●張玲張昕

藥物建立大鼠心衰惡病質(zhì)模型

●張玲1張昕2

目的：是通過異丙腎上腺素建立能夠代表心衰惡病質(zhì)特征的大鼠模型。方法：100只雄性SD大鼠隨機(jī)分成異丙腎上腺素（ISO）組和對(duì)照組，ISO組大鼠共30只注射ISO（250mg/kg·d），隔日一次，共2次；對(duì)照組（n=10），注射等體積9g/L·d生理鹽水。4周后超聲心動(dòng)圖檢測存活大鼠的左室舒張末期內(nèi)徑（LVEDD）、左室收縮末期內(nèi)徑（LVESD）、左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）。結(jié)果：ISO組模型成功率60%；（2）超聲心動(dòng)圖：與對(duì)照組相比，ISO組LVEDD、LVESD顯著增大（P ＜0.05），LVEF降低（P ＜0.05），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；結(jié)論：應(yīng)用異丙腎上腺素建立大鼠心衰惡病質(zhì)模型是較為方便、可行的方法。

心衰；惡病質(zhì)；動(dòng)物模型

流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)CHF患者中有10-16%合并有惡病質(zhì)的發(fā)生，其中50%患者將在18個(gè)月內(nèi)死亡，心衰惡病質(zhì)是慢性心衰患者死亡的一個(gè)很強(qiáng)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[1]。然而，其發(fā)生機(jī)制目前尚未明晰，臨床上所能采取的應(yīng)對(duì)措施也非常有限。異丙腎上腺素是常用的建立擴(kuò)張型心肌病大鼠模型的藥物，其主要的藥理作用是通過激動(dòng)心肌細(xì)胞上的β1型腎上腺素受體，引起心肌細(xì)胞的強(qiáng)烈收縮造成心肌細(xì)胞缺血、損傷和斷裂[2]。我們研究的目的是通過異丙腎上腺素建立能夠代表心衰惡病質(zhì)特征的大鼠模型，將對(duì)心衰惡病質(zhì)發(fā)生機(jī)制和治療方法的研究具有重要的理論價(jià)值和臨床意義。

1 材料與方法

1.1 心衰惡病質(zhì)大鼠模型的建立

選用清潔級(jí)10-12周齡雄性Sprague-Dawey(SD)大鼠40只，體重280-300g，由內(nèi)蒙古大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。按照內(nèi)蒙古實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)管理標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行，飼料（北京科澳協(xié)力飼料有限公司提供）為標(biāo)準(zhǔn)柱狀飼料。動(dòng)物分籠飼養(yǎng)于有空氣過濾系統(tǒng)的安靜環(huán)境中，籠中墊3mm的鋸末墊料，室溫維持在20-25℃，大鼠正常進(jìn)食與活動(dòng)。鹽酸異丙腎上腺素（ISO，由大連美侖生物有限公司提供）。所有動(dòng)物于我院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)抽取90只腹股溝皮下注射ISO建立心衰模型（250mg/ kg·d）。其余10只大鼠，注射等體積9g/L·d生理鹽水，作為對(duì)照組。注射ISO的方法：用0.9%生理鹽水溶解粉劑ISO，終濃度為20mg/ml，按三個(gè)劑量級(jí)，隔日一次，共2次注射到大鼠腹股溝皮下，為了避免皮膚壞死，第二次換作另一側(cè)進(jìn)行注射，所有大鼠用藥后正常進(jìn)食和活動(dòng)，飼養(yǎng)4周。心衰惡病質(zhì)模型成功的標(biāo)準(zhǔn)：心衰模型建立成功的基礎(chǔ)上體重較藥物處理前降低6%以上[3】

1.2 一般情況觀察

注射藥物后觀察大鼠的皮毛顏色、進(jìn)食、活動(dòng)等，記錄大鼠的死亡情況。

1.3 模型成功的評(píng)價(jià)方法

1.3.1 超聲心動(dòng)圖檢查

注射藥物后清潔環(huán)境下飼養(yǎng)大鼠4周后行超聲心動(dòng)圖檢查，10%的水合氯醛腹腔注射進(jìn)行麻醉，取仰臥并固定其四肢和頭部于干凈木板上。剪除胸部體毛，用S4-2高頻探頭飛利浦HD11XE彩色超聲診斷儀，在二維超聲引導(dǎo)下，選取左室乳頭肌短軸切面進(jìn)行檢查。測量指標(biāo)包括左室舒張末期內(nèi)徑（LVEDD）、左室收縮末期內(nèi)徑（LVESD）、左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）及短軸縮短率（FS），每只大鼠測5個(gè)心動(dòng)周期，取其平均值。

1.3.2 組織病理學(xué)檢查

取大鼠心肌組織，用冰生理鹽水沖洗2遍，快速置于AF液中固定后常規(guī)石蠟包埋，行Masson’s染色，光鏡下觀察其心肌細(xì)胞組織學(xué)形態(tài)變化。

1.3.3 體重變化

所有大鼠注射藥物前及注射后4周分別記錄體重。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物的一般情況

注射藥物后ISO組30只大鼠死亡10只，死亡率33.3%；而對(duì)照組的10只大鼠均沒有死亡。與對(duì)照組相比，ISO組大鼠大部分出現(xiàn)口唇紫紺，口中出現(xiàn)血性分泌物，皮毛發(fā)黃無光澤，活動(dòng)量明顯減少，體重?zé)o明顯增加。

2.2 動(dòng)物模型的評(píng)價(jià)

2.2.1 超聲心動(dòng)圖結(jié)果

所有注射ISO的大鼠與對(duì)照組相比， LVEDD、LVESD顯著增大（P ＜0.05），LVEF、顯著降低（P ＜0.05），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見表1及圖1）；LVEF明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見表1及圖1）。

表1 ISO不同劑量組心功能比較（s）

表1 ISO不同劑量組心功能比較（s）

注：#示與對(duì)照組比較P＜0.05；▲示與中等劑量組比較P＜0.05；＊示與低劑量組比較P＜0.05

組別LVEDD（mm）LVESD（mm）LVEF（%）對(duì)照組（n=10）82.98+2.81 ISO組（n=20）5.75+0.982.98+0.47 7.36+1.12#*4.45+1.24#*56.34+10.32#*

2.2.2 心肌組織病理學(xué)觀察

Masson’s染色檢查發(fā)現(xiàn)，ISO組肌纖維排列紊亂，心肌細(xì)胞肥大且可見壞死消失，被大量纖維組織所取代（見圖1，左圖為對(duì)照組，右圖為ISO組）。

2.2.3 體重變化

注射藥物前ISO組與對(duì)照組間體重?zé)o顯著差異（P＞0.05）；注射藥物4周后ISO組中發(fā)生心衰惡病質(zhì)大鼠有12只，模型成功率40%。

圖1 對(duì)照組（左）與注射ISO組（右）動(dòng)物心肌組織的Masson’s染色（×100），綠色染色為纖維組織

3 討論

本研究的目的是建立大鼠心衰惡病質(zhì)模型，探索最佳的異丙腎上腺素劑量，并檢測該模型大鼠各項(xiàng)生化指標(biāo)的變化情況。心衰惡病質(zhì)是心衰后期出現(xiàn)的營養(yǎng)不良綜合征，要想建立心衰惡病質(zhì)模型，首先需建立大鼠心衰模型。目前在實(shí)驗(yàn)研究中，大鼠心衰模型常用的建立方法有藥物注射法（異丙腎上腺素[4]、阿霉素等）、結(jié)扎冠脈法、心臟超負(fù)荷法等[5]。大量的研究表明，通過小劑量長時(shí)間注射異丙腎上腺素（ISO）建立心衰模型模型成功率高，大鼠死亡率低且操作簡單易行，但時(shí)間較長，重復(fù)性較差[6]；我們應(yīng)用250mg/kg·d ISO連續(xù)2d建立心衰模型，動(dòng)物L(fēng)VEDD擴(kuò)大、LVEF明顯降低。本研究在使用ISO誘導(dǎo)建立心衰模型過程中發(fā)現(xiàn)，注射ISO后12小時(shí)內(nèi)大部分大鼠出現(xiàn)口唇紫紺，口中出現(xiàn)血性分泌物，皮毛發(fā)黃無光澤，活動(dòng)量明顯減少，死亡10只，死亡率為 33%。通過超聲心動(dòng)圖檢查發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，ISO組LVEDD、LVESD顯著增大，LVEF、FS顯著降低，說明大鼠心臟擴(kuò)大，心臟收縮、舒張功能明顯受到損害。心肌組織Masson’s染色顯示心肌細(xì)胞壞死消失，由大量纖維組織所取代，進(jìn)一步證實(shí)了心衰模型建立成功。根據(jù)心衰惡病質(zhì)診斷標(biāo)準(zhǔn)，在心衰模型建立成功的前提下，其體重下降超過6%者才符合[7]。實(shí)驗(yàn)中所選大鼠在注射藥物前體重相當(dāng)，注射藥物4周后發(fā)現(xiàn)ISO組有12只大鼠體重較對(duì)照組下降超過6%，我們將其歸為心衰惡病質(zhì)組，其余8只歸為心衰非惡病質(zhì)組，說明心衰后期部分大鼠合并有惡病質(zhì)的發(fā)生。綜上所述，應(yīng)用異丙腎上腺素建立大鼠心衰惡病質(zhì)模型是較為方便、可行的方法。

（作者單位：1內(nèi)蒙古滿洲里市南區(qū)醫(yī)院；2包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院）

[1]Palus S, Schur R, Akashi YJ, et al. Ghrelin and its analogues, BIM-28131 and BIM-28125, improve body weight and regulate the expression of MuRF-1 and mafbx in a ratheart failure mode. PLoS One, 2011, 6:1-2.

[2]Teerlink JR, Pfeffer JM, Pfeffer MA. Progressive ventricular remodeling in response to diffuse isoproterenol-induced myocardial necrosis in rats. Circ Res, 1994, 75:105-13.

[3]Tanada Y, Shioi T, Kato T, et al. Branched-chain amino acids ameliorate heart failure with cardiac cachexia in rats.Life Sci, 2015,137:20-7

[4]Haidara MA, Assiri AS, Yassin HZ, et al. Heart Failure Models: Traditional and Novel Therapy. Curr Vasc Pharmacol, 2015, 13:658-69

[5]熊愛琴,馬萍,劉俊梅,等.瑞舒伐他汀對(duì)慢性心力衰竭大鼠的心臟保護(hù)作用及其對(duì)非對(duì)稱二甲基精氨酸代謝通路的影響.中國循環(huán)雜志，2014,29:743-47

[6]康文慧，馬元，羅明.兩種劑量異丙腎上腺素制備心衰大鼠模型心功能的比較.同濟(jì)大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2009,30:50-53

[7]Okoshi MP,Romeiro FG,Paiva SA, et al. Heart failure-induced cachexia. Arq Bras Cardiol,2013,100:476-482.

張昕