高鴻彬，傅　芃，王曉君，王志君，胡葉帥，陳方劍，宋洪杰

(第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院藥學(xué)部，上?！?00433)

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HPLC法測(cè)定養(yǎng)陰清肺口服液中芍藥苷的含量

高鴻彬，傅芃，王曉君，王志君，胡葉帥，陳方劍，宋洪杰*

(第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院藥學(xué)部，上海200433)

摘要：目的建立HPLC法測(cè)定養(yǎng)陰清肺口服液中芍藥苷的含量。方法采用高效液相色譜法。色譜柱：CNW Athena 120A C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-1 mL·L-1磷酸(12∶88)；流速：1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm；進(jìn)樣量：20 μL。結(jié)果芍藥苷在0.593 75～38 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.999 99)，平均回收率為99.74%，RSD為2.21%(n=6)。結(jié)論該方法準(zhǔn)確、靈敏，專屬性強(qiáng)，重復(fù)性好，對(duì)養(yǎng)陰清肺口服液質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的提高具有參考意義。

關(guān)鍵詞：養(yǎng)陰清肺口服液；芍藥苷；高效液相色譜法

養(yǎng)陰清肺口服液是由玄參、地黃、牡丹皮、白芍等8味藥材組成的自制純中藥復(fù)方制劑，臨床療效顯著，可抗菌消炎、提高免疫力，主要用于咽喉干燥疼痛、干咳，可改善少痰或無(wú)痰等癥狀[1]。白芍能養(yǎng)血滋陰、止痛護(hù)肝，牡丹皮能清熱涼血、退虛熱，是該復(fù)方制劑的主藥，現(xiàn)行藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制水平較低，沒(méi)有芍藥和牡丹皮中芍藥苷的含量測(cè)定方法。文獻(xiàn)報(bào)道一般采用高效液相色譜法測(cè)定[2-12]。為保證其質(zhì)量安全可控，本研究以反相高效液相色譜法，建立了我院自制制劑養(yǎng)陰清肺口服液中指標(biāo)性成分芍藥苷含量的檢測(cè)方法，為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1儀器與試藥

1.1儀器島津高效液相色譜儀(日本島津公司)；BT124S電子分析天平(北京Sartorius有限公司)；DL-720A 型超聲波清洗器(上海之信儀器有限公司)。

1.2試藥養(yǎng)陰清肺口服液(第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院藥學(xué)部自制，批號(hào):140917，141119和150211)；芍藥苷對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110736-201438，含量以96.4%計(jì))；乙腈為色譜純；磷酸為分析純；水為蒸餾水。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件色譜柱：CNW Athena 120A C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-1 mL·L-1磷酸(12∶88)；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：室溫；檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2對(duì)照品與供試品溶液的制備

2.2.1對(duì)照品溶液精密稱取芍藥苷對(duì)照品，以體積分?jǐn)?shù)為50%的甲醇定容配制成95 μg·mL-1的對(duì)照品溶液，備用。

2.2.2供試品溶液精密量取養(yǎng)陰清肺口服液0.5 mL，置于50 mL量瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)為50%的甲醇40 mL，超聲處理30 min，放冷，用體積分?jǐn)?shù)為50%的甲醇定容，搖勻，即得供試品溶液。

2.2.3陰性對(duì)照溶液取不含白芍和牡丹皮的陰性對(duì)照樣品，按照供試品溶液配制方法同法制備陰性對(duì)照溶液。

2.3專屬性實(shí)驗(yàn)按照上述色譜條件，依次精密吸

取對(duì)照品、供試品和陰性對(duì)照溶液各20 μL進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果表明，對(duì)照品和供試品溶液色譜圖在相應(yīng)位置上，出現(xiàn)相同保留時(shí)間的色譜峰，而陰性對(duì)照溶液色譜圖在此處則無(wú)吸收峰，表明專屬性良好，結(jié)果見圖1。

圖1HPLC圖

A.對(duì)照品溶液；B.樣品溶液；C.陰性對(duì)照溶液；1.芍藥苷

Fig.1 HPLC chromatograms

A.reference substance；B.sample；C.negative sample；1.paeoniflorin

2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備分別精密量取2.2.1項(xiàng)下的芍藥苷對(duì)照品溶液適量，用體積分?jǐn)?shù)為50%的甲醇稀釋，得到系列質(zhì)量濃度為0.593 75，1.187 5，2.375，4.75，9.5，19和38 μg·mL-1的溶液。按照本實(shí)驗(yàn)的色譜條件，進(jìn)樣20 μL，測(cè)定峰面積值，以對(duì)照品溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。線性方程：Y=24 587X-2 139，r=0.999 99。結(jié)果表明，芍藥苷在0.593 75～38 μg·mL-1范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

2.5精密度實(shí)驗(yàn)精密吸取芍藥苷對(duì)照品溶液20 μL，按照2.1項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，按照峰面積計(jì)算芍藥苷的日內(nèi)精密度RSD為0.44%(n=6)。精密吸取同一對(duì)照品溶液20 μL，每天進(jìn)樣1次，連續(xù)進(jìn)樣5 d，記錄峰面積，計(jì)算得到芍藥苷的日間精密度RSD為0.91%(n=5)，表明儀器的精密度達(dá)到檢測(cè)要求。

2.6檢測(cè)限的確定取2.2.1項(xiàng)下的對(duì)照品溶液進(jìn)行逐步稀釋，以S/N=3∶1計(jì)算，得到芍藥苷的最低檢測(cè)限為1.19 ng。

2.7穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)按照2.2.2項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備批號(hào)為150211的供試品溶液，依次在0，1，2，4，6和8 h分別進(jìn)樣，將峰面積數(shù)值代入回歸方程計(jì)算，供試品中芍藥苷含量的RSD為1.96%(n=6)，結(jié)果顯示，上述溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8重復(fù)性實(shí)驗(yàn)取養(yǎng)陰清肺口服液相同批號(hào)的樣品6份，按照2.2.2項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備供試品，記錄峰面積，計(jì)算得芍藥苷RSD分別為0.86%(n=6)，結(jié)果顯示，該方法的重復(fù)性符合檢測(cè)要求。

2.9加樣回收率實(shí)驗(yàn)精密量取已知芍藥苷含量的養(yǎng)陰清肺口服液0.5 mL(批號(hào)150211，芍藥苷含量約為0.750 mg·mL-1)，平行操作6份，分別精密加入芍藥苷含量為95 μg·mL-1的對(duì)照品溶液4 mL。按照2.2.2項(xiàng)下方法操作并測(cè)定含量，計(jì)算樣品的加樣回收率。結(jié)果顯示，芍藥苷的平均回收率為99.78%，(RSD=2.17%，n=6)，見表1。

表1養(yǎng)陰清肺口服液中芍藥苷加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.1 Recovery test results of paeoniflorin

(n=6)

2.10樣品含量測(cè)定取3個(gè)批號(hào)養(yǎng)陰清肺口服液，按照供試品溶液的處理方法同法制備，按照2.1項(xiàng)下的色譜條件，測(cè)定峰面積值，代入回歸方程計(jì)算樣品中芍藥苷的含量，結(jié)果見表2。

表2養(yǎng)陰清肺口服液中芍藥苷的含量測(cè)定結(jié)果

Tab.2 Determination results of paeoniflorin in Yangyinqingfei Oral Liquid

(n=3)

3討論

3.1檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇通過(guò)紫外掃描結(jié)果發(fā)現(xiàn)，芍藥苷在230 nm附近有最大吸收，本研究選擇230 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2流動(dòng)相的選擇曾用乙腈-1 mL·L-1磷酸溶液(14∶86)、乙腈-水(11∶89)、乙腈-1 mL·L-1磷酸溶液(12∶88)等溶劑系統(tǒng)和比例進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，乙腈-1 mL·L-1磷酸溶液(12∶88)作為流動(dòng)相時(shí)所得峰形對(duì)稱，分離效果好，干擾成分少，保留時(shí)間適宜，作為最終的流動(dòng)相條件。

3.3提取條件的選擇本制劑由于是水溶液，結(jié)合芍藥苷易溶于甲醇的特點(diǎn)，通過(guò)考察不同的提取溶劑如稀乙醇和體積分?jǐn)?shù)為50%的甲醇及提取時(shí)間、提取方法等因素對(duì)指標(biāo)性成分含量的影響，最終確定提取條件為：體積分?jǐn)?shù)為50%的甲醇，超聲提取30 min，此條件可達(dá)到最佳提取效果。

3.4結(jié)果分析測(cè)定結(jié)果顯示，不同批號(hào)的養(yǎng)陰清肺口服液中芍藥苷的含量存在較大差異。這是由于不同批次的藥材，其產(chǎn)地、采收期、干燥方法、加工炮制方法及貯存條件不同所致；另外制劑本身的貯存時(shí)間也會(huì)使含量存在一定的變化。因此，對(duì)其中芍藥苷含量范圍的確定仍需進(jìn)一步跟蹤研究。

本文建立的HPLC法測(cè)定養(yǎng)陰清肺口服液中芍藥苷的含量，方法簡(jiǎn)便，專屬性強(qiáng)，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，為完善養(yǎng)陰清肺口服液的質(zhì)量控制研究提供一定的參考依據(jù)。

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Determination of paeoniflorin in Yangyinqingfei Oral Liquid by HPLC

GAO Hongbin，F(xiàn)U Peng，WANG Xiaojun， WANG Zhijun，HU Yeshuai，CHEN Fangjian，SONG Hongjie*

(Department of Pharmacy， Changhai Hospital， the Second Military Medical University，Shanghai 200433，China)

Abstract:ObjectiveTo develop an HPLC method for the determination of paeoniflorin content in Yangyinqingfei Oral Liquid. MethodsHPLC method was used in this study，with CNW Athena 120A C18(150 mm×4.6 mm，5 μm) as the chromatographic column， acetonitrile-1 mL·L-1phosphoric acid (12∶88) as the mobile phase.The flow rate was 1.0 mL·min-1,the detection wavelength was 230 nm and the injection volume was 20 μL. Results Paeoniflorin showed a good linear relationship within the range of 0.593 75-38 μg·mL-1(r=0.999 99)，and the average recovery rate was 99.74% with RSD of 2.21%(n=6).ConclusionThe established HPLC method is accurate，sensitive，specific and reproducible.It could be used for the quality control of Yangyinqingfei Oral Liquid.

Key words:Yangyinqingfei Oral Liquid；paeoniflorin；HPLC

(收稿日期：2015-07-23)

中圖分類號(hào)：R927.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1004-2407(2016)03-0254-03

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2016.03.010

*通信作者：宋洪杰，女，副主任藥師

第一作者簡(jiǎn)介：共同高鴻彬，男，主管藥師;

基金項(xiàng)目：軍隊(duì)醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑標(biāo)準(zhǔn)提高計(jì)劃科研專項(xiàng)課題(編號(hào):14ZJZ0-3)

傅芃，女，副主任藥師