莫朝倫， 張軍梅*， 賈　瑩， 王藪馨， 吳　憂， 劉　秒， 張鳳丹

(貴州醫(yī)科大學(xué)附院 口腔科， 貴州 貴陽(yáng)　550004)

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丹參酮Ⅱ-A對(duì)大鼠成骨細(xì)胞體外增殖分化的影響*

莫朝倫**， 張軍梅***， 賈瑩， 王藪馨， 吳憂， 劉秒， 張鳳丹

(貴州醫(yī)科大學(xué)附院 口腔科， 貴州 貴陽(yáng)550004)

[摘要]目的： 研究丹參酮Ⅱ-A(TsII-A)對(duì)大鼠成骨細(xì)胞(OB)體外增殖分化的影響。方法： 分離、培養(yǎng)、純化SD乳鼠顱蓋骨OB，選擇傳代至第3代的OB進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)鑒定；將第3代OB分為實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組給予5×10-3mg/L、5×10-2mg/L及5×10-1mg/L TsII-A處理，對(duì)照組OB加入與實(shí)驗(yàn)組等量的完全培養(yǎng)基DMEM；于接種后第1、3、5、7天4個(gè)時(shí)間點(diǎn)觀察TsII-A對(duì)OB增殖的影響；于接種后第5天檢測(cè)OB中堿性磷酸酶(ALP)活性。結(jié)果： 分離、培養(yǎng)所得的細(xì)胞符合OB的形態(tài)學(xué)特征；與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組不同濃度TsII-A對(duì)OB均有促增殖的作用(P<0.05)，其中5×10-2mg/L濃度組促增殖作用最大；培養(yǎng)OB至第5天時(shí)實(shí)驗(yàn)組中ALP活性高于對(duì)照組(P<0.05)。結(jié)論: TsII-A在一定的作用時(shí)間內(nèi)，對(duì)體外培養(yǎng)的OB具有促增殖分化作用。

[關(guān)鍵詞]丹參酮Ⅱ-A； 成骨細(xì)胞； 堿性磷酸酶； 增殖分化； 正畸學(xué)； 牙移動(dòng)

適宜的正畸矯治力通過(guò)牙作用于牙周組織后，誘導(dǎo)壓力側(cè)牙槽骨破細(xì)胞(osteoclast，OC)的形成和骨吸收，促進(jìn)張力側(cè)成骨細(xì)胞(osteoblast，OB)新生和新骨沉積，形成骨塑建，最終導(dǎo)致正畸牙移動(dòng)。OB是骨塑建的物質(zhì)基礎(chǔ),它來(lái)源于具有多向分化潛能的間充質(zhì)干細(xì)胞，可分泌一系列骨蛋白，包括堿性磷酸酶(akaline phosphatase，ALP)和多種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，如骨鈣素、骨橋蛋白、骨延蛋白和Ⅰ型膠原等，并通過(guò)分泌一些細(xì)胞因子參與骨形成過(guò)程，同時(shí)控制骨基質(zhì)的礦化過(guò)程，說(shuō)明OB是骨組織更新活動(dòng)中最重要的功能細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞[1]。ALP是OB成熟的重要標(biāo)志酶之一 ，定量檢測(cè)ALP的活性可以客觀地反映OB的分化水平。丹參屬活血化淤類(lèi)傳統(tǒng)中藥，具有改善OB的功能，促進(jìn)骨折愈合[2]；丹參亦可促進(jìn)正畸牙移動(dòng)中牙槽骨的塑建和調(diào)整，加速正畸牙移動(dòng)[3-5]。丹參酮Ⅱ-A(tanshinone Ⅱ-A，TsⅡ-A)屬于丹參的有效活性成分，具有心血管藥理作用、雌激素樣活性、抗菌消炎和促骨代謝等藥理作用[6]。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用TsⅡ-A作用于體外培養(yǎng)的大鼠乳鼠OB，探討TsⅡ-A對(duì)OB增殖分化的作用及其對(duì)正畸牙移動(dòng)中骨塑建的影響。

1材料和方法

1.1材料

TsII-A購(gòu)于Aladdin-阿拉丁試劑(上海)有限公司。新生SD大鼠乳鼠，體質(zhì)量7～8 g，由貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK(黔)2012-0001]提供。DMEM高糖培養(yǎng)基(Hyclone， 美國(guó))，胎牛血清(FBS，杭州四季青)，青/鏈霉素雙抗(北京索寶萊生物科技有限公司)，0.1%Ⅰ型膠原酶(Gibco，美國(guó))，0.25%胰蛋白酶(Hyclone，美國(guó))，Cell counting Kit8(CCK-8)細(xì)胞增殖-毒性檢測(cè)試劑盒(日本同仁)，ALP試劑盒(南京建成生物工程研究所)，茜素紅指示劑(北京索寶萊生物科技有限公司)。超凈工作臺(tái)(蘇凈集團(tuán)安泰公司)，CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(MCO-18AIC型，Sanyo，日本)，離心機(jī)(HC-2062)，倒置相差顯微鏡(XD-101型，江南公司)及全自動(dòng)酶標(biāo)儀(Bio-rad-680)。

1.2方法

1.2.1OB分離培養(yǎng) 、傳代純化及鑒定將新生的SD大鼠顱蓋骨剪成碎骨片，通過(guò)酶消化法提取原代OB，并利用差速貼壁法純化OB至第3代[7]。通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察、ALP染色(鈣鈷法)和茜素紅染色對(duì)獲得的OB進(jìn)行鑒定。

1.2.2TsⅡ-A濃度篩選采用CCK-8試劑比色篩選最適宜的TsⅡ-A濃度，第3代OB以2×107個(gè)/L密度的細(xì)胞懸液接種于96孔板(1×10-4L/孔)。實(shí)驗(yàn)組設(shè)置為5×10-3mg/L、5×10-2mg/L及5×10-1mg/L 3個(gè)濃度，對(duì)照組僅加入與實(shí)驗(yàn)組等量的完全培養(yǎng)基DMEM，各組均設(shè)4個(gè)復(fù)孔；于接種后第1、3、5、7天4個(gè)時(shí)間點(diǎn)觀察。

1.2.3成骨細(xì)胞數(shù)量在各時(shí)間點(diǎn)，各組待測(cè)細(xì)胞均用CCK-8溶液(1×10-5L/孔)孵育2 h后，于酶標(biāo)儀450 nm處讀取OD值。

1.2.4ALP活性第3代OB以5×105個(gè)/孔的密度接種于6孔板，依據(jù)CCK-8試劑盒比色試驗(yàn)篩選出最適宜的TsⅡ-A濃度作為實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組僅加入等量完全培養(yǎng)基DMEM,各組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。各組培養(yǎng)至第5天，吸取培養(yǎng)液，1 500 r/min離心10 min取上清液，用ALP試劑檢測(cè)ALP活性，于酶標(biāo)儀520 nm處讀取OD值。以金氏單位(0.1 L液體在37 ℃與基質(zhì)作用15 min產(chǎn)生1 mg酚為1個(gè)金氏單位)表示其活性，計(jì)算公式：

ALP活力=測(cè)定OD值-空白OD值/標(biāo)準(zhǔn)OD值-空白OD值×酚標(biāo)準(zhǔn)品濃度(0.02 g/L)×0.1 L×樣本稀釋倍數(shù)

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2結(jié)果

2.1成骨細(xì)胞鑒定

倒置相差顯微鏡下：原代細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，呈梭狀、三角形、不規(guī)則形，可見(jiàn)數(shù)量不等、長(zhǎng)短不一的突起，部分區(qū)域呈重疊、放射生長(zhǎng)(圖1A)；第3代細(xì)胞體積增大，胞質(zhì)豐富，細(xì)胞突起伸展呈梭形、不規(guī)則形等典型的OB形態(tài)(圖1B)；ALP染色見(jiàn)胞質(zhì)中含灰黑色顆?；驐l塊狀沉淀，胞核染成藍(lán)紫色(圖1C)；茜素紅染色見(jiàn)連續(xù)培養(yǎng)至第21天的第3代OB融合呈疊狀生長(zhǎng)，形成的鈣結(jié)節(jié)，染色呈橘紅色(圖1D)。

注：A為原代OB培養(yǎng)第5天，B為第3代OB培養(yǎng)第5天，C為第3代OB ALP染色，D為第3代OB培養(yǎng)至第21天茜素紅染色圖1　體外培養(yǎng)的OB形態(tài)學(xué)觀察及鑒定(100×)Fig.1　The morphological observation and identification of osteoblasts cultured in vitro

2.2TsⅡ-A對(duì)OB增殖的影響

CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示，各實(shí)驗(yàn)組TsⅡ-A均可促進(jìn)OB增殖；與對(duì)照組比較，5×10-2mg/L、5×10-1mg/L濃度組在第1 、3 、5 天對(duì)OB的促增殖作用顯著(P<0.05)，其中5×10-2mg/L濃度組促增殖作用最為顯著；5×10-3mg/L濃度組在第3 、5 天對(duì)OB的促增殖作用顯著(P<0.05)；各實(shí)驗(yàn)組在第7 天時(shí)間點(diǎn)對(duì)OB的促增殖作用與對(duì)照組相比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1　不同濃度TsII-A對(duì)OB增殖的影響(OD值，

(1)與對(duì)照組比較，P<0.05

2.3ALP活性

對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組比較，培養(yǎng)OB至第5天時(shí)實(shí)驗(yàn)組中ALP活性高于對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2　TsII-A對(duì)ALP活性的影響

3討論

丹參提取于唇形科鼠尾草屬植物的干燥根及根莖，是活血化淤類(lèi)傳統(tǒng)中藥，常用于骨折治療，具有強(qiáng)骨補(bǔ)腎的作用，是中醫(yī)骨傷科方劑中的常用藥。丹參可提高大鼠OB的ALP活性，對(duì)OB具有促細(xì)胞增殖和分化的作用[8]。相關(guān)研究表明丹參亦可加強(qiáng)成骨細(xì)胞樣細(xì)胞合成和分泌骨質(zhì)基質(zhì)，從而促進(jìn)鈣鹽沉積及骨組織形成，加快骨折的愈合速度[9]。TsII-A是丹參中主要有效成分之一,為脂溶性櫻紅色針狀結(jié)晶，除具備傳統(tǒng)的活血調(diào)經(jīng)、祛瘀止痛、養(yǎng)心安神之功效外，還具有抗腫瘤、天然抗氧化、心血管藥理作用、雌激素樣活性、抗菌消炎和促骨代謝等藥理作用[6]。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn) ，TsII-A在BMP-2 誘導(dǎo)下，能促進(jìn)雙潛能間充質(zhì)前體細(xì)胞C2C12分化為OB[10]。

目前，相關(guān)研究確認(rèn)OB富含ALP，具有長(zhǎng)時(shí)間體外培養(yǎng)能發(fā)生礦化、形成鈣結(jié)節(jié)、表達(dá)骨鈣素等典型特征，是長(zhǎng)期以來(lái)作為OB鑒定的主要依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)采用酶消化法獲取大量SD大鼠乳鼠顱蓋骨的OB，通過(guò)細(xì)胞形態(tài)觀察、ALP染色(鈣鈷法)和鈣結(jié)節(jié)染色鑒定，結(jié)果顯示SD大鼠乳鼠顱蓋骨體外分離培養(yǎng)出的細(xì)胞具有OB典型的形態(tài)學(xué)及生物學(xué)特征，符合本實(shí)驗(yàn)研究需要。CCK-8法是用于測(cè)定細(xì)胞增殖或毒性實(shí)驗(yàn)中活細(xì)胞數(shù)目的一種無(wú)放射性的比色檢測(cè)法，CCK-8試劑可直接加入到細(xì)胞樣品中，具有操作簡(jiǎn)易、敏感度高、結(jié)果客觀可靠等優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)采用CCK-8法檢測(cè)在不同濃度TsII-A的作用下對(duì)OB體外增殖的影響，結(jié)果顯示，5×10-3mg/L、5×10-2mg/L及5×10-1mg/L濃度的TsII-A均可促進(jìn)OB增殖，其中5×10-2mg/L濃度組促細(xì)胞增殖作用最明顯，說(shuō)明該藥物濃度為本實(shí)驗(yàn)最適宜作用濃度，提示適宜濃度TsII-A具有促進(jìn)體外培養(yǎng)的SD大鼠乳鼠顱蓋骨OB增殖的作用。ALP是OB成熟的重要標(biāo)志酶之一 ，定量檢測(cè)ALP的活性可以客觀地反映OB的分化水平，ALP活性越高，說(shuō)明OB分化越成熟，本實(shí)驗(yàn)ALP活性檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組比較，培養(yǎng)OB至第5天時(shí)實(shí)驗(yàn)組中ALP活性高于對(duì)照組(P<0.05)，提示了TsII-A對(duì)OB具有促進(jìn)細(xì)胞分化成熟作用。

近年來(lái)有學(xué)者把TsII-A應(yīng)用到探討加速正畸牙移動(dòng)機(jī)理研究中,楊夏晴等[11]研究發(fā)現(xiàn)，在家兔正畸牙移動(dòng)過(guò)程中，口腔局部注射適量TsII-A可有效的促進(jìn)牙槽骨改建，從而加快正畸牙移動(dòng)速度?？谇徽委煹纳飳W(xué)基礎(chǔ)主要體現(xiàn)在頜骨及牙槽骨的可塑性，即頜骨及牙槽骨的增生和吸收兩個(gè)過(guò)程。正畸牙的移動(dòng)過(guò)程中，骨組織的塑建最為重要[12]，骨塑建的快慢直接影響著牙齒移動(dòng)速度，以致影響到正畸矯治療程。正畸矯治力作用下牙槽骨的改建和骨折愈合中骨的改建同樣涉及到OB新生和新骨沉積，OB的發(fā)生、增殖、分化和成熟與頜骨、牙槽骨塑建密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)初步研究了TsII-A對(duì)OB的直接作用，結(jié)果表明，適宜濃度的TsII-A在一定的作用時(shí)間內(nèi)，對(duì)體外培養(yǎng)的OB具有較明顯的促增殖分化作用，說(shuō)明TsII-A可能通過(guò)促進(jìn)OB增殖分化和成熟來(lái)達(dá)到促進(jìn)骨改建，從而影響正畸牙齒的移動(dòng)，這為正畸治療過(guò)程中加速牙移動(dòng)的臨床研究奠定了理論基礎(chǔ)。TsII-A促進(jìn)OB增殖分化的具體機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

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(2016-01-08收稿，2016-03-21修回)

中文編輯： 周凌； 英文編輯： 劉華

Effect of Tanshinone Ⅱ-A on Proliferation and Differentiation of Rats' Osteoblastinvitro

MO Chaolun, ZHANG Junmei, JIA Ying, WANG Souxin, WU You, LIU Miao, ZHANG Fengdan

(DepartmentofStomatology,theAffiliatedHispitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To investigate the effect of Tanshinone Ⅱ-A(TsII-A) on the proliferation and differentiation of rat osteoblast(OB) in vitro. Methods: Infant rats' calvarial OB were isolated, cultured and purified in vitro, and passed to the third generation. The morphological changes and physiologic characters of the third generation OB were observed by inverted microscope. The third generation OB were divided into experimental group and control group. The experimental group was treated by different concentrations of TsII-A while control group were given equal amounts of pure DMEM culture medium. Then the effects of TsII-A on the proliferation and differentiation of rats' OB on the 1stday, the 3rdday, the 5thday, and the 7thday, were observed respectively. The alkaline phosphatase (ALP) activities of OB were determined 5 days after inoculation. Results: The morphological characters of isolated and cultured cells accorded with those of OB. Different concentrations of TsII-AT had significant promotion effects on OB proliferation, of which the 5×10-2mg/L of TsII-AT showed the maximum promotion effect (P<0.05). The ALP activities of experimental group were significantly higher than those of control group 5 days after inoculation (P<0.05). Conclusion: TsII-A has the promotion effect on OB proliferation and differentiation in vitro within certain period of time.

[Key words]tanshinone Ⅱ-A; osteoblast; alkaline phosphatase; proliferation and differentiation; orthodontics; tooth movement

[中圖分類(lèi)號(hào)]R783.5

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1000-2707(2016)04-0391-04

*[基金項(xiàng)目]貴陽(yáng)市科技局基金[筑科合同(20151001)]

**貴州醫(yī)科大學(xué)2013級(jí)碩士研究生

***通信作者 E-mail:zjm46688@126.com

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-04-20網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160420.1811.022.html