鄧　雯， 吳維敏， 亓立峰， 趙厚育

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)， 貴州 貴陽(yáng)　550004； 2.同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院 婦產(chǎn)科， 上海　200000； 3.同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院 納米院， 上?！?00000； 4.貴州醫(yī)科大學(xué)附院 耳鼻喉科， 貴州 貴陽(yáng)　550004)

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新型納米載體PEI-Fe3O4在鼻咽癌細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染中的應(yīng)用*

鄧雯1， 吳維敏2， 亓立峰3， 趙厚育4**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)， 貴州 貴陽(yáng)550004； 2.同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院 婦產(chǎn)科， 上海200000； 3.同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院 納米院， 上海200000； 4.貴州醫(yī)科大學(xué)附院 耳鼻喉科， 貴州 貴陽(yáng)550004)

[摘要]目的： 構(gòu)建聚乙烯亞胺(PEI)修飾的四氧化三鐵(Fe3O4)磁性納米粒,觀察其表征，探討其作為基因載體的可行性。方法： 用PEI-Fe3O4磁性納米粒包被質(zhì)粒轉(zhuǎn)染鼻咽癌CNEII細(xì)胞，轉(zhuǎn)染miRNA-HIF-1α干擾質(zhì)粒和miRNA-NC對(duì)照質(zhì)粒分別為H組、NC組，空白對(duì)照組設(shè)為C組；用電子顯微鏡觀察H組和NC組納米粒的大小及表征，用熒光顯微鏡觀察H組和NC組轉(zhuǎn)染效率，用Real Time RT-PCR及Western Blot方法檢測(cè)低氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)mRNA及蛋白表達(dá)的抑制情況。結(jié)果： 成功構(gòu)建PEI-Fe3O4磁性納米粒；H組和NC組的轉(zhuǎn)染率分別為(63.6±4.2)%、(65.8±6.1)%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；H組HIF-1α mRNA及蛋白表達(dá)抑制率與NC組、C組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論： PEI-Fe3O4磁性納米粒是一種較為理想的基因轉(zhuǎn)染載體。

[關(guān)鍵詞]乙烯亞胺-四氧化三鐵； 磁性納米粒； 基因轉(zhuǎn)染； 鼻咽癌； 缺氧誘導(dǎo)因子- 1α； 信使RNA

聚乙烯亞胺(poly ethylene imine，PEI)是一種水溶性的陽(yáng)離子聚合物，是一種常被用做藥物投遞系統(tǒng)的經(jīng)典非病毒載體，其轉(zhuǎn)染效率已被證實(shí)比大多數(shù)陽(yáng)離子聚合物高[1]。四氧化三鐵(Fe3O4)是較為經(jīng)典的磁性納米材料，具超順磁性，粒徑小，經(jīng)PEI修飾的Fe3O4水溶性磁流體，也被證實(shí)可應(yīng)用于藥物投遞、靶向基因治療，及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的多種研究[2-3]。因此，PEI-Fe3O4在鼻咽癌細(xì)胞的研究中可能成為一種理想的基因轉(zhuǎn)染載體。本研究擬將包被了干擾質(zhì)粒的PEI-Fe3O4磁性納米粒轉(zhuǎn)染到鼻咽癌CNEII細(xì)胞中，觀察轉(zhuǎn)染后的各項(xiàng)指標(biāo)，為納米材料作為新型基因治療載體在鼻咽癌細(xì)胞中應(yīng)用的可能性提供依據(jù)。

1實(shí)驗(yàn)方法

1.1試劑及主要儀器

FeCl3·6H2O、FeCl2·4H2O、PEI購(gòu)于上海朗順化工有限公司，RP1640培養(yǎng)液、胎牛血清購(gòu)于invitrogen公司，低氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1,HIF-1α)抗體、Tubulin抗體及相關(guān)二抗均購(gòu)于美國(guó)ABcam公司，小RNA(microRNA,miRNA)干擾質(zhì)粒購(gòu)于上海吉瑪公司，PCR試劑盒購(gòu)于invitrogen公司。恒溫水浴鍋，電子稱(chēng)量器，機(jī)械攪拌器購(gòu)于德國(guó)Memmert公司，電泳儀及垂直電泳槽購(gòu)于美國(guó)BioRad公司，熒光顯微鏡購(gòu)于OLYMPUS公司，高速離心機(jī)購(gòu)于Eppendorf公司，RT-PCR儀購(gòu)于美國(guó)Biorad公司。

1.2干擾質(zhì)粒

本研究所用干擾質(zhì)粒購(gòu)于上海吉瑪公司，miRNA-HIF-1α干擾質(zhì)粒的靶序列為5′-GCAGGTCATAGTTTTGGCCACTG-3′，NC對(duì)照質(zhì)粒的靶序列為5′-AAATGTACTGCGCGTGGAGAC-3′。各質(zhì)粒均帶有綠色熒光蛋白(EGFP)。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)與分組

鼻咽癌細(xì)胞株CNEII由上海復(fù)旦大學(xué)亓立峰教授實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)與。于含有10%胎牛血清的RP1640培養(yǎng)液中，于37 ℃，5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，每2～3 d傳代1次。細(xì)胞分為3組，未轉(zhuǎn)染的CNEII細(xì)胞設(shè)為空白對(duì)照組(C組)；利用合成的納米顆粒PEI-Fe3O4轉(zhuǎn)染miRNA-HIF-1α干擾質(zhì)粒及NC對(duì)照質(zhì)粒分別設(shè)為H組及NC組。在細(xì)胞生長(zhǎng)良好的情況下，以約1×105密度接種于六孔板中，待細(xì)胞完全貼壁，細(xì)胞密度達(dá)40%時(shí)利用轉(zhuǎn)染介質(zhì)轉(zhuǎn)染相應(yīng)質(zhì)粒進(jìn)行干預(yù)處理。

1.4PEI-Fe3O4納米載體的制備

取8 mmol水楊酸與10 mL水混合，用1 mol/L NaOH中和水楊酸，并調(diào)PH值為11。稱(chēng)取FeCl20.254 g，F(xiàn)eCl30.65 g，分別溶于5 mL水。將FeCl2、FeCl3溶液加入到配置好的水楊酸溶液中，溶液變成黑色，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，冷凝回流，機(jī)械攪拌，90 ℃條件下反應(yīng)4 h。吸取PEI6.0 g，用10000透析袋透析2 d，每4～5 h換1次水，透析除去雜質(zhì)。最后收得25000PEI 9.25 mmol/L。取PEI 10 mmol/L、Fe3O41 mmol/mL等體積渦旋混勻，即得。用電子顯微鏡觀察H組和NC組納米粒的大小及表征。

1.5轉(zhuǎn)染效率的檢測(cè)

在CNEII細(xì)胞生長(zhǎng)良好的情況下，以約1×105密度接種于六孔板中，待細(xì)胞完全貼壁，細(xì)胞密度達(dá)40%時(shí)利用不同轉(zhuǎn)染介質(zhì)轉(zhuǎn)染相應(yīng)質(zhì)粒進(jìn)行干預(yù)處理。待轉(zhuǎn)染48 h后予熒光顯微鏡下觀察質(zhì)粒所帶EGFP的表達(dá)情況，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算轉(zhuǎn)染效率。

1.6轉(zhuǎn)染后CNEII細(xì)胞HIF-1α蛋白表達(dá)抑制

Western Blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后CNEII細(xì)胞HIF-1α蛋白表達(dá)抑制情況。在轉(zhuǎn)染后72 h收集細(xì)胞，常規(guī)PBS洗滌后提取蛋白，12%及8%聚丙酰胺凝膠恒壓分離蛋白，常規(guī)轉(zhuǎn)膜及封閉后加入HIF-1α一抗(1∶2 000)、及Tubulin一抗(1∶5 000)4 ℃過(guò)夜孵育，經(jīng)過(guò)常規(guī)TBST洗滌后加入相應(yīng)二抗室溫孵育1 h，顯影、定影、洗滌后觀察結(jié)果，計(jì)算抑制率，抑制率=(對(duì)照組相對(duì)灰度值-干擾組相對(duì)灰度值)/對(duì)照組相對(duì)灰度值×100%。

1.7轉(zhuǎn)染后CNEII細(xì)胞HIF-1α蛋白表達(dá)抑制

Real Time RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后CNEII細(xì)胞HIF-1α蛋白表達(dá)抑制情況。在轉(zhuǎn)染后48～72 h收集細(xì)胞，提取總RNA，HIF-1α基因上游引物序列為5′-CCATTAGAAAGCAGTTCCGC-3′，下游引物序列為5′-TGGGTAGGAGATGGAGATGC-3′。以β-actin作為對(duì)照。RT-PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 1 min; 95 ℃ 10 s; 60 ℃ 10 s; 70 ℃ 10 s，共40個(gè)循環(huán)；70 ℃ 10 min。實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)mRNA表達(dá)，計(jì)算抑制率，抑制率=(對(duì)照組2-ΔΔCT值-干擾組2-ΔΔCT值)/對(duì)照組2-ΔΔCT值×100%。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

2.1納米載體形態(tài)

電鏡下觀察不同放大倍數(shù)PEI-Fe3O4磁性納米尺寸在100 nm，粒子似球形，分散性好，見(jiàn)圖1。

2.2納米載體轉(zhuǎn)染效率

NC組、H組的轉(zhuǎn)染率分別為(65.8±6.1)%、(63.6±4.2)%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖2。

圖1　PEI-Fe3O4磁性納米粒(×300 000)Fig.1　Electron microscope pictures of PEI-Fe3O4 nanoparticles

注：A為轉(zhuǎn)染NC對(duì)照質(zhì)粒，B為轉(zhuǎn)染HIF-1α干擾質(zhì)粒圖2　CNEII細(xì)胞轉(zhuǎn)染NC或HIF-1α后的光鏡及熒光圖片的轉(zhuǎn)染情況(40×)Fig.2　Light and fluorescent microscope pictures of group CNEII cell transfection NC or HIF-1α

2.3轉(zhuǎn)染后HIF-1α蛋白表達(dá)

H組蛋白表達(dá)抑制率為69.4%，與NC組、C組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

(1)與C組比較，P<0.05；(2)與NC組比較，P<0.05圖3　CNEII細(xì)胞轉(zhuǎn)染miRNA-HIF-1α質(zhì)粒后蛋白的表達(dá)Fig.3　Expression of protein levels of CNEII cells after transfected with miRNA-HIF-1α plasmid

2.4轉(zhuǎn)染后HIF-1α mRNA表達(dá)

H組HIF-1αmRNA表達(dá)抑制率為63.0%，與C組及NC組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖4。

(1)與C組比較，P<0.05；(2)與NC組比較，P<0.05圖4　CNEII細(xì)胞系轉(zhuǎn)染miRNA-HIF1α質(zhì)粒后目的基因mRNA表達(dá)Fig.4　Expression of HIF-1α mRNA levels of CNEII cells after transfected with plasmids

3討論

基因治療是治療癌癥及其他病癥的常用研究手段，而要將外源性基因?qū)氲桨屑?xì)胞中則必須要有載體的幫助，經(jīng)典的載體包括病毒載體和非病毒載體，病毒作為載體有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，其在靶細(xì)胞內(nèi)表達(dá)穩(wěn)定，轉(zhuǎn)染率高，但其免疫原性、細(xì)胞毒性反應(yīng)可對(duì)靶細(xì)胞造成進(jìn)一步傷害。有報(bào)道稱(chēng)病毒載體有潛在的致基因突變的作用，這使病毒載體在臨床中的應(yīng)用被限制[4]。通常非病毒載體主要是指脂質(zhì)體(Lipofectamine)，相比于病毒載體而言，其具有方便獲取、無(wú)毒的特點(diǎn)，是一種方便快速的轉(zhuǎn)染載體，在體外研究時(shí)可發(fā)揮快速準(zhǔn)確的作用，但是其對(duì)細(xì)胞具有毒性作用，限制了其在體內(nèi)研究甚至臨床試驗(yàn)中的廣泛應(yīng)用[5]。

納米材料作為一種新型的生物材料，近年來(lái)已被廣泛應(yīng)用到醫(yī)學(xué)、生物、化學(xué)等領(lǐng)域，其低毒性、無(wú)免疫原性等特點(diǎn)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有著令人矚目的潛能，被應(yīng)用于基因治療、藥物投遞系統(tǒng)、增加靈敏性檢測(cè)等領(lǐng)域的研究[6-8]。在胰腺癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞等癌細(xì)胞系中，納米顆粒已被證實(shí)可以作為RNA干擾的載體成功影響細(xì)胞系的生物學(xué)效應(yīng)[9-11]。有報(bào)道稱(chēng)納米材料作為載體負(fù)載小RNA分子(small interfering RNA，siRNA)轉(zhuǎn)染到活細(xì)胞時(shí)，相比于lipofectamine，在敲除相同基因的目的下，能更好的保護(hù)siRNA不被降解，同時(shí)具有更好的細(xì)胞膜穿透性[12-13]。

常用的納米載體包括殼聚糖、白蛋白等。磁性納米粒在磁場(chǎng)中具有良好的響應(yīng)性及導(dǎo)向性，不僅在藥物投遞等傳統(tǒng)方法中發(fā)揮作用，也使其在核磁成像的診斷中發(fā)揮作用[14]。磁性納米粒不僅可用于轉(zhuǎn)染等基因治療，其亦可包裹化療藥物，通過(guò)納米粒表面配體的設(shè)計(jì)，使其更好的靶向性導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)放化療治療的一體化。本實(shí)驗(yàn)曾使用多種納米材料，如殼聚糖等作為轉(zhuǎn)染介質(zhì)，因其轉(zhuǎn)染率低而改為PEI-Fe3O4磁性納米粒，考慮一是因?yàn)榧?xì)胞類(lèi)型，各種納米載體對(duì)其親和力不同，二是因PEI可以包裹DNA穿過(guò)細(xì)胞膜而進(jìn)入細(xì)胞，加之Fe3O4毒性較小，故最終選用PEI-Fe3O4磁性納米粒。本實(shí)驗(yàn)中所使用的PEI-Fe3O4磁性納米粒采用傳統(tǒng)方法合成，其穩(wěn)定性好，分散性佳，具超順磁性。作為載體在鼻咽癌細(xì)胞中能有較高的轉(zhuǎn)染率，Real Time RT-PCR及Western Blot檢測(cè)結(jié)果表明，包被miRNA-HIF-1α質(zhì)粒的PEI-Fe3O4磁性納米粒能有效抑制HIF-1αmRNA及蛋白的表達(dá)。

本研究首次在鼻咽癌細(xì)胞中應(yīng)用PEI-Fe3O4磁性納米粒作為載體轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒，并在體外證實(shí)了其能有效轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞，雖然目前尚缺乏體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的研究，其效率及后續(xù)生物學(xué)作用仍有待于后續(xù)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探索，但PEI-Fe3O4磁性納米粒作為載體，其無(wú)免疫原性、細(xì)胞毒性等的特點(diǎn)無(wú)疑將成為體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中的閃光點(diǎn)。

4參考文獻(xiàn)

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(2016-01-03收稿，2016-04-08修回)

中文編輯： 文箐潁； 英文編輯： 周凌

Application of PEI-Fe3O4Nanoparticles as Novel Carrier in Gene Transfection in Nasopharyngeal Carcinoma

DENG Wen1, WU Weimin2, QI Lifeng3, ZHAO Houyu4

(1.GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004，Guizhou，China； 2.DepartmentofGynaecologyandObstetrics，TongjiHospitalAffiliatedtoMedicalCollegeofTongjiUniversity,Shanghai200000，China； 3.InstituteofBiomedicalEngineeringandNanoScience，MedicalCollegeofTongjiUniversity,Shanghai200000，China； 4.DepartmentofOtorhinolaryngology，theAffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004，Guizhou，China)

[Abstract]Objective: To construct PEI-Fe3O4 nanoparticles and observe its characteristics, and to investigate the feasibility of PEI-Fe3O4 nanoparticles as carrier in transfection. Methods: Plasmids coated with PEI-Fe3O4 magnetic nanoparticels were transfected into CNEII cells, cells transfected with miRNA-HIF-1α plasmid as group H while cells transfected with miRNA-NC plasmid as NC group, and CNEII cells without transfection served as C group. Observing size and morphology of PEI-Fe3O4 nanoparticles with scanning electronic microscope. Using fluorescence microscope to measure efficiency of transfection. Proteins were detected by western blot and mRNAs were detected by RT-PCR. Results: PEI-Fe3O4 was successfully constructed. The transfection efficiency of group H and group NC was (63.6±4.2)% and (65.8±6.1)%,difference was not statistically significant(P>0.05). The difference of suppression ratio of protein and mRNA of HIF-1α was significant compared to group C and group NC(P<0.05). Conclusion: PEI-Fe3O4 magnetic nanoparticles can be used as an ideal carrier of gene transfection.

[Key words]PEI-Fe3O4 magnetic nanoparticles； gene transfection； nasopharyngeal carcinoma； hypoxia inducible factor-1α； message RNA

[中圖分類(lèi)號(hào)]R34-33; R739.6

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1000-2707(2016)04-0382-05

*[基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金項(xiàng)目(NO.81260353)

**通信作者 E-mail:zhaohouyujia@163.com

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-04-20網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160420.1755.008.html