肖熙鷗 林文秋 李威 劉國強 張曉虹 呂玲玲

摘要：【目的】利用EMS誘變進行茄子種質資源創(chuàng)新，為茄子新品種選育及其相關基因功能研究提供良好材料?！痉椒ā吭?5 ℃下利用不同濃度（0、0.5%、1.0%、1.5%和2.0%）的EMS溶液誘變處理茄子種子，篩選出適宜的EMS誘變濃度；然后以適宜濃度的EMS誘變液處理茄子種子，經過催芽后播種、定植，在植株的整個生育期進行相關性狀調查?！窘Y果】以1.0% EMS誘變處理18 h后，茄子種子的發(fā)芽率可達80%，適宜構建茄子突變體庫。20 g茄子種子經1.0% EMS誘變處理18 h后催芽播種，最終獲得984份M1代突變材料，且這些突變材料在長勢、葉片形狀、葉片顏色、分枝數、果實長度、果實顏色及雄性不育等方面表現(xiàn)出豐富的變異?！窘Y論】經EMS誘變處理獲得的M1代茄子表現(xiàn)出豐富的變異，可為其新品種選育及基因功能研究提供良好材料。

關鍵詞： 茄子；EMS誘變；種質資源；性狀突變；創(chuàng)新

中圖分類號： S641.1 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）08-1247-07

Abstract：【Objective】In order to provide fine resources for breeding of new eggplant variety and research of its gene function， the germplasm resources of eggplant were innovated by EMS mutagenesis. 【Method】Under 25 ℃ condition， the eggplant seeds was mutagenized by different concentrations of EMS（0%， 0.5%， 1.0%， 1.5% and 2.0%）， respectively， so as to select optimal EMS concentration. Then the eggplant seed was mutagenized by EMS. After accelerating germination， the seedlings were transplanted to field. The mutant traits were investigated during growth period. 【Result】After being mutagenized by 1.0% EMS for 18 h， the seed germination rate was 80%， which indicated that 1% EMS was suitable for construction of EMS mutants library. A total of 984 M1 generation mutants were gained after 20 g eggplant seeds was mutagenized by 1.0% EMS. There were remarkable variations in plant growth， leaf shape， leaf color， fruit length， fruit color， fruit-bearing character and male sterile of these mutants. 【Conclusion】The M1 generation eggplant gained by EMS mutagenesis is suitable for eggplant variety breeding and gene function research because it shows abundant variations.

Key words： eggplant； EMS mutation； germplasm resource； trait mutation； innovation

0 引言

【研究意義】茄子（Solanum melongena L.）原產于印度，其栽培種的遺傳背景相對狹窄（肖熙鷗等，2012；馮英娜等，2014），且由于不同地區(qū)間的種質資源不斷交流，導致茄子種質同質化嚴重，遺傳多樣性減少（廖毅等，2009）。隨著茄子基因組測序的完成（Hirakawa et al.，2014），茄子的研究逐步進入后基因組時代。與圖位克隆相比，以突變體庫為基礎，利用基因組重測序技術定位基因具有快速、準確等特點（Just et al.，2013；Nordstr■m et al.，2013；Thole and Strader，2015）。此外，利用TILLING（Targeting induced local lesions in genomes）反向篩選突變體，也是目前研究基因功能最有效的手段之一（McCallum et al.，2000；石從廣等，2010）。因此，加強茄子種質資源創(chuàng)新，擴展其遺傳基礎對茄子新品種選育具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】通過化學、物理、生物及航空誘導等手段能夠顯著提高植物的誘變率（徐明和路鐵剛，2011），如邱正高等（2009）利用航空誘變，獲得了玉米矮桿突變體；Saito等（2011）利用Co60照射誘變番茄獲得了豐富的突變體，成功構建了番茄的突變體庫。甲基磺酸乙酯（Ethylmethylsulfone，EMS）是最常用的誘變劑，因具有誘變效率高且不易造成染色體畸變的優(yōu)點而被廣泛用于構建突變體庫。在種質創(chuàng)新方面，已在油菜（石從廣等，2010；張鳳啟等，2010）、水稻（邱福林，2007；Takagi et al.，2013）、小麥（徐艷花等，2010；Zhang et al.，2015）等作物上應用EMS誘變成功構建了突變體庫，這些突變體為種質資源創(chuàng)新和新品種選育提供了良好的材料。在基礎研究方面，已利用EMS突變體克隆獲得多個與植物重要農藝性狀相關的基因，如Takagi等（2013）利用水稻突變體克隆了水稻耐鹽基因（hst），Zhou等（2015）利用黃瓜突變體克隆了控制果色的ARC5基因?？梢姡珽MS突變體為基因資源的利用及輔助育種奠定了良好基礎（Abe et al.，2011；Takagi et al.，2013，2015）?！颈狙芯壳腥朦c】目前，茄子種質資源的創(chuàng)新主要是利用常規(guī)雜交、遠緣雜交等（曹必好等，2009；王益奎等，2015），而利用EMS誘導進行茄子種質創(chuàng)新的研究鮮見報道。【擬解決的關鍵問題】以穩(wěn)定遺傳的茄子自交系為材料，探究不同EMS濃度對茄子發(fā)芽率的影響，建立茄子EMS誘變體系，并利用建立的體系誘變茄子種子進行種質資源創(chuàng)新，以期為茄子新品種選育和基因功能研究提供良好的材料。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

以遺傳穩(wěn)定的自交系E31-1為試驗材料，其果實呈棒狀，果皮紫色，果長約35 cm，花冠紫色，高抗青枯病。選取顆粒飽滿、無病變的種子進行EMS誘變。EMS（產品號M880-5g）購自美國Sigma公司。

1. 2 誘變體系建立

利用磷酸鉀緩沖液（pH 7.2）配制不同濃度的EMS誘變液（0、0.5%、1.0%、1.5%和2.0%），將100粒茄子種子置于10 mL EMS誘變液中，25 ℃下?lián)u床（100 r/min）處理18 h后，利用5%硫代硫酸鈉終止反應，清水沖洗3～4次，洗凈種子表面上的殘留物。然后28 ℃下催芽，統(tǒng)計發(fā)芽率，20 d后仍未發(fā)芽的種子視為不發(fā)芽。

1. 3 誘變體庫構建

利用1.0% EMS誘變液按上述方法處理20 g茄子種子，將催芽的茄子種子播種于50孔穴盤中育苗，1個月后移栽于中國熱帶農業(yè)科學院南亞熱帶作物研究所蔬菜課題組基地，按照常規(guī)管理技術進行栽培管理。田間調查參考李錫香和朱德蔚（2000）的《茄子種質資源描述規(guī)范和數據標準》，苗期性狀包括子葉顏色、葉片色、第一片真葉形狀等，開花期性狀包括花瓣顏色、花瓣數目、花瓣形態(tài)、花冠大小、花序形態(tài)、柱頭外露、育性等，成熟期性狀包括株高、分支數、果實大小、果實顏色、坐果數等。

2 結果與分析

2. 1 EMS誘變對茄子種子發(fā)芽率的影響

EMS誘變效果受其濃度、處理時間、處理溫度等外界條件的影響。為了平衡突變率與致死率間的關系，需確定適宜的EMS誘變濃度。由圖1可知，隨著EMS濃度的升高，種子發(fā)芽率快速下降，當誘變濃度達2.0%時幾乎不萌發(fā)。EMS誘變濃度影響種子發(fā)芽率的同時，也影響種子的發(fā)芽勢。在本研究中，使用磷酸緩沖液處理的茄子種子（對照組）在催芽后5 d開始萌發(fā)，至第10 d時基本萌發(fā)完全（發(fā)芽率98%），而經1.0% EMS誘變處理后，茄子種子在第10 d開始萌發(fā)（圖2），至第16 d時才基本萌發(fā)完全，發(fā)芽率為80%。因此，選擇1.0% EMS進行茄子種質資源創(chuàng)新。

2. 2 苗期性狀調查結果

20 g茄子種子經1.0% EMS誘變處理18 h后催芽播種，最終得到2135株幼苗。苗期調查結果顯示，茄子幼苗的子葉大小、顏色等表現(xiàn)出豐富的變異性（圖3）。其中，95.32%植株的第一片真葉表現(xiàn)出突變，但第二片真葉恢復正常。

2. 3 植株長勢調查結果

定植的2135株幼苗受臺風危害后僅剩余984份材料，其性狀表現(xiàn)出豐富的變異。984株M1代茄子的長勢在整體上極不均勻，與對照組相比，總體長勢相對較弱，其中有11%的植株長勢受到嚴重抑制。此外，有35株M1代茄子表現(xiàn)為植株退化且花器形成較晚，1株M1代茄子表現(xiàn)為節(jié)間短縮。

2. 4 葉片性狀調查結果

M1代群體的葉片大小、顏色形狀均已發(fā)生豐富變異（表1，圖4），共有3株植株葉片表現(xiàn)出黃化現(xiàn)象，且均為嵌合體。其中，1株植株的一半葉片發(fā)生黃化（圖5-A），1株僅有兩片葉片部分黃化（圖5-B），1株的整體黃化程度較輕，僅表現(xiàn)為新生葉片呈黃綠色（圖5-C）。在葉片大小變異方面，葉片退化突變體的頻率最高（3.56%）（圖4-B），其次為葉片變?。?.13%）（圖4-C），僅1.12%的葉片變大（圖4-D）。除了葉片黃化外，有13株植株的葉片紫色加深（圖4-E），同時存在葉緣（圖4-F）和葉尖（圖4-G）等形狀發(fā)生變異。

2. 5 果實性狀調查結果

野生型茄子果實長約35 cm，紫色，棒狀，果頂圓。M1代群體在果實的大小、長度、顏色和形狀等方面均表現(xiàn)出豐富的變異（表2），共有70株表現(xiàn)出明顯的變異，突變頻率為7.11%。其中，果實性狀變異頻率最高的為果實變粗（圖6-A），其次為果實變短（圖6-B），有22株M1代茄子的果實同時變短變粗。4株M1代茄子果實明顯變長（圖6-C和圖6-D），達37～47 cm；6株M1代茄子材料表現(xiàn)出兩個果實并生畸形（圖6-E）。在果實顏色的突變體中，有2株M1代茄子果實呈深黑色，色澤光亮（圖6-F）。3株M1代茄子資源果頂變尖（圖6-G）。果實是茄子的商品器官，其形狀、色澤對商品性有著重要意義，同時果實的長度、粗度是構成產量的主要因素，M1代群體中果實性狀的有利突變體可作為品種改良的基礎材料。

2. 6 莖桿性狀調查結果

由于EMS對植物生長具有抑制作用，因此未進行植株的株高、株幅調查，而僅針對其分枝情況進行調查。野生型植株第1次分枝在距離地面35～40 cm，而在M1代中有160株植株的第1分枝節(jié)位變矮，主要分布在10～20 cm（圖7-A）。除了分枝節(jié)位變矮外，分枝數量也出現(xiàn)變異，有7株M1代茄子出現(xiàn)3個分枝（圖7-B），有2株表現(xiàn)為4個分枝。分枝節(jié)位的變低及分枝數增加，有利于茄子早熟和增產。

2. 7 花器性狀調查結果

花器的變異最少，在調查的984株突變體中僅發(fā)現(xiàn)2株雄性不育材料。初步形態(tài)觀察推斷，1株表現(xiàn)為雄蕊退化，另外一株表現(xiàn)為花粉敗育，其不育機理有待進一步探究。此外，1株植株中的側枝花朵變白，萼片變綠；1株植株與其他突變體相比，約提早開花7 d。

2. 8 坐果性狀調查結果

野生型植株主要為單個坐果，而在突變體中出現(xiàn)集中坐果的突變株。集中坐果的突變植株主要表現(xiàn)為三大類：一是分枝多，每個分枝同時坐果（圖8-A）；二是坐果的節(jié)位集中，一個節(jié)位一個果，茄子坐果集中（圖8-B）；三是同一節(jié)位坐2～3個果實（圖8-C）。

3 討論

突變體的構建需要解決兩個問題；一是產生足夠的突變，二是突變能夠遺傳給后代。EMS誘變濃度、處理時間是影響其誘變效果的主要因素。張鳳啟等（2010）認為0.4% EMS處理12 h對甘藍型油菜的誘變效果最佳；李文慧（2014）利用0.8% EMS處理番茄24 h后成功獲得含有豐富突變性狀的突變體庫。在本研究中，以1.0% EMS處理18 h后的種子發(fā)芽率為80%，可能是由于茄子種子相對較大、種皮較厚，因此需要較高濃度的EMS誘變才能產生豐富的突變體。經EMS誘導處理后，茄子不同生理表觀性狀發(fā)生突變的頻率也不同，在984份M1代植株中，有160株M1代茄子的第1分枝節(jié)位變矮，變異頻率最高，而花器的變異頻率最低，僅有4株植株表現(xiàn)出變異。但在甘藍型油菜中，花器性狀的突變類型豐富，突變頻率最高（孫加焱等，2007；張鳳啟等，2010）。這可能是由于高突變率的性狀受多個基因調控，突變頻率低的性狀僅受少數基因調控。

EMS誘變產生的M1代隱性突變較多，少量為顯性突變，即大多數突變性狀在M1代不會表現(xiàn)，但在M2代會表現(xiàn)出突變性狀，因此當前利用MutMap技術克隆控制重要農藝性狀及TILLING技術反向篩選突變時主要是利用M2代群體（Aba et al.，2011；Kurowska et al.，2011）。本研究僅調查了M1代群體的相關性狀，因此需對M1代進行單株留種，在M2代進行重點考察。以EMS進行誘變不僅能開展種質創(chuàng)新和基因功能研究，利用突變體與常規(guī)育種手段相結合還能加速品種選育的進程（Takagi et al.，2015）。本研究中使用的材料為茄子高代自交系，遺傳穩(wěn)定，綜合性狀優(yōu)良，具有潛在的利用價值，對其誘變體進行自交2～3代可獲得表現(xiàn)優(yōu)良的株系（純合體），既可作為雜交育種的親本，又能作為常規(guī)種直接用于生產，進而縮短育種年限。

4 結論

經EMS誘變處理獲得的M1代茄子表現(xiàn)出豐富的變異，可為其新品種選育及基因功能研究提供良好材料。

參考文獻：

曹必好，雷建軍，王勇，呂亞清，陳國菊. 2009. 栽培茄與野生茄種間雜交研究[J]. 園藝學報，36（2）：209-214.

Cao B H，Lei J J，Wang Y，Lü Y Q，Chen G J. 2009. Inter-specific hybridization between Solanum melongena and Solanum torvum[J]. Acta Horticulturae Sinica，36（2）：209-214.

馮英娜，柳李旺，劉衛(wèi)東，王倩，崔群香. 2014. 茄子SSR遺傳多樣性及其農藝性狀的關聯(lián)分析[J]. 江蘇農業(yè)學報，30（4）：839-847.

Feng Y N，Liu L W，Liu W D，Wang Q，Cui Q X. 2014. Genetic diversity of eggplant revealed by SSR markers and its association with agronomic traits[J]. Jiangsu Journal of Agriculture Science，30（4）：839-847.

李文慧. 2014. 番茄基因組文庫及突變體庫的構建與分析[D]. 北京：中國農業(yè)大學.

Li W H. 2014. Construction and analysis of tomato BAC library and EMS mutants[D]. Beijing：China Agriculture University.

李錫香，朱德蔚. 2000. 茄子種質資源描述規(guī)范和數據標準[M]. 北京：中國農業(yè)出版社.

Li X X， Zhu D W. 2000. Description and Data Standard for Germplasm Resources of Eggplant（Solanum melongena L.）[M]. Beijing：China Agriculture Press.

廖毅，孫保娟，黎振興，羅少波，陳日遠，孫光聞，李植良. 2009. 茄子及其近緣野生種遺傳多樣性及親緣關系的AFLP分析[J]. 熱帶作物學報，30（6）：781-787.

Liao Y，Sun B J，Li Z X，Luo S B，Chen R Y，Sun G W，Li Z L. 2009. AFLP analysis of genetic diversity and genetic relationship of eggplant（Solanum melongena L.） and its wild relatives[J]. Chinese Journal of Tropical Crops，30（6）：781-787.

邱福林. 2007. EMS誘變及稻瘟病候選基因功能研究[D]. 沈陽：沈陽農業(yè)大學.

Qiu F L. 2007. EMS mutagenesis and function of candidate genes against rice blast[D]. Shenyang：Shenyang Agriculture University.

邱正高，楊華，祁志云，袁亮，柯劍鴻，張亞勤. 2009. 航空誘變的糯玉米矮稈突變體株高與葉片生長分析[J]. 西南農業(yè)學報，22（4）：901-904.

Qiu Z G，Yang H，Qi Z Y，Yuan L，Ke J H，Zhang Y Q. 2009. Aanlysis of plant height and leaveson dwarf wax maize line mutated by aviation[J]. Southwest China Journal of Agricultural Sciences，22（4）：901-904.

石從廣，孟華兵，姜宇曉，朱亞娜，陳明訓，郭萬里，蔣立希. 2010. 甘藍型油菜EMS誘變二代農藝與籽粒品質性狀的變異與TILLING庫的構建[J]. 核農學報，24（6）：1132-1140.

Shi C G，Meng H B，Jiang Y X，Zhu Y N，Chen M X，Guo W L，Jiang L X. 2010. Phenotypic variation of agronomic and grain quality traits in an EMS-induced M2 population and the construction of the DNA pool for tilling analysis[J]. Journal of Nuclear Agricultural Sciences，24（6）：1132-1140.

孫加焱，涂進東，范叔味，吳建國，石春海. 2007. 甘藍型油菜理化誘變和突變體庫的構建[J]. 遺傳，29（4）：475-482.

Sun J Y，Tu J D，F(xiàn)an S W，Wu J G，Shi C H. 2007. The screening of mutants induced by physical and chemical factors and construction of mutant population for Brassica napus L.[J]. Hereditas，29（4）：475-482.

王益奎，王紅，王艷娜，李文嘉，蔣雅琴，黎炎. 2015. 栽培茄與水茄遠緣雜交F1植物學性狀及不育性分析[J]. 中國蔬菜，（1）： 32-36.

Wang Y K，Wang H，Wang Y N，Li W J，Jiang Y Q，Li Y. 2015. Morphological and sterility analysis of distant hybridization between eggplant and Solanum torvum[J]. Chinses Vege-

table，（1）：32-36.

肖熙鷗，王勇，李冠男，曹必好，雷建軍，陳國菊，陳清華. 2012. 茄子種質資源的ISSR遺傳多樣性分析[J]. 華南農業(yè)大學學報，33（3）：296-300.

Xiao X O，Wang Y，Li G N，Cao B H，Lei J J，Chen G J，Chen Q H. 2012. ISSR analysis of genetic diversity among cultiva-

ted eggplant and wild relatives[J]. Journal of South China Agricultural University，33（3）：296-300.

徐明，路鐵剛. 2011. 植物誘變技術的研究進展[J]. 生物技術進展，1（2）：90-97.

Xu M，Lu T G. 2011. Research progress of plant mutagenesis technology[J]. Current Biotechnology，1（2）：90-97.

徐艷花，陳鋒，董中東，崔黨群. 2010. EMS誘變的普通小麥豫農201突變體庫的構建與初步分析[J]. 麥類作物學報，30（4）：625-629.

Xu Y H，Chen F，Dong Z D，Cui D Q. 2010. Construction and analysis of EMS induced mutant library of hexaploid wheat cultivar Yunong 201[J]. Journal of Triticeae Crops，30（4）：625-629.

張鳳啟，黃永娟，楊甜甜，陳健美，管榮展，張紅生. 2010. EMS誘變甘藍型油菜M2代群體的表型突變研究[J]. 植物遺傳資源學報，11（6）：760-765.

Zhang F Q，Huang Y J，Yang T T，Chen J M，Guan R Z，Zhang H S. 2010. Research on phenotypic mutation in M2 population derived from EMS treatment in Brassica napus L.[J]. Journal of Plant Genetic Resources，11（6）：760-765.

Abe A，Kosugi S，Yoshida K，Natsume S，Takagi H，Kanzaki H，Matsumura H，Yoshida K，Mitsuoka C，Tamiru M，Innan H，Cano L，Kamoun S，Terauchi R. 2011. Genome sequencing reveals agronomically important loci in rice using MutMap[J]. Nature Biotechnology，30（2）：174-178.

Hirakawa H，Shirasawa K，Miyatake K，Nunome T，Negoro S，Ohyama A，Yamaguchi H，Sato S，Isobe S，Tabata S，F(xiàn)ukuoka H. 2014. Draft genome sequence of eggplant（Solanum me-

longena L.）：the representative solanum species indigenous to the old world[J]. DNA Research，21（6）：649-660.

Just D，Garcia V，F(xiàn)ernandez L，Bres C，Mauxion J P，Petit J，Jorly J，Assali J，Bournonville C，F(xiàn)errand C，Baldet P，Lemaire-Chamley M，Mori K，Okabe Y，Ariizumi T，Asamizu E，Ezura H，Rothan C. 2013. Micro-Tom mutants for functional analysis of target genes and discovery of new alleles in tomato[J]. Plant Biotechnology，30（3）：225-231.

Kurowska M，Daszkowska-Golec A，Gruszka D，Marzec M，Szurman M，Szarejko I，Maluszynski M. 2011. TILLING：a shortcut in functional genomics[J]. Journal of Applied Genetics，52（4）：371-390.

McCallum C M，Comai L，Greene E A，Henikoff S. 2000. Targe-

ting induced local lesions in genomes（TILLING） for plant functional genomics[J]. Plant Physiology，123（2）：439-442.

Nordstr■m K J，Albani M C，James G V，Gutjahr C，Hartwig B，Turck F，Paszkowski U，Coupland G，Schneeberger K. 2013. Mutation identification by direct comparison of whole-genome sequencing data from mutant and wild-type individuals u-

sing k-mers[J]. Nature Biotechnology，31（4）：325-330.

Saito T，Ariizumi T，Okabe Y，Asamizu E，Hiwasa-Tanase K，F(xiàn)ukuda N，Mizoguchi T，Yamazaki Y，Aoki K，Ezura H. 2011. TOMATOMA：a novel tomato mutant database distributing Micro-Tom mutant collections[J]. Plant and Cell Physiology，52（2）：283-296.

Takagi H，Tamiru M，Abe A，Yoshida K，Uemura A，Yaegashi H，Obara T，Oikawa K，Utsushi H，Kanzaki E，Mitsuoka C，Natsume S，Kosugi S，Kanzaki H，Matsumura H，Urasaki N，Kamoun S，Terauchi R. 2015. MutMap accelerates breeding of a salt-tolerant rice cultivar[J]. Nature Biotechnology，33（5）：445-449.

Takagi H，Uemura A，Yaegashi H，Tamiru M，Abe A，Mitsuoka C，Utsushi H，Natsume S，Kanzaki H，Matsumura H，Saitoh H，Yoshida K，Cano L M，Kamoun S，Terauchi R. 2013. MutMap-Gap：whole-genome resequencing of mutant F2 progeny bulk combined with de novo assembly of gap regions identifies the rice blast resistance gene Pii[J]. New Phytologist，200（1）：276-283.

Thole J M，Strader L C. 2015. Next-generation sequencing as a tool to quickly identify causative EMS-generated mutations[J]. Plant Signaling and Behavior，10（5）：e1000167.

Zhang G Z，Wang Y Y，Guo Y，Zhao Y，Kong F M，Li S S. 2015. Characterization and mapping of QTLs on chromosome 2D for grain size and yield traits using a mutant line induced by EMS in wheat[J]. The Crop Journal，3（2）：135-144.

Zhou Q，Wang S H，Hu B W，Chen H M，Zhang Z H，Huang S W. 2015. An ACCUMULATION AND REPLICATION OF CHLOROPLASTS 5 gene mutation confers light green peel in cucumber[J]. Journal of Integrative Plant Biology，57（11）：936-942.

（責任編輯 蘭宗寶）