陳　光　王　階　高嘉良　董　艷

100053 北京，中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門(mén)醫(yī)院心血管科

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冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病血瘀證基因組學(xué)研究進(jìn)展

陳光王階高嘉良董艷

100053 北京，中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門(mén)醫(yī)院心血管科

【摘要】冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(冠心病)血瘀證基因組學(xué)水平的研究，主要涉及結(jié)構(gòu)基因組學(xué)與功能基因組學(xué)。結(jié)構(gòu)基因組學(xué)主要研究冠心病血瘀證相關(guān)基因的單核苷酸多態(tài)性。功能基因組學(xué)是從轉(zhuǎn)錄水平研究基因差異表達(dá)譜。該文主要介紹冠心病血瘀證基因組學(xué)研究進(jìn)展、存在的問(wèn)題和研究前景。

【關(guān)鍵詞】冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病；血瘀證；基因組學(xué)；單核苷酸多態(tài)性；基因表達(dá)譜；證候

血瘀證是中醫(yī)臨床各科常見(jiàn)的一種證候。冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(冠心病)最常見(jiàn)的證型之一即為血瘀證?；蚪M學(xué)(genomics)是闡明整個(gè)基因組的結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系以及基因之間相互作用的科學(xué)，包括結(jié)構(gòu)基因組學(xué)、功能基因組學(xué)和比較基因組學(xué)。隨著近年中醫(yī)藥研究現(xiàn)代化的進(jìn)展，一些學(xué)者應(yīng)用基因組學(xué)方法，從分子水平探討冠心病血瘀證的證候?qū)嵸|(zhì)，主要涉及結(jié)構(gòu)基因組學(xué)和功能基因組學(xué)。

1結(jié)構(gòu)基因組學(xué)

結(jié)構(gòu)基因組學(xué)的主要內(nèi)容是基因組作圖和大規(guī)模測(cè)序。其中基因組作圖主要包括限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性、可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列以及單核苷酸多態(tài)性(SNP)。目前對(duì)于冠心病血瘀證基因組學(xué)的研究主要涉及SNP。

1.1研究現(xiàn)狀

對(duì)于冠心病血瘀證SNP的研究主要涉及PAF-AH基因、血小板膜糖蛋白Ⅲa基因、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶基因、血管緊張素原基因、肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2A基因。研究顯示，PAF-AH基因R92H、I198T多態(tài)性與冠心病血瘀證相關(guān)[1]。陳可冀院士團(tuán)隊(duì)的研究表明，血小板膜糖蛋白Ⅲa的PLA1/PLA2基因多態(tài)位點(diǎn)不是漢族人冠心病和冠心病血瘀證的危險(xiǎn)因素[2]。李建軍等[3]運(yùn)用PCR結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定了119例冠心病血瘀證和41例非血瘀證患者血管緊張素轉(zhuǎn)換酶基因多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)冠心病血瘀證與該基因多態(tài)性無(wú)明顯相關(guān)性(P>0.05)。胡志希等[4]運(yùn)用PCR技術(shù)檢測(cè)了41例早發(fā)冠心病血瘀證和45例非血瘀證患者血管緊張素轉(zhuǎn)換酶基因多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)該基因DD基因型及D等位基因與早發(fā)冠心病血瘀證發(fā)病相關(guān)(P<0.05)。李琳等[5]采用飛行時(shí)間質(zhì)譜分析技術(shù)檢測(cè)了25例早發(fā)冠心病血瘀證和30例非血瘀證患者血管緊張素轉(zhuǎn)換酶基因和肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2A基因的多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)前者rs4293、rs4267385位點(diǎn)與冠心病血瘀證無(wú)關(guān)，rs4343與冠心病血瘀證相關(guān)(P<0.05)；未發(fā)現(xiàn)后者與冠心病血瘀證相關(guān)。袁倩等[6]運(yùn)用飛行時(shí)間質(zhì)譜分析技術(shù)和等位基因特異性PCR技術(shù)，檢測(cè)了50例早發(fā)冠心病血瘀證和26例非血瘀證患者血管緊張素原基因rs4762和rs699位點(diǎn)多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)SNP位點(diǎn)與湖南地區(qū)人群早發(fā)冠心病血瘀證均有相關(guān)性(P<0.01)。

1.2存在問(wèn)題解析

目前證候相關(guān)SNP的研究存在以下3個(gè)問(wèn)題。第一，SNP位點(diǎn)豐富且分布廣泛，選擇待測(cè)基因與SNP位點(diǎn)難度較大，這也是導(dǎo)致結(jié)果陽(yáng)性率低的原因之一。筆者認(rèn)為，應(yīng)結(jié)合目前血瘀證的相關(guān)機(jī)制，如微循環(huán)障礙、血液高凝狀態(tài)、血小板活化和黏附聚集、血栓形成、免疫功能障礙相關(guān)基因，探討調(diào)節(jié)通路的上下游關(guān)系。例如，血漿同型半胱氨酸水平過(guò)高會(huì)引發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化，這與血瘀證明顯相關(guān)，而同型半胱氨酸甲基化反應(yīng)需要關(guān)鍵酶亞甲基四氫葉酸還原酶參與，N5,N10亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)基因第4外顯子的C677T堿基突變最為常見(jiàn)。胡木林等[7]選擇該基因進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)MTHFR基因TT型可能是缺血性中風(fēng)病血瘀證發(fā)病的易感危險(xiǎn)因素之一。第二，目前各研究的樣本量較小，且待測(cè)人群的特征是對(duì)照設(shè)計(jì)的關(guān)鍵點(diǎn)，進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行驗(yàn)證十分必要。第三，表型與基因型之間存在著“一對(duì)多”的關(guān)系，是預(yù)測(cè)高危SNP的理論基礎(chǔ)。因此，檢測(cè)單一基因的某一個(gè)位點(diǎn)遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，根據(jù)小樣本多基因多位點(diǎn)的篩選結(jié)果進(jìn)行擴(kuò)大樣本量驗(yàn)證，是解決方法之一。

1.3研究思路展望

根據(jù)中醫(yī)理論思考SNP的特點(diǎn)，可以得出以下兩點(diǎn)啟示。第一，SNP是個(gè)體間存在先天性差異的重要遺傳基礎(chǔ)。一個(gè)人的體質(zhì)很大程度上取決于先天因素，并體現(xiàn)在對(duì)某些疾病的易感性和對(duì)證候發(fā)生的傾向性。因此，SNP作為重要的內(nèi)在遺傳因素，可能是“血瘀體質(zhì)”客觀化研究取得進(jìn)展的突破口。第二，中醫(yī)學(xué)與基因組學(xué)在整體觀的思維方式上是一致的，但中醫(yī)證候的發(fā)生、發(fā)展復(fù)雜，全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)也許可以為尋找與證候相關(guān)的遺傳因素提供思路。然而，目前大部分研究是利用“人類基因組單體型圖計(jì)劃(HapMap)”中發(fā)現(xiàn)的SNP制作的芯片，但許多疾病是由稀有突變?cè)斐?，芯片往往遺漏了這部分信息。因此，全基因組外顯子測(cè)序，甚至完整的全基因組測(cè)序有待進(jìn)一步利用。

2功能基因組學(xué)

功能基因組學(xué)的重要部分是轉(zhuǎn)錄組學(xué)。轉(zhuǎn)錄組學(xué)是在整體水平上研究細(xì)胞編碼基因的轉(zhuǎn)錄情況及轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律，闡明生物體在特定生理或病理狀態(tài)下表達(dá)的所有種類的mRNA及其功能。2.1研究現(xiàn)狀分析

目前冠心病血瘀證mRNA相關(guān)研究主要利用微陣列、基因表達(dá)系列分析、大規(guī)模平行信號(hào)測(cè)序系統(tǒng)等技術(shù)，對(duì)血瘀證與非血瘀證患者進(jìn)行檢測(cè)，試圖發(fā)現(xiàn)差異基因表達(dá)譜。陳可冀院士團(tuán)隊(duì)[8]應(yīng)用寡核苷酸基因芯片技術(shù)，分析了冠心病血瘀證、非血瘀證及健康人的基因表達(dá)譜差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與血瘀證相關(guān)的差異基因有48個(gè)，其中上調(diào)基因26個(gè)，下調(diào)基因22個(gè)。王階等[9-12]運(yùn)用差異顯示方法研究冠心病血瘀證患者外周血白細(xì)胞的mRNA,電泳結(jié)果顯示出95條差異條帶，通過(guò)反向Northern法驗(yàn)證差異條帶，得出28個(gè)差異基因，并將其與美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)人類基因庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，獲得了與人類基因100%同源的3個(gè)差異基因(b13、49b、23b)，99%同源的2個(gè)差異基因(b12、36a)，98%同源的2個(gè)差異基因(25b、57d)，其中b13與23b分別是淋巴細(xì)胞活化信號(hào)分子家族成員1(SLAMF1)與Bcl-2相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子1(BCLF1)，臨床驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，二者在冠心病血瘀證組中顯著高表達(dá)。王萍等[13]采用表達(dá)譜芯片檢測(cè)了16例冠心病血瘀證患者和7名健康人的差異基因表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)了與冠心病血瘀證相關(guān)的差異基因26個(gè)，其中上調(diào)7個(gè)，下調(diào)19個(gè)。袁肇凱等[14]采用基因芯片技術(shù)，檢測(cè)了家系冠心病血瘀證、家系冠心病非血瘀證患者的差異基因表達(dá)譜，結(jié)果顯示家系冠心病血瘀證相關(guān)的差異基因有8個(gè)，上調(diào)4個(gè)，下調(diào)4個(gè)， KEGG 通路分析顯示差異主要涉及趨化因子、白細(xì)胞介素、補(bǔ)體系統(tǒng)、基質(zhì)金屬蛋白酶、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、內(nèi)皮細(xì)胞黏附因子。

2.2存在問(wèn)題解析

目前血瘀證基因表達(dá)譜研究尚存在以下4點(diǎn)問(wèn)題。第一，小樣本量芯片檢測(cè)的個(gè)體差異較大，擴(kuò)大樣本量驗(yàn)證和配對(duì)樣本設(shè)計(jì)較為關(guān)鍵。第二，冠心病血瘀證診斷標(biāo)準(zhǔn)和芯片技術(shù)不統(tǒng)一。統(tǒng)一診斷標(biāo)準(zhǔn)和芯片技術(shù)是整合各類研究的基礎(chǔ)。第三，某一種芯片只能檢測(cè)該芯片包含的捕獲目標(biāo)序列，對(duì)于其他基因的檢測(cè)則存在盲點(diǎn)，這是芯片技術(shù)的缺陷之一。第四，單純以基因表達(dá)譜研究血瘀證的實(shí)質(zhì)存在還原論思維方法的局限性，對(duì)于差異表達(dá)譜的調(diào)節(jié)機(jī)制研究仍有必要，因?yàn)檎{(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建是從分子層面選擇預(yù)防和治療疾病靶點(diǎn)的基礎(chǔ)。

2.3研究思路展望

基因表達(dá)譜可以提供某種條件下各種基因表達(dá)的信息，通過(guò)表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)技術(shù)推測(cè)相應(yīng)未知基因的功能。然而，轉(zhuǎn)錄組學(xué)對(duì)整體功能的解釋較為局限。合成生物學(xué)可以很好地解決這個(gè)問(wèn)題[15]。合成生物學(xué)基于全基因組序列和“三大系統(tǒng)”(代謝途徑、信號(hào)傳導(dǎo)通路、基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò))的研究成果，利用核苷酸序列合成技術(shù)，人工設(shè)計(jì)和制造生物系統(tǒng)，研究保證生物存活所必需的最小基因組，從而更深入地理解生命本質(zhì)。

3中醫(yī)證候本質(zhì)研究

3.1目前觀點(diǎn)分析

證候本質(zhì)的研究歷經(jīng)了幾十年的發(fā)展，累積了大量結(jié)果，但尚未出現(xiàn)學(xué)術(shù)界認(rèn)同的證候診斷“金標(biāo)準(zhǔn)”。仍有學(xué)者認(rèn)為證候并非客觀存在，而是借助現(xiàn)象構(gòu)造的模型，抽象思維并不能被實(shí)驗(yàn)性研究所證實(shí)[16]。另外，也有學(xué)者認(rèn)為，證候的本質(zhì)并不等同于證候的物質(zhì)基礎(chǔ)[17]。證候研究的過(guò)程中往往受到不同患者疾病差異的影響，而患者證候的復(fù)雜性、證候診斷標(biāo)準(zhǔn)的多樣性、動(dòng)物證候模型建立標(biāo)準(zhǔn)的不確定性，都是研究證候?qū)嵸|(zhì)的難點(diǎn)。

3.2證候研究展望

針對(duì)證候?qū)嵸|(zhì)研究的諸多問(wèn)題與爭(zhēng)議，筆者認(rèn)為：病證結(jié)合證候?qū)嵸|(zhì)研究，可以避免因?yàn)榧膊”旧淼牟町悓?dǎo)致證候研究結(jié)果的不確定性。此外，基于標(biāo)準(zhǔn)化證候診斷積分的復(fù)雜證候配對(duì)樣本試驗(yàn)，基于動(dòng)物四診信息采集的證候模型的標(biāo)準(zhǔn)建立，是使試驗(yàn)更加嚴(yán)密并得到國(guó)際認(rèn)可的重要途徑。

3.3基因組學(xué)前景

基因組學(xué)在整體觀方面的優(yōu)勢(shì)為中醫(yī)本質(zhì)研究提供了平臺(tái)。然而，證候本身還映射著患者所處的社會(huì)、環(huán)境、氣候及其自身文化素養(yǎng)、性格情操等方面，基因組學(xué)研究是否可以滿足證候更高層次解讀的要求仍需要實(shí)踐檢驗(yàn)。

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(收稿：2015-10-29 修回：2016-02-03)

(本文編輯：梁英超)

doi:10.3969/j.issn.1673-6583.2016.02.003

通信作者：王階，Email:wangjie0103@126.com

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(81473561)；國(guó)家科技部“重大新藥創(chuàng)制”重大科技專項(xiàng)(2013ZX09301307)；國(guó)家科技部“重大新藥創(chuàng)制”重大科技專項(xiàng)(2012ZX09102-201-006)