王琳

（河南省鄭州人民醫(yī)院放療科，河南鄭州450000）

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Twist蛋白在結(jié)直腸癌中的表達(dá)水平及其促進(jìn)癌癥發(fā)展的機(jī)制研究

王琳

（河南省鄭州人民醫(yī)院放療科，河南鄭州450000）

摘要：目的研究Twist蛋白在結(jié)直腸癌中的表達(dá)水平，其對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖以及侵襲能力的影響，并探討其促進(jìn)癌癥發(fā)展具體的機(jī)制。方法經(jīng)結(jié)腸鏡活檢取20例患者組織和20例正常人的標(biāo)本，采用實(shí)時(shí)定量PCR的方法檢測(cè)了Twist的mRNA表達(dá)水平。采用脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞系CT-26細(xì)胞進(jìn)行RNA干擾，采用CCK-8法及transwell法觀察干擾Twist后對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖以及侵襲能力的影響；采用RT-PCR以及Western blot檢測(cè)了CT-26細(xì)胞中MMP-9的mRNA及蛋白水平。結(jié)果Twist在結(jié)直腸癌組織中的mRNA水平顯著高于對(duì)應(yīng)癌旁組織以及對(duì)照組（P<0.05）；在伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織中Twist mRNA的表達(dá)水平顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的組織（P<0.05）；與轉(zhuǎn)染對(duì)照組比較，Twist siRNA轉(zhuǎn)染的CT-26細(xì)胞增殖水平及遷徙能力均顯著降低（P<0.05）；干擾Twist的CT-26細(xì)胞能夠顯著降低金屬蛋白酶MMP-9 mRNA及蛋白的水平。結(jié)論Twist蛋白能夠增加結(jié)直腸癌癌細(xì)胞的增殖及遷徙能力，其影響機(jī)制可能與金屬蛋白酶MMP-9有關(guān)。

關(guān)鍵詞：Twist蛋白；結(jié)直腸癌；MMP-9；增殖；侵襲；機(jī)制

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是常見的消化道惡性腫瘤，目前，我國結(jié)直腸癌的發(fā)病率居第3位，其病死率居第4位，且該病的患者群逐漸趨向年輕化[1]。因此，深入探討結(jié)直腸癌發(fā)病及轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，尋找新的治療靶點(diǎn)，對(duì)治療結(jié)直腸癌具有重要的意義。Twist蛋白是堿性螺旋-環(huán)-螺旋家族的轉(zhuǎn)錄因子之一，已有大量的研究表明，其在促進(jìn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)變，參與實(shí)體腫瘤的遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移及癌旁結(jié)節(jié)形成中發(fā)揮重要的作用[2-5]。國外學(xué)者Valdés-Mor等發(fā)現(xiàn)，Twist過度表達(dá)與男性原發(fā)性大腸癌的淋巴結(jié)浸潤密切相關(guān)[6]，然而至今，結(jié)直腸癌癌患者中Twist的表達(dá)水平以及其對(duì)結(jié)直腸癌癌細(xì)胞的增殖及遷移影響的研究尚無報(bào)道。因此，本研究旨在探討Twist在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)情況，并從體外通過低表達(dá)結(jié)直腸癌細(xì)胞系中的Twist水平來探討其影響結(jié)直腸癌遷移的分子機(jī)制。

1　資料與方法

1.1臨床資料

所有結(jié)直腸癌組織來源于2013年8月-2014 年1月來鄭州人民醫(yī)院就醫(yī)患者的手術(shù)切除標(biāo)本。癌變組共20例，其中，男性11例，女性9例；年齡57～73歲，平均（62.2±6.6）歲。所有組織標(biāo)本經(jīng)術(shù)后病理學(xué)證實(shí)為結(jié)直腸癌，分別取結(jié)直腸癌及對(duì)應(yīng)腫瘤邊緣2～6 cm處癌旁組織進(jìn)實(shí)驗(yàn)分析。對(duì)照組取同期醫(yī)院檢查的正常20例人群結(jié)直腸黏膜組織，其中，男性12例，女性8例，年齡60～72歲，平均（63.52±7.53）歲。

1.2結(jié)直腸癌組織以及血漿標(biāo)本總RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（PT-PCR）

取結(jié)直腸癌及對(duì)應(yīng)癌旁組織約100 mg組織后，加入1 ml的Trizol（美國Invitrogen公司）充分勻漿，將抽提的總RNA溶于30μl DEPC水溶液。提取的總RNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)進(jìn)行定量分析，并采用Femantes逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，cDNA產(chǎn)物-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。熒光定量PCR試劑盒購自美國Roche公司，本實(shí)驗(yàn)使用美國ABI公司的7300型號(hào)Real-Time PCR儀器進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件：95℃變性20 s，然后60℃20 s和70℃1 s進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，使用2-ΔΔCt法進(jìn)行相對(duì)定量分析結(jié)果。RT-PCR序列：基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloprotein 9，MMP-9）：正向引物：CGCAGACATCGTCATCCAGT，反向引物：GGATTGGCCTTGGAAGATGA；Twist：正向引物：CACGCAGTCGCTGAACGA，反向引物：GACCTGGTACAGGAAGTCGATGT；GAPDH：正向引物：AACTGGGACGACATGGAGAA，反向引物：ATACCCCTCGTAGATGGGCA。

1.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染

小鼠大腸癌細(xì)胞CT-26細(xì)胞采用完全DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，待匯合度達(dá)到50%～60%左右。采用脂質(zhì)體Lipofectamine?2000（美國Invitrogen公司）對(duì)小鼠大腸癌細(xì)胞CT-26細(xì)胞中Twist進(jìn)行小RNA干擾，Twist的siRNA靶向序列為5'-GGUACAUCGACUUCCUGUATT；對(duì)照序列為5'-UCAUAAGUG AUGCUGGAGCTT[7]。待干擾48 h后，采用RT-PCR技術(shù)驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率。

1.4細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長期的結(jié)腸癌細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞密度至2×105～3×105個(gè)/ml，按0.1 ml/孔加入到transwell小室的上層，小室下層加入l ml的10%血清的培養(yǎng)液。培養(yǎng)24 h時(shí)間后，對(duì)已遷移至小室下層的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)（×200倍）。

1.5CCK-8試劑檢測(cè)細(xì)胞增殖

按CCK-8試劑（上海前塵生物科技有限公司）說明書進(jìn)行分析。分別收集未處理組和轉(zhuǎn)染組的24 h，48 h和72 h后的CT-26細(xì)胞，加入終濃度為10%的CCK-8試劑，于37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育3 h，然后測(cè)定450 nm的光密度（optical density，OD）值。

1.6免疫印跡法（Western blot）檢測(cè)蛋白水平

細(xì)胞收取后，加入1×SDS細(xì)胞裂解液，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，110 V電壓轉(zhuǎn)膜100 min，37℃封閉后，加兔抗人的MMP-9（美國Biolegend公司）4℃孵育過夜后，HRP標(biāo)記的小鼠抗兔二抗（南京生興生物公司）（1∶1 000稀釋）37℃孵育50 min，內(nèi)參蛋白選用美國Sigma公司的抗人β-actin（1∶5 000稀釋），孵育后用PBS-T洗膜3次，進(jìn)行免疫印跡化學(xué)發(fā)光（ECL）檢測(cè)。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，均通過正態(tài)性檢驗(yàn)。兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較為單因素方差分析＋兩兩多重比較（LSD-t檢驗(yàn)）。多時(shí)點(diǎn)資料的比較則為單因素重復(fù)測(cè)量方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1結(jié)直腸癌組織及對(duì)應(yīng)癌旁中Twist mRNA表達(dá)水平

3組的Twist mRNA表達(dá)水平，整體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=128.590，P=0.000）。與正常組織比較，結(jié)直腸癌癌旁組織中Twist mRNA水平顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t =4.547，P=0.000）；與癌旁組織比較，結(jié)直腸癌組織中Twist mRNA的表達(dá)水平顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t =11.045，P = 0.000），見表1。

表1　結(jié)直腸癌及對(duì)應(yīng)癌旁組織中Twist mRNA表達(dá)水平（n=20，±s）

表1　結(jié)直腸癌及對(duì)應(yīng)癌旁組織中Twist mRNA表達(dá)水平（n=20，±s）

組別　TwistmRNA　F值　P值A(chǔ)：正常組織　1.24±0.41 B：癌旁組織　2.41±0.57　128.590　0.000 C：結(jié)直腸癌組織　5.25±1.22 A VS C（t值，P值）　4.547，0.000 B VS C（t值，P值）　11.045，0.000

圖1　低表達(dá)Twist對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖及侵襲的影響

表2　低表達(dá)Twist對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖及侵襲的影響（n=6，±s）

表2　低表達(dá)Twist對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖及侵襲的影響（n=6，±s）

注：整體比較為單因素方差分析，兩兩比較為LSD檢驗(yàn)

組別　TwistmRNA　OD450 nm　　細(xì)胞數(shù)0 h　24 h　48 h　72 h A：空白組　1.03±0.18　1.12±0.06　1.41±0.11　2.27±0.16　5.92±0.18　34.0±2.6 B：對(duì)照組　0.98±0.19　1.14±0.06　1.52±0.17　2.52±0.51　6.18±0.61　32.6±4.6 C：siRNA組　0.35±0.06　1.09±0.05　1.20±0.16　1.83±0.40　3.25±0.41　18.9±1.8 F值P值35.556 0.000 1.213 0.325 7.136 0.007 4.848 0.024 82.439 0.000 35.556 0.000 A VS B（LSD-t值，P值）　0.588，0.565　0.474，0.642　1.269，0.224　1.148，0.269　1.013，0.327　0.588，0.565 A VS C（LSD-t值，P值）　7.579，0.000　1.048，0.311　2.448，0.027　1.932，0.072　10.579，0.000　7.579，0.000 B VS C（LSD-t值，P值）　6.991，0.000　1.522，0.149　3.716，0.002　3.081，0.008　11.592，0.000　6.991，0.000

2.2Twist mRNA表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及Duckes分期的關(guān)系

所有患者中，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移8例（Dukes A/B期），而具有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移12例（Dukes C/D期）。Twist mRNA的表達(dá)水平在Dukes C/D期組織中的表達(dá)水平為（3.01±0.51），顯著高于Dukes A/B期的（1.29±0.31），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t =8.505，P= 0.000）。

2.3siRNA干擾Twist對(duì)CT-26細(xì)胞的增殖及侵襲功能的影響

經(jīng)CT-26細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，3組Twist siRNA水平，24 h后450 nm的OD值及5視野的細(xì)胞計(jì)數(shù)整體比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。CT-26細(xì)胞轉(zhuǎn)染Twist siRNA后，Twist mRNA水平與對(duì)照組比較顯著降低（P<0.05），見圖1A；CCK-8法結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，CT-26細(xì)胞干擾Twist基因72 h后的增殖能力顯著降低（P <0.05），見圖1B；進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CT-26細(xì)胞轉(zhuǎn)染Twist siRNA后，transwell小室下層細(xì)胞數(shù)量與對(duì)照組比較顯著減少（P< 0.05），見圖1C。此外，對(duì)轉(zhuǎn)染Twist siRNA后的CT26細(xì)胞的CCK-8法檢測(cè)結(jié)果，進(jìn)行多時(shí)間點(diǎn)重復(fù)測(cè)量分析發(fā)現(xiàn)，各時(shí)間點(diǎn)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表2。

2.4CT-26細(xì)胞干擾Twist對(duì)MMP-9的mRNA和蛋白表達(dá)影響

3組的MMP-9 mRNA表達(dá)水平，整體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=39.381，P=0.000）。與對(duì)照組比較，干擾Twist的CT-26細(xì)胞能顯著降低MMP-9 mRNA的水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t =7.365，P = 0.000），見表3，圖2A；并能顯著降低MMP-9蛋白的水平，見圖2B。

表3　低表達(dá)Twist對(duì)CT-26細(xì)胞遷徙基因MMP-9 mRNA及蛋白水平影響（n=6，±s）

表3　低表達(dá)Twist對(duì)CT-26細(xì)胞遷徙基因MMP-9 mRNA及蛋白水平影響（n=6，±s）

注：整體比較為單因素方差分析，兩兩比較為LSD檢驗(yàn)；?與對(duì)照組比較，t=7.365，P=0.000

組別　MMP-9 mRNA　F值　P值空白組　1.14±0.22對(duì)照組　1.02±0.20　39.381　0.000 siRNA組　0.31±0.04?

圖2　低表達(dá)Twist對(duì)CT-26細(xì)胞遷徙基因MMP-9 mRNA及蛋白水平影響

3　討論

結(jié)直腸癌是消化道最常見的惡性腫瘤之一，且近年來，全世界結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)[8]。因此，研究結(jié)直腸癌發(fā)病的細(xì)胞學(xué)及分子學(xué)機(jī)制對(duì)其預(yù)防和治療有著極大的臨床意義。Twist是一種最早在果蠅的受精卵中被發(fā)現(xiàn)的基因，由于果蠅胚胎Twist基因缺失后的發(fā)育呈一種“扭曲”的現(xiàn)象，表現(xiàn)為原腸胚形成受阻、中胚層發(fā)育障礙而導(dǎo)致胚胎發(fā)育的末期死亡，從而將該基因命名為“Twist”[9]。近年來，越來越多的研究認(rèn)為Twist基因參與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)變過程中的調(diào)控，其在卵巢癌、胰腺癌等腫瘤細(xì)胞發(fā)生及其侵襲和轉(zhuǎn)移中均發(fā)揮十分重要的功能[10-12]。然而目前，Twist在結(jié)直腸癌中的表達(dá)水平以及其對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖以及侵襲能力的影響機(jī)制尚不完全明了。

本研究發(fā)現(xiàn)，Twist在結(jié)直腸癌癌組織以及癌旁組織中mRNA水平顯著高于正常黏膜組織，且癌組織中表達(dá)更高；此外，Twist在伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織中其表達(dá)水平高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織，說明Twist具有潛在的促進(jìn)結(jié)腸癌的發(fā)病以及對(duì)結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移有著一定的促進(jìn)功能。這與Sasaki等人研究的在人食管鱗狀細(xì)胞癌中Twist高表達(dá)，并參與癌癥轉(zhuǎn)移結(jié)果一致[5]。為了進(jìn)一步觀察Twist對(duì)結(jié)直腸癌癌細(xì)胞的增殖及遷移能力的影響，筆者通過siRNA干擾技術(shù)對(duì)結(jié)直腸癌癌細(xì)胞系CT-26細(xì)胞系低表達(dá)Twist。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌癌細(xì)胞Twist低表達(dá)后，癌細(xì)胞的增殖及侵襲能力也相應(yīng)降低，提示了Twist對(duì)結(jié)腸癌的細(xì)胞增殖以及轉(zhuǎn)移具有重要的促進(jìn)作用。惡性腫瘤發(fā)生浸潤轉(zhuǎn)移重要的步驟之一是腫瘤細(xì)胞對(duì)基質(zhì)的降解，而MMP-9已被證實(shí)參與多種腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移[13-15]。為了進(jìn)一步探討Twist影響結(jié)直腸癌癌細(xì)胞遷移的機(jī)制，筆者檢測(cè)了siRNA干擾Twist水平后的MMP-9的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Twist低表達(dá)后能夠顯著抑制MMP-9的表達(dá)水平，從而提示Twist可能通過促進(jìn)MMP-9的表達(dá)來增加癌細(xì)胞遷移能力，這與Li等在人腹膜間皮細(xì)胞中高表達(dá)Twist后可以增加細(xì)胞的遷移能力的結(jié)果一致[16]。

綜上所述，Twist可能通過促進(jìn)MMP-9的表達(dá)增加癌癥的遷移，其在結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著及其重要的作用。臨床中Twist的檢測(cè)對(duì)結(jié)腸癌的診斷及預(yù)后可能具有一定的指導(dǎo)意義。

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（張蕾編輯）

論著

Expression of Twist protein in colorectal cancer and mechanism of its cancer promoting effect

Lin Wang
(Department of Radiotherapy, Zhengzhou People's Hospital, Zhengzhou, Henan 450000, China)

Abstract:Objective To explore the expression of Twist protein in colorectal cancer and its impact on the proliferation and invasion of colorectal cancer cells, and to clarify the mechanism of its cancer promoting effect. Methods Twenty tissue specimens were selected from colorectal cancer patients and normal people through colonoscopy biopsy, respectively, then the expression of Twist mRNA was detected through real time quantitative PCR method. The colorectal cancer cell line CT-26 cell was RNA interfered by lipid transfection method, and was observed the impact of Twist after interference on the proliferation and invasion of colorectal cancer cells by CCK-8 method and transwell method, and the expression of mRNA and protein of MMP-9 in CT-26 cell were detected by RT-PCR and Western blot method. Results The expression of Twist mRNA in colorectal cancer tissues was significantly higher than in para-carcinoma tissues the control group (P< 0.05). The expression of Twist mRNA in colorectal cancer tissues with lymph node metastasis was significantly higher than in colorectal cancer tissues without lymph node metastasis (P< 0.05). Compared with transfection control group, the proliferation and migration ability of CT-26 cells transfected by Twist siRNA were significantly decreased (P < 0.05). CT-26 cells interfering Twist reduced the expression of mRNA and protein of metal protease MMP-9. Conclusions Twist protein strengthens the proliferation and migration ability of colorectal cancer cells, and the mechanism may relate with metal protease MMP-9.

Keywords:twist protein; colorectal cancer; MMP-9; proliferation; invasion; mechanism

收稿日期：2015-11-06

文章編號(hào)：1005-8982（2016）08-0028-05

DOI:10.3969/j.issn.1005-8982.2016.08.006

中圖分類號(hào)：R735.3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A