陳卓爾，古娜娜·對山別克，烏　英，侯寶林*，海力茜·陶爾大洪*

(1.新疆醫(yī)科大學藥學院，烏魯木齊　830054；2.新疆醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院藥劑科，烏魯木齊　830000；3.新疆自治區(qū)人民醫(yī)院藥學部，烏魯木齊　830000)

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新疆蕪菁水提物抗腫瘤活性初步研究

陳卓爾1，古娜娜·對山別克2，烏英3，侯寶林1*，海力茜·陶爾大洪1*

(1.新疆醫(yī)科大學藥學院，烏魯木齊830054；2.新疆醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院藥劑科，烏魯木齊830000；3.新疆自治區(qū)人民醫(yī)院藥學部，烏魯木齊830000)

摘要：目的初步分析新疆蕪菁水提物(BAE)對Lewis腫瘤的抑制作用。方法利用小鼠Lewis腫瘤移植模型，測定BAE對荷瘤小鼠的抑瘤率、脾臟指數(shù)、生命延長率，并通過體外淋巴細胞轉化實驗(MTT法)觀察對小鼠免疫系統(tǒng)的影響。結果BAE各組瘤質量與模型組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，BAE各組脾臟指數(shù)與模型組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，BAE各組生存時間與模型組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，同時初步顯示,BAE對小鼠體外淋巴細胞轉化也有一定增強作用。結論新疆蕪菁水提物(BAE)可以增加抑瘤率、脾臟指數(shù)、生命延長率，并初步說明其對小鼠體外淋巴細胞轉化也有一定增強作用。

關鍵詞：蕪菁；水提物；抗腫瘤

蕪菁(Brassica rapa L.)，屬于十字花科蕓苔屬蕓苔種，在維吾爾藥中，蕪菁名為恰麻古，是一種藥食兼用植物，臨床用于滋陰潤肺，平喘、止咳、清除體內異常黏液質等異常體液。近代藥理研究發(fā)現(xiàn)，蕪菁具有止咳、祛痰及平喘[1]的功效。在本課題組之前的研究中[2]，已初步鑒定新疆蕪菁水提物(BAE)中含有糖及其苷[3]、黃酮類、氨基酸和蛋白質、皂苷、鞣質和酚類等成分。本文以新疆蕪菁為原料，首先對干燥蕪菁藥材進行水提[4]，得到蕪菁水提物(BAE)，進而初步探討B(tài)AE對Lewis腫瘤的體內抑制作用和體外淋巴細胞轉化(MTT)[5-6]等生物活性，為今后蕪菁藥材的利用和開發(fā)奠定基礎。

1儀器與材料

1.1儀器DK-S24型電熱恒溫水浴鍋，上海精密實驗設備有限公司；S54紫外-可見分光光度計，上海分析儀器廠；TDL80-2B離心機，上海安亭科學儀器廠；CJ-2F 型超凈工作臺 ，蘇州市凈化設備廠；CO2培養(yǎng)箱，上海一恒實驗設備有限公司；EPSON Stylus C65 型酶標儀，愛普生(中國)有限公司；96 孔細胞培養(yǎng)板，美國CORNING 公司。

1.2試藥新疆蕪菁，購于阿克蘇柯坪縣，經(jīng)新疆醫(yī)科大學藥學院生藥/天藥教研室帕麗達·阿布力孜教授鑒定，為十字花科蕓苔屬蕓苔種蕪菁(BrassicarapaL.)地下莖。蕪菁水提物(BAE)：實驗室自制的水提物；環(huán)磷酰胺CTX，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號20090124；刀豆蛋白A(ConA)，美國sigma公司；脂多糖(LPS)，美國sigma公司；噻唑藍(MTT)，美國Sigma公司；RPMI-1640 培養(yǎng)液，北京天潤善達生物科技有限公司。

1.3動物BALB/C小鼠，體質量18～22 g，均為雌性小鼠，由新疆醫(yī)科大學實驗動物中心提供。Lewis細胞株，購于上海生命科學研究院。

2方法

2.1蕪菁水提物(BAE)的制備采用水提法提取蕪菁，提取工藝為：固液比1∶30(g·mL-1)，提取溫度為90 ℃，提取3次，每次2 h。

2.2蕪菁水提物抗Lewis腫瘤的實驗

2.2.1腫瘤模型的建立及分組取BALB/C小鼠72只，皮膚經(jīng)消毒后，將0.2 mL Lewis瘤細胞液(瘤細胞懸液細胞數(shù)為1×107個·mL-1)注射于每只小鼠右前肢腋下，接種方式為皮下接種。接種24 h后，將小鼠隨機分為6組，每組12只，分別為模型組(生理鹽水0.02 mL·g-1)、陽性對照組(環(huán)磷酰胺，30 mg·kg-1·d-1)、BAE低劑量組(50 mg·kg-1·d-1)、中劑量組(100 mg·kg-1·d-1)、高劑量組(200 mg·kg-1·d-1)、聯(lián)合治療組(BAE 200 mg·kg-1·d-1+環(huán)磷酰胺組30 mg·kg-1·d-1)。各組小鼠均為灌胃給藥，每日1次，連續(xù)給藥10 d。

2.2.2抑瘤率和脾臟指數(shù)的測定小鼠建模、分組及給藥方式與2.2.1項下方法相同。停藥24 h后，稱取小鼠質量，處死，并小心剝離瘤組織，分離脾臟，分別稱取質量，并計算脾臟指數(shù)[7-8]。抑瘤率=(對照組平均瘤質量-治療組平均瘤質量)/對照組平均瘤質量×100%；脾臟指數(shù)(mg·g-1)=脾質量/體質量。

2.2.3小鼠存活期與生命延長率的測定小鼠存活期自小鼠接種腫瘤之日開始，到給藥組小鼠全部死亡為止，并記錄各組小鼠死亡時間，計算小鼠生命延長率。實驗動物生命延長率=(給藥組平均生存時間-空白組平均生存時間)/空白組平均生存時間×100%。

2.3蕪菁水提物對體外淋巴細胞轉化功能的影響(MTT法)解剖小鼠，小心剝離小鼠脾臟，研磨并加入RPMI-1640培養(yǎng)液，200目篩網(wǎng)過濾后，離心，稀釋后制成1×107個·mL-1單細胞懸液。在超凈工作臺上，將脾細胞懸液分別加入96孔板中，每孔100 μL，并設置平行孔。按以下要求加樣：(1)實驗組(ConA)：100 μL脾細胞懸液+50 μL不同質量濃度BAE溶液+50 μL ConA溶液(5 μg· mL-1)+50 μL RPMI-1640培養(yǎng)液。對照組：100 μL脾細胞懸液+50 μL ConA溶液(5 μg·mL-1)+100 μL RPMI-1640培養(yǎng)液。觀察T細胞增殖反應。(2)實驗組(LPS)：100 μL脾細胞懸液+50 μL不同質量濃度BAE溶液+50 μL LPS溶液(5 μg·mL-1)+50 μL RPMI-1640培養(yǎng)液。對照組：100 μL脾細胞懸液+50 μL LPS溶液(5 μg·mL-1)+100 μL RPMI-1640培養(yǎng)液。觀察B細胞增殖反應。BAE質量濃度分別為0.01，0.05，0.25，0.5，0.75和1 mg·mL-1。在37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，棄上清液，每孔加入20 μL 5 mg·mL-1的噻唑藍液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清液，加入二甲亞砜150 μL，靜置30 min，用振蕩器振蕩混勻，用酶標儀測定各孔A570值。

3結果

3.1荷瘤小鼠抑瘤率和脾臟指數(shù)除模型組外，其他各組小鼠瘤質量均減小，腫瘤均被明顯抑制，并且在BAE各劑量組中抑瘤效果與劑量呈正相關。BAE各劑量組小鼠脾臟指數(shù)較模型組顯著提高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。而CTX組脾臟指數(shù)小于模型組，可能由于CTX作為一種化療藥物，具有較強的免疫抑制功能，對小鼠脾臟有嚴重的毒性和不良反應，抑制脾臟生長。聯(lián)合治療組脾臟指數(shù)大于CTX組，但小于BAE各劑量組，說明多糖在改善荷瘤小鼠免疫功能的同時，可以降低CTX對脾臟造成的損傷。見表1。

表16組荷瘤小鼠腫瘤抑制率及脾臟指數(shù)測定結果

Tab.1 The effect of BAE on tumor inhibition ratio and spleen index in the 6 groups of turnor-bearing mice

±s)

注：**P<0.01，差異有統(tǒng)計學意義；*P<0.05，差異有統(tǒng)計學意義。

3.2荷瘤小鼠存活時間及生命延長率給藥組小鼠生存時間增加，與模型組相比，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。BAE各劑量組小鼠生存時間低于CTX組。聯(lián)合治療組小鼠生存時間最長，生命延長率達到78.1 %。見表2。

3.3荷瘤小鼠脾淋巴細胞功能當BAE質量濃度為0.5，0.75和1 mg·mL-1時，實驗組(加ConA)A值與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，初步說明其可以誘導T淋巴細胞增殖。當BAE質量濃度為0.25，0.5，0.75和1 mg·mL-1時，實驗組(加LPS)A值與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，初步說明可以誘導B淋巴細胞增殖。見表3。

表26組荷瘤小鼠存活時間及生命延長率測定結果

Tab.2 The effect of BAE on survival times and extension ratio of life span in the 6 groups of turnor-bearing mice

±s， n=12)

表36組小鼠脾淋巴細胞轉化功能測定結果

Tab.3 The effect of BAE on splenic lymphocyte transformation in the 6 groups of turnor-bearing mice

±s， n=12)

注：**P<0.01，差異具有統(tǒng)計學意義；*P<0.05，差異具有統(tǒng)計學意義。

4討論

本實驗采用了Lewis移植性腫瘤模型進行了BAE體內抗腫瘤的初步研究。BAE與環(huán)磷酰胺聯(lián)合治療組小鼠腫瘤被明顯抑制，瘤質量減小，抑瘤效果很好，生命延長率增加，并且脾臟指數(shù)較陽性對照組有較明顯的增加，說明BAE能明顯地改善環(huán)磷酰胺造成的免疫低下，同時，對荷瘤小鼠的免疫器官有一定的保護作用。提示BAE可以作為環(huán)磷酰胺的輔助藥物，減輕傳統(tǒng)化學藥物的不良反應，減輕患者的痛苦，一定程度延長其生命。另外，BAE與環(huán)磷酰胺的作用機制不盡相同，環(huán)磷酰胺有免疫抑制作用，所以BAE不能與環(huán)磷酰胺同時給藥。本實驗過程中兩者的給藥時間間隔初步設定為3 h。

脾臟是機體最大的免疫器官，主要功能是參與免疫反應，并且含有大量的淋巴細胞和巨噬細胞，是機體細胞免疫和體液免疫的中心。脾細胞增殖是反映細胞免疫最直接的指標，T淋巴細胞和B淋巴細胞受到抗原物質刺激后能分裂增殖、發(fā)生特異性免疫應答、產生抗體或淋巴因子。用藥物刺激淋巴細胞的增殖，檢測藥物對T、B細胞功能的影響是探討藥物抗腫瘤作用機制和篩選其活性強弱的首要方法。本研

究結果顯示，與模型組相比，BAE各劑量組均能夠抑制荷瘤小鼠腫瘤，而BAE在0.5～1 mg·mL-1的范圍內，可以同時誘導T、B細胞增殖，說明BAE有脾淋巴細胞轉化能力，進而具有抗腫瘤活性。提示BAE抗腫瘤作用機制之一是通過活化T、B淋巴細胞增強而發(fā)揮作用。

本實驗針對蕪菁水提物抗腫瘤活性的初步研究，水提物具體組成未知，僅在本課題組之前的研究中發(fā)現(xiàn)，水提物中總多糖含量超過10%，其余組分有待進一步研究其起效成分和作用機制，擬通過分離純化確定其中主要作用的1種或幾種成分。

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Study on the anti-tumor effect of aqueous extract fromBrassicarapaL.

CHEN Zhuoer1， Gunana DUISHANBIEKE2， WU Ying3， HOU Baolin1*， Hailiqian TAOERDAHONG1*

(1. College of Pharmacy， Xinjiang Medical University， Urumqi 830054， China； 2. Department of Pharmacy， the Third Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University ，Urumqi 830000， China； 3. Department of Pharmacy， the People′s Hospital of Xinjiang Uygur Autonomous Region，Urumqi 830000， China)

Abstract:ObjectiveTo explore the inhibitory action of aqueous extract from Brassica rapa L.(BAE) on the transplantable cancer mice.MethodsThe anti-tumor effects of BAE were tested in mice with transplanted tumorsarcom Lewis. The tumor inhibition rate， life span， spleen index and the lymphocyte transformation function in vitro were evaluated. ResultsThe tumor weight of BAE groups showed statistical significance compared with that of NS group (P<0.01)， the spleen index of BAE groups had statistical significance compared with that of NS group (P<0.05)， and survival days of polysaccharides groups demonstrated statistical significance compared with that of NS group (P<0.01). Furthermore， it was shown that lymphocyte transformation function in vitro could be enhanced by BAE.ConclusionThe tumor inhibitory rate， the spleen index and life prolonging rate could be increased by BAE. In addition， the preliminary results show that lymphocyte transformation function in vitro could be enhanced by BAE.

Key words:Brassica rapa L.；aqueous extracts； anti-tumor

(收稿日期：2015-10-10)

中圖分類號：R965

文獻標志碼：

文章編號：1004-2407(2016)03-0264-04

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2016.03.013

作者簡介：陳卓爾，女，碩士研究生

基金項目：國家自然科學基金資助項目(編號：81460615)；新疆地方病分子生物學重點實驗室開放課題項目(編號：XJDX0208-2012)

*共同通信作者：侯寶林，男，碩士研究生

海力茜·陶爾大洪，女，教授