付 萍

(草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅 蘭州 730020)

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根瘤菌對箭筈豌豆結(jié)瘤固氮的影響

付 萍

(草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅 蘭州 730020)

摘要：在溫室中低氮營養(yǎng)液培養(yǎng)條件下，用3株不同根瘤菌菌株(CCBAU01069、CCBAU01085和J3)對3個(gè)箭筈豌豆(Vicia sativa)品種進(jìn)行結(jié)瘤固氮效果的研究，旨在從中篩選出與箭筈豌豆植株共生匹配最佳的有效根瘤菌菌株，為箭筈豌豆菌肥的研制奠定試驗(yàn)基礎(chǔ)。結(jié)果表明，與不接菌處理相比，根瘤菌接種可顯著促進(jìn)箭筈豌豆的單株株高、根長、根瘤數(shù)、根瘤鮮重、植株全氮含量以及固氮酶活性，所用菌株以CCBAU01069促生，固氮效果最佳。

關(guān)鍵詞：箭筈豌豆；根瘤菌；接種；結(jié)瘤固氮

根瘤菌(Rhizobium)是一類可與豆科作物相互作用形成共生固氮體系的革蘭氏陰性桿狀細(xì)菌[1]。這種共生體系具有很強(qiáng)的固氮能力，可以通過固定大氣中游離的氮?dú)猓瑸橹参锾峁┑仞B(yǎng)料[2]，一方面，達(dá)到了作物增產(chǎn)及培肥地力的重要作用；另一方面，減輕了化肥生產(chǎn)帶給環(huán)境污染的壓力與威脅，對我國農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展起到了不可替代的作用[3-5]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年全球估計(jì)有2.0億t氮來源于生物固氮，其中僅有25%由它非共生固氮生物所固定，而根瘤菌與豆科植物所固定的氮約占生物固氮總量的65%[6-7]。豆科牧草作為生物固氮中最有效的成員，不但在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用非常廣泛，且具有最顯著的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。然而，并不意味著任何根瘤菌對寄主植物都會(huì)起到提高其產(chǎn)量或品質(zhì)的作用，由于根瘤菌與豆科植物間的共生結(jié)瘤是一個(gè)競爭過程，往往根瘤的形成和共生固氮效率的高低是由眾多影響因素所決定的，因此，生物固氮研究領(lǐng)域中的熱點(diǎn)逐漸指向了豆科植物與根瘤菌共生固氮優(yōu)良組合的篩選[8]。

箭筈豌豆(Viciasativa)，又名大巢菜，屬豆科(Leguminosae)野豌豆屬的一個(gè)栽培種；其原產(chǎn)于歐洲南部和亞洲西部，于20世紀(jì)40年代開始引入我國種植栽培，在我國種植范圍廣達(dá)新疆、青海、江蘇、臺(tái)灣等29個(gè)省(區(qū))[9]，僅在甘肅省的種植面積已擴(kuò)大到3.4萬hm2之多[10]。箭筈豌豆作為一種優(yōu)良的飼料和綠肥兼用作物, 是生產(chǎn)中使用較為普遍的一類綠肥種質(zhì)資源[11]，具有耐旱、耐貧瘠、抗逆性強(qiáng)的特點(diǎn)，其可通過生物固氮作用抑制土壤退化和節(jié)約氮肥使用量，是各種作物的良好前作[12-13]。由于豆科植物共生固氮在生產(chǎn)、環(huán)境和經(jīng)濟(jì)中具有舉足輕重的作用，因此對廣泛栽培豆科植物最佳共生根瘤菌的篩選也是我國農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)急需解決的問題之一。該研究用3種不同的根瘤菌菌株(CCBAU01069、CCBAU01085和J3)對3個(gè)箭筈豌豆品種分別接種后從形態(tài)和生理上對其固氮效果進(jìn)行分析，旨在從中篩選出與箭筈豌豆植株共生匹配最佳的有效根瘤菌菌株，為箭筈豌豆菌肥的研制奠定試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1供試箭筈豌豆品種供試材料為蘭箭1號(hào)、蘭箭2號(hào)、蘭箭3號(hào)，共3個(gè)品種，均由蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院提供，來自該院于2012年在甘肅省甘南州夏河試驗(yàn)點(diǎn)收獲所得。

1.1.2供試根瘤菌菌株供試根瘤菌菌株為CCBAU01069、CCBAU01085和J3，共3株，前兩株由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)生物學(xué)院微生物與免疫學(xué)系、國家農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、農(nóng)業(yè)部土壤微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室生命科學(xué)研究中心提供，菌株J3由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院提供，以上3種菌株均分離自箭筈豌豆植株。

1.1.3低氮營養(yǎng)液以Hogland營養(yǎng)液為基礎(chǔ)配制的低氮營養(yǎng)液，其配方(μmol·L-1)為：CaCl22.0×10-3、Ca(NO3)22.0×10-6、K2SO47.5×10-2、KCl 1×10-2、MgSO46.5×10-2、EDTA-Fe 1×10-4、MnSO41×10-6、ZnSO41×10-6、Na2MoO45×10-8、CuSO41×10-7、H3BO31×10-5、KH2PO42.5×102。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1根瘤菌菌株的培養(yǎng)采用平板劃線法將菌株CCBAU01069、CCBAU01085和J3分別在根瘤菌培養(yǎng)基(YMA)上對其進(jìn)行活化，于28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)。72 h后在無菌條件下，挑起單菌落接種于箭筈豌豆根瘤菌YMA液體培養(yǎng)基中，在28 ℃培養(yǎng)條件下156 r·min-1搖床中培養(yǎng)至菌懸液OD值(λ=600 nm)達(dá)到0.6后取出，置于4 ℃的冰箱中低溫保存。

1.2.2種子處理挑選大小和飽滿度一致且種皮完整的蘭箭1號(hào)、蘭箭2號(hào)、蘭箭3號(hào)3個(gè)品系(或品種)的種子，用95%的酒精將種子消毒5 min，取出用無菌水沖洗7～8次。之后在0.2% HgCl2中處理3 min，再用無菌水沖洗7～8次[14-15]后備用。

1.2.3試驗(yàn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)設(shè)菌株CCBAU01069、CCBAU01085、J3和不接菌(對照)4個(gè)處理，3個(gè)品種共計(jì)12個(gè)處理，每個(gè)處理7個(gè)重復(fù)。選用長23 cm、寬18 cm、高12 cm的塑料花盆，裝入適量的滅菌蛭石。每盆均勻播種6粒已消毒的種子，并覆蓋適量的滅菌蛭石，出苗后定株5株，將花盆放入水培盤中，隨機(jī)排列。待植株子葉展開后，將根瘤菌菌懸液(OD600 nm=0.6)等量等濃度地加入每個(gè)花盆和營養(yǎng)液中。生長期間每兩天澆一次營養(yǎng)液，每次用0.01 mol·L-1HCl或0.01 mol·L-1NaOH將營養(yǎng)液的pH保持在7.0～7.2。試驗(yàn)完全采用隨機(jī)排列。試驗(yàn)期間溫室內(nèi)平均氣溫為22 ℃，日均溫25 ℃，夜均溫19 ℃，光照時(shí)間14 h，光強(qiáng)7 000～8 000 lx。

1.2.4樣品采集與測定處理45 d(盛花期 )后采集樣品并測定各項(xiàng)生理指標(biāo)，分別測定株高(直尺)、主根長及根瘤數(shù)、根瘤鮮重、植株全氮(凱氏定氮法[16])和固氮酶活性(氣相色譜儀乙炔還原法[17-18])。

1.3統(tǒng)計(jì)分析

采用Microsoft Excel 2003及SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和處理。

2結(jié)果與分析

2.1不同根瘤菌菌株對箭筈豌豆株高的影響

箭筈豌豆植株接菌后，其株高與對照之間差異顯著(P<0.05)，其中以CCBAU01069菌株效果為最佳，CCBAU01085效果次之(圖1)。蘭箭1號(hào)分別接種CCBAU01069、CCBAU01085和J3根瘤菌后，平均株高分別增加至100.23、 88.75和82.08 cm，比對照(71.66 cm)增加了39.87%、23.85%和14.54%。蘭箭2號(hào)平均株高分別增加至87.00、75.75和68.65 cm，比對照(60.83 cm)增加了43.02%、24.53%和12.86%。蘭箭3號(hào)平均株高分別增加至77.95、70.05和62.60 cm，比對照(52.83 cm)增加了47.55%、32.60%和18.50%，可見，低氮生長條件下接種根瘤菌對箭筈豌豆的株高有一定促進(jìn)作用。

圖1　不同根瘤菌菌株對箭筈豌豆品種株高的影響

注：不同小寫字母表示同一品種不同處理間差異顯著(P<0.05)。下同。

Note: Different lower case letters indicate significant difference among different treatments of same cultivar at 0.05 level.The same below.

2.2不同根瘤菌菌株對箭筈豌豆根長的影響

根瘤菌接種對箭筈豌豆植株根長的生長也有一定程度的促進(jìn)作用，且除接種CCBAU01085的蘭箭2號(hào)外各處理均顯著高于對照(P<0.05)。接種CCBAU01069、CCBAU01085、J3根瘤菌后，蘭箭1號(hào)的根長分別為28.30、22.35和23.45 cm，與對照(18.63 cm)相比，其根長增加了51.91%、19.97%和25.87%。蘭箭2號(hào)的根長分別為26.95、21.90和22.89 cm，比對照(18.80 cm)增加了43.35%、16.49%和21.76%，蘭箭3號(hào)根長分別為26.30、22.38和20.63 cm，與對照(17.95 cm)相比，增加了46.52%、24.68%和14.93%?？梢姡臃N根瘤菌可提高箭筈豌豆植株的根長，且不同的菌系與箭筈豌豆的共生有效性有明顯的差異(圖2)。

圖2　不同根瘤菌菌株對箭筈豌豆品種根長的影響

2.3不同根瘤菌菌株對箭筈豌豆根瘤數(shù)及根瘤重的影響

根瘤數(shù)與根瘤重是反映共生固氮體系相互作用時(shí)結(jié)瘤的能力。結(jié)果(圖3、圖4)顯示，接種3種根瘤菌菌株可顯著提高箭筈豌豆的結(jié)瘤能力(P<0.05)，但不同的箭筈豌豆品種接種不同的根瘤菌后其根瘤總數(shù)與根瘤菌鮮重差異較大。其中接種CCBAU01069后，蘭箭1號(hào)、蘭箭2號(hào)、蘭箭3號(hào)結(jié)瘤能力效果最好，單株根瘤數(shù)與根瘤鮮重分別達(dá)到17.25個(gè)與0.320 g、18.25個(gè)與0.263 g、15.70個(gè)與0.155 g，其他菌系的結(jié)瘤能力依次為CCBAU01085(14.50個(gè)與0.245 g、14.00個(gè)與0.144 8 g、11.50個(gè)與0.073 g)、J3(10.75個(gè)與0.202 5 g、9.25個(gè)與0.094 3 g、8.25個(gè)與0.042 6 g)，各處理均與對照之間有顯著差異。除蘭箭3號(hào)CCBAU01085與J3菌株間根瘤鮮重差異不顯著外(P>0.05)，蘭箭1號(hào)和蘭箭2號(hào)植株各處理間根瘤數(shù)和根瘤鮮重均差異顯著。

圖3　不同根瘤菌菌株對箭筈豌豆品種根瘤數(shù)的影響

圖4　不同根瘤菌菌株對箭筈豌豆品種根瘤鮮重的影響

2.4不同根瘤菌菌株對箭筈豌豆固氮酶活性及植株全氮含量的影響

接種根瘤菌后3種箭筈豌豆的固氮酶活性以及植株全氮含量顯著高于對照(P<0.05)，但不同的菌種間有差異，其中以CCBAU01069的效果最佳(圖5、圖6)。不接菌處理下蘭箭1號(hào)、蘭箭2號(hào)和蘭箭3號(hào)固氮酶活性依次為1.6、1.8和2.35 μg·g-1·h-1。接種菌株CCBAU01069、CCBAU01085和J3后蘭箭1號(hào)的固氮酶活性依次為57.13、43.80和40.33 μg·g-1·h-1。蘭箭2號(hào)的固氮酶活性分別為55.22、42.06和38.14 μg·g-1·h-1。蘭箭3號(hào)的固氮酶活性值分別為59.03、47.16和46.53 μg·g-1·h-1。植株全氮含量與對照相比也顯著增加，蘭箭1號(hào)植株全氮含量分別增加了75%、34%和25%，蘭箭2號(hào)植株全氮含量分別增加了69%、42%和47%，蘭箭3號(hào)分別增加了78%、56%和37%。

圖5　不同根瘤菌菌株對箭筈豌豆品種固氮酶活性的影響

圖6　不同根瘤菌菌株對箭筈豌豆品種植株全氮含量的影響

3討論與結(jié)論

研究結(jié)果表明，接種有效根瘤菌菌株可增加箭筈豌豆根瘤數(shù)量和根部的固氮量。而用于本研究的3株根瘤菌菌株，都可與3個(gè)箭筈豌豆品種進(jìn)行共生匹配、結(jié)瘤固氮，但固氮結(jié)瘤能力和對促進(jìn)植物生長的作用卻存在差異，其中以菌株CCBAU01069的接種效果為最佳。接種后箭筈豌豆植株株高、根長、單株根瘤數(shù)、根瘤重、植株全氮含量以及固氮酶活性均顯著高于其它處理，初步篩選為箭筈豌豆的最佳匹配菌株。在同一低氮條件下，3株根瘤菌菌株并不能使同一箭筈豌豆品種獲得相同的接種效果，從接種后箭筈豌豆的生長效應(yīng)(單株株高、根長)、固氮效應(yīng)(平均根瘤數(shù)、根瘤重)、植株全氮含量以及固氮酶活性指標(biāo)來看，同一箭筈豌豆品種分別接種3種根瘤菌后，兩者之間存在著一種最佳相互匹配的關(guān)系，這樣才可獲得最佳固氮效果，在馬曉彤[19]的研究中也有相似的結(jié)果。在不接菌處理中也有根瘤的形成，但與各處理相比數(shù)量差異較大，可能是箭筈豌豆種子自身攜帶根瘤菌，還需進(jìn)一步試驗(yàn)證明。

在研究過程中，所用蛭石全經(jīng)過高溫滅菌處理，對植物氮素的供給量幾乎為零，僅起支持及固定植物的作用，因此植物在生長期間所需的氮素養(yǎng)分，除來源于定期加入的適量低氮營養(yǎng)液以外，其它氮素養(yǎng)料應(yīng)全靠根瘤固氮所獲得。未接種根瘤菌的植物結(jié)瘤量稀少，含氮量低，分枝少與接種處理后的相比差異明顯。由此說明在氮素營養(yǎng)不足的情況下接種根瘤菌是非常有必要的，在農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展中是一種非常經(jīng)濟(jì)有效的措施。根瘤菌篩選的最終目的都要用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，因此在篩選過程中不僅局限于溫室考慮與寄主植物的相互匹配，還要考慮與種植生態(tài)環(huán)境匹配性[20]，可擴(kuò)大選種范圍。而本研究收集的菌株種類少，寄主單一，因此下一步試驗(yàn)應(yīng)在本研究的基礎(chǔ)上中擴(kuò)大菌種范圍，并結(jié)合箭筈豌豆推廣種植范圍的生態(tài)環(huán)境進(jìn)行大田篩選，為箭筈豌豆接種根瘤菌技術(shù)的大力推廣提供依據(jù)。

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(責(zé)任編輯王芳)

Effects of different rhizobia on nodulation ofViciasativa

FuPing

(KeyLaboratoryofGrasslandAgro-ecosystems,CollegeofPastoralAgricultureScienceandTechnology,LanzhouUniversity,Lanzhou730020,China)

Abstract:Three rhizobial strains were used to study the nodulation effects of three Vicia sativa cultivars growed in low nitrogen nutrient solution under greenhouse conditions. The results showed that the plant average height, the root length, the amount of nodules, fresh weight of nodules, total nitrogen content and nitrogenase activity of the inoculated V. sativa were significantely increased (P<0.05) compared with controls and strain CCBAU01069 had the best effects.

Key words:Vicia sativa; rhizobia; inoculation; nodulation and nitrogen fixation

Corresponding author:Fu PingE-mail:fuping1012@163.com

中圖分類號(hào)：S551+.9

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1001-0629(2016)4-0584-05*

通信作者：付萍(1987-)，女，甘肅蘭州人，碩士，研究方向?yàn)椴輼I(yè)科學(xué)。E-mail:fuping1012@163.cn

基金項(xiàng)目：農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項(xiàng)目“蘭箭3號(hào)春箭筈豌豆新品種示范與推廣”(2012GB23600626)

收稿日期：2015-03-05接受日期：2015-05-05

DOI:10.11829/j.issn.1001-0629.2015-0126

付萍.根瘤菌對箭筈豌豆結(jié)瘤固氮的影響.草業(yè)科學(xué),2016,33(4)：584-588.

Fu P.Effects of different rhizobia on nodulation ofViciasativa.Pratacultural Science，2016,33(4)：584-588.