg/mL的混合標準液,在1.2色譜條件下進行分別測定.

1.3.4 精密度的考察 分別取0.25、10和100 μg/mL低、中、高3個質量濃度混合標準溶液按1.2項下色譜條件連續(xù)平行測定6次.

1.3.5 穩(wěn)定性的考察 飲料、糖果和糕點樣品各取1份,分別加入低質量濃度0.25 μg/mL混標液,樣品按1.3.2項方法處理后,按1.2所述色譜條件分別在0、6、12、24和48 h進樣分析.

1.3.6 重現(xiàn)性的考察 各取飲料、糖果和糕點樣品6份,分別加入質量濃度0.25 μg/mL的混合標液,按1.3.2項方法制備樣品溶液,按1.2項色譜條件進行分析,測定峰面積,計算出10種色素的質量濃度及RSD值.

1.3.7 回收率的測定 分別稱取9份飲料樣品20.0 g、糖果樣品2.5 g和糕點樣品2.5 g,根據(jù)1.3.2項樣品處理,飲料、糖果和糕點樣品中添加0.25、10和40 μg/mL的低、中、高3個質量濃度的混合標準工作液.按1.2項色譜條件測定,計算9次的平均回收率.

1.4 樣品的測定 分別準確稱取2.50 g的糖果和糕點樣品,稱取20.0 g飲料樣品.按1.3.2所述的前處理方法和1.2所述色譜條件對樣品進行提取和色譜分析.

2 結果與討論

2.1 色譜條件的確定

2.1.1 檢測波長的選擇 分別對10種色素在波長190～800 nm范圍內采集紫外光譜圖,其中日落黃、酸性橙Ⅱ、堿性橙21、堿性橙22等4種色素的最大吸收波長在490 nm左右,同時在430 nm左右也都有一定的紫外吸收,其余6種色素的最大吸收波長均在430 nm左右,綜合各種色素的最大吸收波長,最后選擇435 nm作為檢測波長,在此波長下每個色素均能被檢測.

2.1.2 流動相的選擇 試驗選擇比較了甲醇-水體系、甲醇-緩沖鹽體系共5種溶液.結果發(fā)現(xiàn):流動相僅使用甲醇-水溶液時,10種色素很難完全分離;使用甲醇-乙酸銨溶液作為流動相時,10種色素能實現(xiàn)基本分離;但堿性橙21、酸性橙Ⅱ和堿性橙2等3種色素保留時間較接近.當加入少量乙腈時,分離效果更好,堿性橙21和酸性橙Ⅱ能實現(xiàn)完全分離.故選擇甲醇-乙腈-0.02 mol/L乙酸銨溶液組成流動相體系.

2.1.3 pH的選擇 試驗分別比較了10種色素在pH=5.0、7.1、5.8時的分離情況.結果表明:在pH=5.8時,10種組分分離效果較理想;在pH=5.0時,日落黃、檸檬黃不能被很好地洗脫下來,部分色譜峰完全重疊;在pH=7.1時,喹啉黃與雜質峰完全重疊,堿性嫩黃O與堿性橙21、堿性橙21與酸性橙Ⅱ、堿性橙22與姜黃素不能達到完全分離.故選取pH=5.8的0.02 mol/L乙酸銨溶液.

2.1.4 流速的選擇 試驗分別考察流速為0.8、1.0、1.2 mL/min時10種混合標準物質的出峰情況.當流速為0.8 mL/min時,堿性橙21和酸性橙Ⅱ之間未能實現(xiàn)完全分離;流速為1.0 mL/min時,各組分之間均能實現(xiàn)完全分離,且分離度大于1.5;流速為1.2 mL/min時,堿性橙21和酸性橙Ⅱ分離度未達到1.5以上.綜合考慮最終確定流速為1.0 mL/min.

2.1.5 柱溫的選擇 本試驗分別考察了20、25、30 ℃對10種色素分離情況的影響.結果表明:柱溫在20 ℃時酸性橙Ⅱ和堿性橙2分離度未能達到1.5以上.柱溫為25 ℃時,各組分均能實現(xiàn)完全分離,分離度在1.6以上.柱溫在30 ℃時,堿性橙21與酸性橙Ⅱ色譜峰完全重疊,堿性橙2包含雜質峰.綜合考慮選擇最適宜的柱溫為25 ℃.

2.2 方法學的驗證

2.2.1 線性范圍的建立 在選定的最佳條件下,10種色素的線性范圍、線性方程、相關系數(shù)、檢出限(S/N=3)、定量限(S/N=10)見表2.該10種色素在質量濃度0.25～160 μg/mL范圍內線性關系良好.

表 2 10種色素的線性范圍、線性方程、相關系數(shù)和檢出限(n=3)

2.2.2 精密度 10種色素的標準溶液在1.2色譜條件下測定峰面積,計算RSD值,10種色素的RSD值均小于5%;結果表明精密度良好.

2.2.3 穩(wěn)定性 按1.2所述色譜條件分別在0、6、12、24、48 h進樣分析.結果表明:飲料、糖果和糕點樣品中色素的質量濃度隨時間無明顯變化,表明樣品在48 h內穩(wěn)定性良好.

2.2.4 重復性 按1.2所述色譜條件進行分析,飲料、糖果和糕點樣品中色素的RSD值在1.5%～4.9%范圍內(n=6),結果表明本實驗方法重復性良好.

2.2.5 回收率的測定 按1.2項色譜條件平行測定3次,計算各樣品的回收率.飲料、糖果、糕點樣品中各色素的加標回收率分別在88.0%～103.6%、88.0%～98.3%、81.4%～106.7%之間.結果表明本實驗方法數(shù)據(jù)準確,此方法可行.

2.3 樣品處理方法的確定

2.3.1 提取溶劑的選擇 試驗選取了甲醇、甲醇-丙酮、乙腈-正己烷、乙醇-氨水-水(質量濃度比為：80∶1∶19,下同)4種提取溶劑作為比較.考察加入混標的飲料樣品均能提取出色素.其中甲醇和乙醇-氨水-水的提取效果比甲醇-丙酮、乙腈-正己烷好,樣品經測定后發(fā)現(xiàn)甲醇溶劑能把10種色素全部提取出來,并且雜峰少;乙醇-氨水-水溶劑提取出的色素在檸檬黃的保留時間處有干擾峰.

考察含有混標的糖果樣品,甲醇和乙醇-氨水-水溶劑提取效果較為理想,其中甲醇提取的10種色素能實現(xiàn)較好的分離.乙醇-氨水-水提取的色素,未檢測到姜黃素,且酸性橙Ⅱ和堿性橙的峰重疊.

考察加入混標的糕點樣品時,甲醇和甲醇-丙酮溶劑提取后,溶液澄清,經檢測甲醇-丙酮提取溶劑的提取效果比甲醇溶劑的提取效果稍差.綜合考慮,本實驗選取甲醇作為飲料、糖果、糕點樣品的提取溶劑.

2.3.2 提取體積的考察 實驗以甲醇為提取溶劑,當飲料樣品提取體積為20 mL時,提取的檸檬黃質量濃度最高.提取體積逐漸增大時,其質量濃度有所降低.糖果樣品中檸檬黃的提取量隨提取體積的增加呈下降趨勢.糕點樣品在提取體積增加到30 mL時,提取效果明顯增加;繼續(xù)增大提取體積時,提取結果有所下降.綜合考慮,飲料、糖果樣品的提取體積為20 mL,糕點樣品的提取體積為30 mL,結果見圖1.

2.3.3 提取次數(shù)的考察 實驗分別考察了1～4次不同提取次數(shù)對添加有檸檬黃色素的飲料、糖果和糕點3種樣品提取效果的影響,結果見圖2.結果表明飲料樣品的提取效果隨提取次數(shù)增加呈小幅下降.糖果樣品分別提取2和3次,提取的檸檬黃質量濃度基本一致,當增加到提取4次后,檸檬黃質量濃度降低;糕點樣品隨著提取次數(shù)增加呈上升狀態(tài),當提取次數(shù)達到3次以上,檸檬黃質量濃度不再增加.故飲料樣品提取1次,糖果樣品提取2次,糕點樣品提取3次.

2.3.4 提取時間的考察 實驗考察了10、20、30和40 min不同提取時間對添加有檸檬黃色素的飲料、糖果和糕點樣品提取效果的影響,結果見圖3.當飲料和糕點樣品提取時間為20 min時,檸檬黃質量濃度達到最大值,此后隨時間的增加而減小.糖果樣品中檸檬黃質量濃度隨提取時間的增加呈先增大后減小的趨勢,當提取時間為30 min時檸檬黃達到最大值.因此,確定飲料和糕點樣品的提取時間為20 min,糖果樣品為30 min.

2.4 樣品測定及結果 在最佳實驗條件下,對樣品進行分析測定,實驗結果見圖4.飲料、糖果、糕點樣品檢測結果表明,碳酸飲料基本都含有檸檬黃和日落黃色素中的1種或2種,小部分果蔬汁飲料檢測含有少量檸檬黃或日落黃.絕大多數(shù)糖果含有檸檬黃,糕點樣品的餡兒料中多添加有檸檬黃或日落黃2種人工合成色素,樣品中均未檢測到超標或違法添加非食用色素的產品.

3 討論

本文在實驗中選用Kromasil C18柱、Macherey-Nagel C18色譜柱進行比較.2種色譜柱初始時都能對10種色素實現(xiàn)良好地分離,但Kromasil C18色譜柱使用一段時間后柱效明顯下降,而Macherey-Nagel C18色譜柱則表現(xiàn)出良好的性能,并且各色素之間的分離度良好,故選擇Macherey-Nagel C18色譜柱.

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[10] 食品中禁用物質的檢測-堿性橙染料高效液相色譜法:GB/T 23496—2009[S]. 北京:中國標準出版社,2009.

(編輯 余 毅)

Simultaneous Determination of 10 Pigments in Food Samples by HPLC

LI Xiaoyun1, ZHAO Xiling1, LI Qi2,3, SONG Danping4, ZENG Hui2, ZHANG Hong1,2

( 1. College of Chemistry and Materials Science, Sichuan Normal University, Chengdu 610066, Sichuan; 2. College of Life Science, Sichuan Normal University, Chengdu 610101, Sichuan; 3. Development and Application Institute of Plant Resources, Sichuan Normal University, Chengdu 610101, Sichuan; 4. Meishan Center for Animal Disease Prevention and Control, Meishan 620010, Sichuan)

To establish a method for simultaneous determination 10 kinds of yellow pigments in food with high performance liquid chromatography (HPLC). The pigments were extracted with methanol from drinks, candy and cake samples. The HPLC detection conditons were methanol (A), 0.02 mol/L ammonium acetate solution (B), acetonitrile (C) as the mobile phase gradient, Macherey-Nagel C18 column (4.6 mm×250 mm, 5 μm) as the stationary phase, column temperature 25 ℃, the flow rate 1.0 mL/min, detection wavelength 435 nm, injection volume 20 μL. The linear range of 10 kinds of pigment were 0.25～160.0 μg/mL, and the recoveries in drinks, candy, cakes samples were 88.0%～103.6%, 88.0%～98.3%, 81.4%～106.7%. This method showed good reproducibility, sensitivity and accuracy and it could be applied for determination of 10 kinds of yellow pigments in food.

food coloring; non-food coloring; HPLC

2016-01-03

四川省教育廳青年基金(2006B035)和四川省攀枝花市科技局重點項目(2008CY-S-1)

O657.72

A

1001-8395(2016)06-0895-05

10.3969/j.issn.1001-8395.2016.06.022

*通信作者簡介:張 宏(1965—),女,教授,主要從事天然產物開發(fā)與應用的研究,E-mail:Zhanghong651@aliyun.com