涂青松，何剪太

（中南大學(xué)湘雅醫(yī)院，湖南長沙410008）

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過氧化物酶1對人肝癌細胞HepG2細胞皮下移植瘤生長的影響

涂青松，何剪太

（中南大學(xué)湘雅醫(yī)院，湖南長沙410008）

摘要：目的探討過氧化物酶1（Prx 1）在肝癌形成和惡性進展中的作用。方法蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測遠癌肝組織和近癌肝組織中Prx 1、pAkt及Akt表達差異。肝細胞饑餓培養(yǎng)24 h后，10 ng/ml表皮生長因子（EGF）處理10 min，提取總蛋白，Western blot檢測Prx 1、pAkt、不同位點磷酸化表皮生長因子受體（EGFR）和總EGFR。Western blot檢測檢測未處理組、轉(zhuǎn)染無義shRNA組及轉(zhuǎn)染Prx 1 shRNA組HepG2細胞中Prx 1蛋白的表達。DCFH-DA法檢測3種HepG2細胞中活性氧簇總量。轉(zhuǎn)染無義shRNA組及轉(zhuǎn)染Prx 1 shRNA組HepG2細胞皮下注射至SCID小鼠，注射后每周測量1次皮下腫瘤體積。Western blot檢測兩組小鼠皮下腫瘤組織中Prx 1和pAkt的表達情況。結(jié)果與正常肝細胞比較，Prx 1在肝轉(zhuǎn)化細胞中表達升高。Prx 1增強了EGF介導(dǎo)的EGFR和Akt激活。Prx 1表達沉默抑制了HepG2體內(nèi)成瘤能力。減少HepG2皮下移植瘤的肝轉(zhuǎn)移。Prx 1表達沉默還抑制了Akt體內(nèi)激活。結(jié)論Prx 1具有調(diào)控人肝細胞中EGFR介導(dǎo)信號通路的潛在作用。Prx 1能夠通過EGFR-Akt信號通路介導(dǎo)細胞正常至異常轉(zhuǎn)化、腫瘤形成及轉(zhuǎn)移

關(guān)鍵詞：過氧化物酶1；肝癌；移植瘤

全球原發(fā)性肝癌（以下簡稱肝癌）發(fā)病率及死亡率呈逐年上升趨勢。盡管不斷有新的肝癌治療手段應(yīng)用于臨床，但是近幾十年來肝癌患者5年期生存率仍未見明顯提高[1]。由于早期肝癌患者的生存率明顯好于晚期肝癌患者，早期檢測腫瘤惡變前損傷是減少肝癌發(fā)病率和致死率的有效方法[1]。因此，研發(fā)新的檢測手段提高肝癌的早期檢出率是肝癌研究十分緊迫的工作。

過氧化物酶（peroxiredoxin，Prx）是具有過氧化物酶活性的巰基特異性抗氧化蛋白[2]。Prx 6個家族成員中，Prx1在包括肺癌在內(nèi)的多種人類腫瘤中表達異常增加[3-4]。本研究主要分析正常肝細胞和肝癌前病變細胞中過氧化物酶1（peroxiredoxin 1，Prx 1）的表達情況，探討Prx1通過表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）/Akt信號通路肝癌前病變細胞生長增殖情況。此外，本課題還在肝癌移植瘤模型中證實了Prx 1對腫瘤生長和惡性轉(zhuǎn)化的影響。本研究結(jié)果表明肝癌前病變細胞中Prx 1表達增加，Prx 1能夠促進肝癌前病變細胞中表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）表達，并激活EGFR/Akt信號通路，移植Prx 1表達能夠抑制肝癌移植瘤模型中腫瘤生長和轉(zhuǎn)移。

1　材料與方法

1.1細胞培養(yǎng)和EGF處理

在含10%（v/v）小牛血清、100 u/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)人正常肝細胞株L02和CCL13細胞。所有細胞在37℃下含5%二氧化碳CO2和95%空氣的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞血清饑餓24 h后，用含10 ng/ml EGF的無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)10 min。立即收獲細胞并對其進行冷凍以用于后續(xù)實驗。

1.2活性氧（reactive oxygen species，ROS）形成檢測

使用二氯二氫熒光素-乙酰乙酸酯（2’，7’-Dichlorofluorescin diacetate，DCFH-DA）熒光染料分析細胞提取物中ROS形成速率。DCFH-DA通過與ROS反應(yīng)氧化為二氯熒光素（fluorescent dichlorofluorescein，DCF）。從485 nm激發(fā)波長和530 nm發(fā)射波長上的熒光增加斜率計算ROS形成速率，使用標(biāo)準(zhǔn)DCF校正。

1.3肝組織活檢

肝組織活檢鉗，檢查肝癌患者血常規(guī)、肝功能、凝血酶原時間和活動度、B超、心電圖，對患者進行屏氣動作訓(xùn)練。B超術(shù)前定位，取右腋中線第8～9肋間或腋前線第9～10肋間隙為穿刺點，于患者深呼氣末屏氣時采用16號活檢槍，1 s負壓吸取肝組織，標(biāo)本放入10%甲醛中固定、石蠟包埋，常規(guī)做蘇木精一伊紅（HE）染色、Masson及網(wǎng)狀纖維染色，視臨床病情需要加做免疫組織化學(xué)及特殊染色。術(shù)后予束腹帶包扎4 h，臥床休息8 h，監(jiān)測血壓、脈搏，1周內(nèi)避免劇烈活動。

1.4肝細胞原代培養(yǎng)

肝組織活檢取下標(biāo)本后，立即置入含青霉素（100 u/ml），鏈霉素（100μg/ml）的無血清DMEM培養(yǎng)基內(nèi)，并于1 h內(nèi)處理。組織塊置于培養(yǎng)皿中，加入DMEM液，用眼科剪將不需要的血塊和組織（壞死組織或結(jié)締組織等）除去，再用DMEM液漂洗兩次后剪成約1mm3大小，加入1g/L膠原酶Ⅵ消化液37℃消化30 min，細胞懸液紗布過濾，1 000 r/min5 min離心2次，棄上清；800 r/min 4 min離心2次，棄上清，每次以DMEM液重懸沉淀。細胞沉淀重懸于含100 ml/L FBS的DMEM中，測細胞活力，以>1×109個/L的濃度接種于25 ml培養(yǎng)瓶，50 ml/L二氧化碳CO2培養(yǎng)箱37℃孵育。24 h后換液，去除未貼壁細胞，加入DMEM液（含10 mg/L胰島素，1 mmol/L谷氨酰胺，100 u/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素，100 ml/L FBS）。37℃50 ml/L二氧化碳CO2培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)。每兩天半換液，每天倒置顯微鏡觀察，成纖維細胞通過反復(fù)貼壁分離法、機械刮除法去除，得到純化的表皮樣生長細胞，每3天傳代1次。

1.5Prx 1短發(fā)卡RNA表達載體的構(gòu)建

本研究構(gòu)建了表達短發(fā)卡RNA（shRNA）的含人類u6啟動子的自失活逆轉(zhuǎn)錄酶病毒表達載體。BamHⅡ/HindⅢ雙酶切MSCV表達質(zhì)粒和pMSCV-EGFP-Neo載體，雙酶切獲得片段鏈接重組，將識別Prx1或錯義序列的短發(fā)卡RNA重組至pMSCV-EGFP-Neo載體。Prx1 shRNA能夠識別人類Prx1 cDNA（NM002574）的474-492堿基對。寡核苷酸對的序列為：5'-GATCCGTTCTCACTTCTGTATCT ATTCAAGAGATAGATGACAGAAGTGAGAATTTTT TGGAAA-3'和5'-AGCTTTTCCAAAAAATTCTCACT TCTGTCATCTATCTCTTGAATAGATGACAGAATGA GAAC-3'。錯義序列為：5'-GATCCCGTTCTCCGAAC GGTGCACGTTTCAAGAGAACGTGCACCGTTCGGA GAATTTTTTGGAAA-3'和5'-AGCTTTTCCAAAAAATTCTCCGAACGGTGCACGTTCTCTTGAAACGTGCA CCGTTCGGAGAACGG-3'。采用ABI 3700毛細管測序儀（Applied Biosystems）確認序列準(zhǔn)確性。

1.6構(gòu)建穩(wěn)定表達細胞株

使用Lipofectamine 2000試劑將Prx 1或錯義shRNA表達載體轉(zhuǎn)染至Phoenix包裝細胞。48 h后，收集上清液，0.45μm濾膜過濾，并于-80℃冰箱保存。將過濾后的Prx 1或錯義shRNA病毒上清液與4μg/ml凝聚胺（脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染增強劑）分別共同感染HepG2細胞。連續(xù)2 d每8 h將新鮮的病毒上清液加入到細胞中。含有2μg/ml嘌呤霉素的生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)10 d，選取感染成功細胞用于后續(xù)實驗。

1.7蛋白質(zhì)印跡分析（Western blot）

棄去培養(yǎng)皿中DMEM培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）輕柔洗滌去除雜質(zhì)，按每皿50 L加入含2%苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）的蛋白裂解液，冰上裂解5 min，收集裂解產(chǎn)物超聲破碎10 min后4℃12 000 rpm離心30 min。收集上清蛋白液，采用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法對蛋白含量定量后備用。定量過的樣品按每泳道30 g蛋白含量進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，結(jié)束后用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉室溫下封閉1 h，加入一抗（兔抗小鼠Prx 1，1∶2000；β-actin，l∶1 000；兔抗小鼠p-Akt，1∶500），4℃過夜。山羊抗兔二抗（1∶20 000）室溫下1 h，化學(xué)法發(fā)光，壓片后分析結(jié)果。最后用SPSS 18.0圖像分析系統(tǒng)測定各條帶灰度值。

1.8體內(nèi)成瘤實驗及肝轉(zhuǎn)移瘤確定

將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的各組細胞用0.25%的胰酶消化，并將細胞濃度調(diào)整為106/ml，將500μl細胞懸液注射至非肥胖糖尿病/重癥聯(lián)合免疫缺陷（NOD/SCID）小鼠背部皮下。8周后引頸處死，分離腫瘤組織，并測量腫瘤組織體積，腫瘤組織制作成冷凍切片用于免疫熒光分析。使用游標(biāo)卡尺每周2次測量分析腫瘤生長情況，腫瘤體積由公式（長度×寬度2）/2估算。

注射腫瘤細胞后8周后將小鼠處死。將每只小鼠的肝臟從周圍組織中剖離，之后將肝臟橫切。通過氣管注射墨汁直至肝臟染黑。隨后將肝臟切開，隨后將標(biāo)本放置在Fekete溶液中24 h漂白肝臟表明腫瘤結(jié)節(jié)。對比染色形成白色肝臟轉(zhuǎn)移瘤和黑色正常肝臟組織之間的明確區(qū)分。

1.9統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計學(xué)軟件包進行數(shù)據(jù)處理，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差形式（±s）表示，進行描述性統(tǒng)計分析、樣本的正態(tài)性檢驗、方差齊性檢驗、單因素方差分析（one-way ANOVA）及LSD-t檢驗（多個樣本均數(shù)間兩兩比較采用）。除方差齊性檢驗時取P<0.10認為檢驗結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)意義外，所有統(tǒng)計學(xué)分析均取P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1異常肝細胞中Prx 1和pAkt上調(diào)

本實驗通過獲取配對肝細胞，并檢測配對肝細胞中Prx 1蛋白表達差異情況，探討癌前肝細胞中Prx 1的表達情況。原代肝細胞從肝癌組織、近癌肝組織和遠癌肝組織中分離培養(yǎng)。與正常肝細胞比較，異常（癌前病變，源自近癌肝組織）肝細胞Prx 1表達上調(diào)（見表1、圖1）。正常細胞到異常細胞的表型轉(zhuǎn)化與Akt等細胞內(nèi)信號分子變化有關(guān)，采用Pearson直線相關(guān)分析pAkt水平與Prx 1蛋白表達水平之間的關(guān)系，用相關(guān)系數(shù)r表示，結(jié)果顯示：Akt水平與Prx 1蛋白表達水平呈正相關(guān)（r=0.863，P<0.01），提示pAkt水平上升與Prx1蛋白表達水平緊密相關(guān)。

提取遠癌肝組織（正常肝組織）和近癌肝組織（惡性轉(zhuǎn)化肝組織）蛋白，Western blot檢測Prx 1、pAkt、Akt及β-actin在兩組肝組織中的表達差異。

表1　遠癌肝組織（正常肝組織）和近癌肝組織中Prx 1、pAkt、Akt相對表達情況（n=4，±s）

表1　遠癌肝組織（正常肝組織）和近癌肝組織中Prx 1、pAkt、Akt相對表達情況（n=4，±s）

注：?兩組間蛋白相對表達值比較采用t檢驗，兩組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.05

組別　Prx 1/β-actin　pAkt/β-actin　Akt/β-actin遠癌肝組織組　0.473±0.142　0.366±0.125　0.836±0.142近癌肝組織組　0.894±0.264?　0.748±0.214?　0.722±0.137 t值　7.182　6.483　0.182 P值　0.027　0.032　0.725

圖1　Prx 1在肝細胞中的表達情況

2.2Prx 1增強EGF介導(dǎo)的EGFR與Akt激活

與空白對照組肝細胞株L02比較，癌前病變肝細胞（CCL13）中Prx 1蛋白表達明顯上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t =5.738，P=0.037）?；€狀態(tài)時，L02或CCL13細胞中均未檢測到Akt激活（見圖2A）。與Prx 1低水平表達的L02細胞比較，Prx 1表達較高的CCL13細胞中EGF介導(dǎo)的Akt激活明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t =8.412，P=0.001）（見圖2B）。5種關(guān)鍵性EGFR磷酸化殘基中，只有酪氨酸1173殘基對EGF處理有反應(yīng)；這種殘基被稱為導(dǎo)致Akt激活的磷酸化位點，結(jié)果提示原代肝細胞中，Prx 1水平較高增加了Akt信號，Prx 1可能與EGF介導(dǎo)的信號通路有關(guān)。

2.3Prx 1表達敲除對腫瘤生長和體內(nèi)新陳代謝的影響

Western blot檢測表明，轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達靶向Prx 1的短發(fā)卡RNA（shPrx-1）HepG2細胞中Prx 1表達明顯受到抑制，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=12.341，P=0.000）（見圖3A），證實shPrx 1轉(zhuǎn)染成功，但是轉(zhuǎn)染shPrx 1對HepG2細胞內(nèi)ROS產(chǎn)生無影響，與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t = 0.124，P=0.892）（見圖3B）。Prx 1表達敲除后顯著地抑制了腫瘤生長，第24天開始，shPrx 1組腫瘤體積均明顯比無義shRNA轉(zhuǎn)染組?。ň鵓<0.05）（見圖4）。第56天時，在SCID鼠體中皮下注射每種細胞3×106個，并檢查肝轉(zhuǎn)移瘤確定遠端轉(zhuǎn)移特性。如圖5所示，敲除Prx 1降低了HepG2移植瘤中肝轉(zhuǎn)移瘤的發(fā)病率，shPrx 1組肝轉(zhuǎn)移瘤數(shù)量明顯少于無義shRNA轉(zhuǎn)染組（t=6.132，P=0.035）。

圖2　Prx 1對EGF誘導(dǎo)的EGFR-Akt信號通路激活的影響

此外，磷酸化Akt程度與Prx 1蛋白表達水平密切相關(guān)，Pearson直線相關(guān)分析血清磷酸化Akt程度與Prx 1蛋白表達水平呈正相關(guān)（r=0.954，P<0.01）（見圖6）。腫瘤中Prx 1表達敲除后的作用持續(xù)至首次注射肝癌細胞56d后，Prx 1表達敲除肝腫瘤pAkt表達水平較低，該結(jié)果表明，Prx 1在調(diào)節(jié)人類肝癌Akt激活中起主要作用。

圖3　Prx 1表達下調(diào)使肝癌HepG2細胞內(nèi)活性氧簇水平下降

圖4　Prx 1表達沉默抑制了HepG2細胞體內(nèi)成瘤能力

圖5　Prx 1表達沉默抑制了HepG2移植瘤轉(zhuǎn)移至肝臟的能力

圖6　Prx 1表達沉默抑制體內(nèi)Akt激活

3　討論

本文實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)癌前病變肝細胞中Prx 1表達水平明顯高于正常肝細胞，在惡性肝癌組織中Prx 1表達水平也顯著升高。進一步研究發(fā)現(xiàn)，正常細胞向異常細胞轉(zhuǎn)化過程中的Prx 1表達升高與Akt激活增加有關(guān)。采用shRNA抑制肝癌細胞中Prx 1表達后，肝癌細胞移植瘤模型中腫瘤生長和轉(zhuǎn)移明顯受到抑制，提示Prx 1可能與腫瘤進展和侵襲有關(guān)，而Akt激活降低與腫瘤發(fā)生減少顯著相關(guān)。

以往研究認為Prx 1能夠增強細胞生存能力，是因為Prx1具有抗氧化劑作用[5]。Prx1在N端（Cys52）含有具有催化作用的半胱氨酸，該半胱氨酸能夠通過巰基氧化（Cys52-SOH，次磺酸）降低細胞內(nèi)ROS水平。Cys52-SOH在C-端，Cys173能夠通過保守解離的半胱氨酸形成一種分子間的雙硫鍵，該雙硫鍵通過硫氧還蛋白（Trx）/硫氧化還原蛋白還原酶（TR）等體系的電子供體還原為活性巰基形式，Cys52-SH[6-7]。體內(nèi)外研究均表明抑制Prx 1表達能夠增強腸癌肺癌放射治療敏感行。這些研究均證實以下這一觀點：Prx 1是抗氧化蛋白，因為抑制Prx 1表達引起放射敏感性增強是由于ROS產(chǎn)量升高。盡管以往體內(nèi)外研究都發(fā)現(xiàn)抑制Prx 1表達能夠顯著增強POS產(chǎn)生，但是本研究中Prx 1表達下調(diào)肝癌細胞中ROS并未顯著增加，本研究結(jié)果與Kim等[8]研究結(jié)果一致，Kim等發(fā)現(xiàn)放療后，Prx 1過表達在抑制了c-Jun N-端激酶激活（c-Jun N-terminal kinase，JNK）和凋亡性細胞死亡。然而，Prx 1的抗氧化活性功能對于該過程并不是必需的，因為野生型Prx 1和缺少抗氧化活性的突變Prx 1（Prx-1C52S）都能通過與GSTpi-JNK復(fù)合物結(jié)合高效阻斷JNK激活和細胞凋亡。

本研究結(jié)果還表明Prx 1具有調(diào)控人肝細胞中EGFR介導(dǎo)信號通路的潛在作用。Prx 1高表達細胞中配體誘導(dǎo)EGFR Tyr1173殘基磷酸化增強，從而導(dǎo)致Akt激活。Prx 1增強EGFR信號功能的分子機制仍需進一步研究。近期研究表明，Prx 1具有分子伴侶的功能，且這一功能不依賴于Prx 1的過氧化物酶活性[9]。作為伴侶蛋白，Prx 1改變了各種細胞蛋白的功能和活性，包括c-Abl酪氨酸激酶、巨噬細胞移動抑制因子、c-Myc致癌基因、雄激素受體等。Prx 1具有多種生理功能的重要原因就是Prx 1能夠與生長調(diào)節(jié)蛋白相互作用。近期蛋白質(zhì)組學(xué)分析提示Prx 1能夠與細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白Ezrin相互作用。Ezrin是一種磷蛋白，能夠增強生長因子誘導(dǎo)磷酸化，并將PI3K/Akt等信號通過蛋白間直接相互作用轉(zhuǎn)導(dǎo)至下游。Ezrin是論證Prx 1增強EGFR-Akt生存信號通路功能的理想靶點。

本文研究結(jié)果進一步揭示Prx 1能夠通過EGFR-Akt信號通路介導(dǎo)細胞正常至異常轉(zhuǎn)化、腫瘤形成、轉(zhuǎn)移，提示Prx 1可能是肝癌早期檢測重要靶點。目前有許多研究致力于基于靶點策略進行腫瘤早期檢測，但是這些靶點都專注于個別靶分子。隨著Prx 1研究的深入，與Prx 1相互作用的靶分子/效應(yīng)分子的范圍可能進一步擴展。盡管這些相互作用的功能結(jié)果需要以細胞類型和組織環(huán)境限制模式進行檢測和闡述，但抑制Prx 1表達能夠同時作用多個靶點蛋白干預(yù)肝細胞癌形成。

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（張蕾編輯）

論著

Effect of Prx-1 on growth of hepatocellular carcinoma xenografts

Qing-song Tu, Jian-tai He (Xiangya Hospital, Central South University, Changsha, Hunan 410008, China)

Abstract:Objectives To investigate the role of Prx 1 in hepatocellular carcinoma. Methods The expression of Prx-1, pAkt and Akt in distal hepatocellular carcinoma and para- carcinoma tissue was detected by Western blot. Human liver cells were treated with 10 ng/ml EGF for 10 min after 24 hrs after serum starvation. Total proteins were extracted immediately after 10-min EGF treatment and used for Western blot. Equal amount of protein (20 μg) was separated by SDS-PAGE and probed with antibodies specific to Prx 1, pAkt, various phosphorylated forms of EGFR and total EGFR. Prx 1 protein levels in parental (untransfected), scramble, and Prx-1shRNA transfected HepG2 cells were measured by Western blot. Reactive oxygen species (ROS) levels determined from HepG2 sublines by using probe DCFH-DA. HepG2/Prx 1Sc and HepG2/Prx-1KD cells were injected into the dorsal flank of male SCID mice. Tumor size was measured every week after injection. Protein extracted from HepG2/Prx 1Sc and HepG2/Prx 1KD tumor tissues was subjected to Western blot analysis. Equal amount of protein (20 μg) was separated by SDS-PAGE and probed with antibodies specific to Prx-1and pAkt. Results Increased expression of Prx 1 was observed in abnormal (pre-malignant) liver cells compared to their paired normal liver cells. Prx 1 enhances EGF-mediated EGFR and Akt activation. Prx-1 knock-down inhibits tumor growth of HepG2 xenografts in vivo. Prx 1 knock-down reduces liver metastasis of HepG2 xenografts in vivo. Prx-1 knock-down inhibits Akt activation in vivo. Conclusions A potential role for Prx-1 in regulation of EGFR mediated signaling pathways in human liver cells. Prx-1 in mediates normal-to-abnormal cell transition, tumorigenesis, and metastasis through EGFR-Akt signaling pathways.

Keywords:peroxiredoxin-1; hepatocellular carcinoma; xenografts

收稿日期：2015-11-18

文章編號：1005-8982（2016）08-0011-06

DOI:10.3969/j.issn.1005-8982.2016.08.003

中圖分類號：R735.7

文獻標(biāo)識碼：A