張影波 袁媛 龐玉新 王丹 胡璇

摘要：【目的】分析艾納香的遺傳多樣性，為制定其保護策略提供參考依據(jù)。【方法】使用分子標記中常用的SRAP和AFLP分子標記對35份艾納香資源的遺傳多樣性進行對比分析與評估?！窘Y(jié)果】8對AFLP引物組合和27對SRAP引物組合分別擴增獲得1360條AFLP多樣性條帶（多樣性比率為99.48%）和265條SRAP多樣性條帶（多樣性比率為97.78%）；SRAP分子標記的有效信息位點指數(shù)（PIC）、有效多樣性指數(shù)（EMR）和標記指數(shù)（MI）分別為0.4381、8.1000和4.3141，AFLP分子標記的PIC、EMR和MI分別為0.1773、198.0000和301.1348；基于AFLP多樣性條帶和SRAP多樣性條帶的遺傳相似度對比分析結(jié)果表明，35份艾納香樣品的遺傳相似度為0.4450～0.9179，兩種分子標記的相關(guān)系數(shù)r=0.47；基于SRAP分子標記遺傳相似系數(shù)，35份艾納香樣品可分為五大類群；而基于AELP分子標記遺傳相似系數(shù)，35份艾納香樣品可分為四大類群?！窘Y(jié)論】AFLP和SRAP分子標記均可用于艾納香的遺傳多樣性分析，但AFLP分子標記分析的多樣性位點多、分子標記特征指數(shù)高，更適合用于艾納香的遺傳多樣性研究。

關(guān)鍵詞： 艾納香；遺傳多樣性；AFLP；SRAP；對比分析

中圖分類號： S567.23 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）08-1261-07

Abstract：【Objective】The genetic diversity of Blumea balsamifera D C. was estimated， in order to provide reference basis for its protection strategy. 【Method】Based on AFLP and SRAP molecular markers， the genetic diversity of 35 B. balsamifera accessions was estimated. 【Result】A total of 1360 AFLP polymorphism bands（polymorphic ratio of 99.48%） and 265 SRAP polymorphism bands（polymorphic ratio of 97.78%） were amplified using 8 AFLP primer combinations and 27 SRAP primer combinations. Polymorphism information content（PIC）， effective multiplex ratio（EMR） and marker index（MI） of SRAP molecular marker were 0.4381， 8.1000 and 4.3141， respectively. PIC， EMR and MI of AFLP molecular marker were 0.1773， 198.0000 and 301.1348， respectively. Based on AFLP and SRAP polymorphic bands， the genetic similarity of 35 accessions ranged from 0.4450 to 0.9179， and the correlation coefficient（r） was 0.47. The UPGMA clustering results showed that， based on genetic similarity coefficient of SRAP molecular marker， 35 accessions could be classified into 5 clusters， but based on genetic similarity coefficient of AFLP molecular marker， 35 accessions could be classified into 4 clusters. 【Conclusion】Both SRAP and AFLP molecular markers can used to estimate genetic diversity of B. balsamifera， but AFLP molecular marker is more suitable to estimate genetic diversity of B. balsamifera because it has more polymorphic sites and higher marker characteristic index.

Key words： Blumea balsamifera D C.； genetic diversity； AFLP； SRAP； comparative analysis

0 引言

【研究意義】艾納香（Blumea balsamifera D C.）為多年生木質(zhì)草本植物，主產(chǎn)于我國和東南亞國家，在我國分布在東經(jīng)97°30′～121°55′、北緯21°30′～25°50′，包括貴州、廣西、廣東、云南、福建和臺灣等省（區(qū)）的熱帶雨林邊緣或河床谷地，偶見散生于林間草地上，是海南、貴州、廣西等地黎族、苗族、壯族等少數(shù)民族的重要中藥，其艾片、艾粉和艾納香油是重要的醫(yī)藥工業(yè)原料（Pang et al.，2014）。隨著工業(yè)園區(qū)的擴大發(fā)展和城市化進程的加快，艾納香的棲息地急劇減少，遺傳多樣性急劇降低。分子標記是評估植物遺傳多樣性的重要手段及方法。因此，利用分子標記技術(shù)分析艾納香的遺傳多樣性，對高效評估艾納香遺傳多樣性指數(shù)及制定艾納香遺傳多樣性保護策略具有重要意義。【前人研究進展】RAPD、ISSR、SRAP、AFLP和SSR等分子標記是繼形態(tài)標記、細胞標記和生化標記之后發(fā)展起來的理想遺傳標記技術(shù)，已廣泛應(yīng)用于大血藤（廖文波等，1999）、金毛狗（伍蓮，2005）、羅漢果（周俊亞，2005；彭云滔，2006）、天麻（關(guān)萍等，2007）等藥用植物及野生植物的遺傳圖譜構(gòu)建、種質(zhì)資源鑒定、基因定位、遺傳多樣性分析及基因克隆等。國內(nèi)外學者曾嘗試利用AFLP、RAPD等分子標記技術(shù)研究艾納香的親緣關(guān)系及遺傳多樣性，如Pornpongrungrueng等（2007）利用ITS序列分析了艾納香屬植物的親緣關(guān)系，龐玉新等（2010）利用RAPD分子標記技術(shù)分析了4個艾納香種群的克隆多樣性和遺傳多樣性。此外，黃永林等（2010）、王遠輝等（2012）和嚴啟新等（2012）對艾納香的化學成分進行了分析?！颈狙芯壳腥朦c】目前，國內(nèi)關(guān)于分子標記技術(shù)在艾納香遺傳多樣性分析中應(yīng)用的研究鮮見報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】采用分子標記中常用的SRAP和AFLP分子標記，對35份艾納香資源的遺傳多樣性進行對比分析，探索分子標記用于艾納香遺傳多樣性分析的有效性，為艾納香遺傳多樣性評估及制定艾納香遺傳多樣性保護策略提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

根據(jù)文獻調(diào)查和對館藏艾納香標本的考證，在海南、云南、貴州、廣東、廣西及福建等地采樣，并選取35份典型的艾納香材料進行遺傳多樣性分析，其來源地及地理信息見表1。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 DNA提取 參照德國QIAGEN DNeasy植物微量提取試劑盒使用說明，對35份艾納香樣品的基因組DNA進行提取，然后依據(jù)其紫外吸光值（A260）將樣品DNA稀釋至30 ng/μL。

1. 2. 2 AFLP擴增與分析 參照美國GIBCO-BRL公司AFLP試劑盒操作說明對8對AFLP（PstI/MseI）擴增引物組合（表2）進行選擇性擴增，其數(shù)據(jù)結(jié)果使用該公司配套的SAGA MX軟件進行統(tǒng)計，并按照軟件的操作說明分別標記泳道和Maker，獲取0/1標記，然后將所有樣品的0/1條帶轉(zhuǎn)化成數(shù)據(jù)矩陣。

1. 2. 3 SRAP擴增與分析 參照Li和Quiros（2001）的方法進行SRAP擴增，所選引物見表3。電泳后用Gel Doc XR+（Bio-Rad公司）凝膠成像系統(tǒng)進行拍照分析，用Cross Checker 5.0打開膠圖，并按照軟件的操作說明分別標記泳道和Maker，獲取0/1標記，然后將所有樣品的0/1條帶轉(zhuǎn)化成數(shù)據(jù)矩陣。

1. 3 統(tǒng)計分析

1. 3. 1 引物特征信息統(tǒng)計 參照Roldán-Ruiz等（2000）的方法，對SRAP和AFLP的標記特征[多樣性條帶（Polymorphic band）、唯一條帶（Monomorphic band）、稀有條帶（Unique band）、近似條帶（Similar band）、共有條帶（Shared band）、多樣性條帶比率（Polymorphic ratio）、有效信息位點指數(shù)（Mean polymorphism information content，PIC）、有效多樣性指數(shù)（Mean effective multiplex ratio，EMR）和標記指數(shù)（Mean marker index，MI）進行統(tǒng)計。其中，PIC參照Roldan-Ruiz等（2000）的方法進行計算，MI參照Varshney等（2007）的方法進行計算。

1. 3. 2 聚類樹圖生成 基于SRAP和AFLP引物的0/1數(shù)據(jù)矩陣，利用NTSYSpc-2.11F中的SimQual程序求各個體間的DICE相似系數(shù)，然后利用SHAN程序中的UPGMA方法進行聚類分析，并通過Tree plot模塊生成聚類圖，計算相關(guān)系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2. 1 引物特征信息統(tǒng)計結(jié)果

由表4可知，艾納香27對SRAP引物組合共擴增獲得271條條帶，其中265條為多樣性條帶（變異范圍5～16條），多樣性條帶比率為97.78%，唯一條帶、稀有條帶、近似條帶和共有條帶分別為18、22、109和116條，PIC、NMR和MI分別為0.4381、8.1000和4.3141。8對AFLP擴增引物組合共擴增獲得1367條條帶，其中1360條為多樣性條帶（變異范圍123～198條），多樣性條帶比率為99.48%，唯一條帶、稀有條帶、近似條帶和共有條帶分別為264、423、556和117條，PIC、EMR和MI分別為0.1773、198.0000和301.1348。說明8對AFLP擴增引物組合比27對SRAP擴增引物組合擴增獲得了更多的遺傳多樣性條帶。綜上所述，與SRAP分子標記相比，AFLP分子標記具有更高的標記指數(shù)，更適合用于艾納香的遺傳多樣性評估與分析。

2. 2 聚類分析結(jié)果

通過NTSYSpc-2.11F中的SimQual程序?qū)?5份艾納香樣品間的Jaccards相似系數(shù)進行計算，獲得35份艾納香樣品間的相似系數(shù)為0.4450～0.9179，其中基于265條SRAP多樣性條帶間的遺傳相似系數(shù)為0.4450～ 0.9179（圖1），基于1360條AFLP多樣性條帶間的遺傳相似系數(shù)為0.6651～0.9020（圖2）?；贏FLP分子標記和SRAP分子標記的相關(guān)系數(shù)分析結(jié)果表明，兩種分子標記的遺傳相關(guān)性r=0.47，表明AFLP分子標記與SRAP分子標記呈現(xiàn)一定的相關(guān)性。

利用SHAN程序中的UPGMA方法對35份樣品進行聚類分析?；赟RAP分子標記（圖1），當遺傳相似度為0.6000時，35份樣品可分為五大類群。類群I包括3份貴州的樣品，樣品編號分別為GZ1、GZ2和GZ3，遺傳相似度為0.8454～0.8707。類群II包括18份樣品，涵蓋了研究樣品數(shù)目的50%以上，遺傳相似度為0.6972～0.9179，其內(nèi)又可分為3個亞類群，亞類群1包括8份來源于貴州的樣品，樣品編號分別為GZ4～GZ11，樣品間的平均相似系數(shù)為0.8549；亞類群2包括5份來源于廣西的樣品，樣品編號分別為GX1～GX5，樣品間的平均相似系數(shù)為0.8864；亞類群3包括5份來源于云南的樣品，樣品編號分別為YN1～YN5，樣品間的平均相似系數(shù)為0.7918～0.8864。類群III包括7份海南的樣品，樣品編號為HN6～HN12，遺傳相似度為0.6486～ 0.8170。類群IV包括5份海南的樣品，樣品編號為HN1～HN5，遺傳相似度為0.6909～0.8454。類群V包括兩份廣東的樣品，樣品編號為GD1和GD2，遺傳相似度較低，為0.4450，推測來源于廣東的樣品可能有獨特的起源或與廣東獨特的地理位置有關(guān)。

基于AFLP分子標記（圖2），當遺傳距離為0.6947時，35份樣品可分為四大類群。類群I涵蓋了超過80%的樣品，其內(nèi)又可分為4個亞類群，其中亞類群1包括海南的12份樣品、貴州的6份樣品、廣西的4份樣品和云南的2份樣品，遺傳相似度為0.7835～0.9020；亞類群2包括1份來源于貴州的樣品，樣品編號為GZ4；亞類群3包括3份來源于貴州的樣品，樣品編號分別為GZ1、GZ10和GZ11；亞類群4包括3份樣品，分別為來源于廣東的GD1、GD2和來源于貴州的GZ9。類群II、III和IV均包括單獨的一個樣品類群，分別為YN3、GZ8和YN4。與SRAP分子標記聚類分析結(jié)果相比，AFLP分子標記分析的結(jié)果顯示35份艾納香遺傳資源具有更高的多樣性，其聚類分析結(jié)果與地理位置的相關(guān)性較小，不同來源的樣本常被分為多個類群，推測與AFLP分子標記的靈敏度高有關(guān)。

3 討論

RAPD、ISSR、AFLP、SRAP及SSR等分子標記已廣泛應(yīng)用于植物的遺傳多樣性和遺傳分化研究（考安都等，2014；孫建等，2014；楊海健等，2014；張安世等，2014；林樂靜等，2015；周娜等，2015），但適用研究目的存在差異（Chowdhury et al.，2002；Maguire et al.，2002）。如RAPD和ISSR分子標記因采用隨機引物，檢測范圍遍及整個基因組，同時具備簡便、快速、花費低及高效性等優(yōu)點，因而適用于基因組DNA多態(tài)性檢測、種質(zhì)資源分類及鑒定等研究（Huang and Sun，2000）；SSR分子標記具有數(shù)量豐富、多態(tài)性信息量高、檢測結(jié)果準確可靠、重復性強、操作簡便快速，且對DNA數(shù)量及質(zhì)量要求不高等特點，已廣泛應(yīng)用于遺傳圖譜構(gòu)建、比較基因組研究、遺傳多樣性分析和種質(zhì)鑒定等方面（Budak et al.，2004）；AFLP分子標記具有多態(tài)水平高、檢測位點最多、操作簡便、分辨率高、速度快及DNA用量少等優(yōu)點，適用于遺傳圖譜構(gòu)建、種質(zhì)資源鑒定、基因定位、遺傳多樣性分析（Maguire et al.，2002；Budak et al.，2004）；SRAP分子標記是新發(fā)展起來的分子標記技術(shù)，是利用基因序列外顯子中G、C含量豐富及啟動子和內(nèi)含子中A、T含量豐富的特點設(shè)計兩套引物，對開放閱讀框架進行擴增，該技術(shù)集中了RAPD、SSR和AFLP等分子標記技術(shù)的優(yōu)點，具有共顯性、簡便、穩(wěn)定、操作簡單、重復性強及中等產(chǎn)率的特點，在基因組中分布均勻，適合對不同作物進行基因定位、基因克隆和遺傳圖譜構(gòu)建（Li and Quiros，2001；Chowdhury et al.，2002；Maguire et al.，2002）。本研究中使用PIC、EMR和MI等分子標記特征指數(shù)對SRAP和AFLP分子標記特征進行對比分析，發(fā)現(xiàn)SRAP的分子標記特征指數(shù)分別為0.4381、8.1000和4.3141，AFLP的分子標記特征指數(shù)分別為0.1773、198.0000和301.1348，對其進行遺傳相似性和聚類分析亦發(fā)現(xiàn)，SRAP與AFLP兩種分子標記的相關(guān)系數(shù)r=0.47，表明這兩種分子標記方法均適用于對艾納香進行遺傳多樣性研究，但AFLP具有多樣性位點多、分子標記指數(shù)高等優(yōu)點，更適合于艾納香的遺傳多樣性評估。

當兩種或兩種以上分子標記用于同一研究對象時，可能產(chǎn)生差異性結(jié)果。如Budak等（2004）使用ISSR、SSR、RAPD和SRAP 4種分子標記開展野牛草遺傳多樣性研究時，發(fā)現(xiàn)RAPD與ISSR分子標記的相關(guān)系數(shù)僅0.010；而Ravi等（2003）使用RAPD和SSR分子標記研究水稻的遺傳多樣性時，發(fā)現(xiàn)其矩陣的相關(guān)系數(shù)為0.582；Patzak（2001）、Belaj等（2003）、Garcia等（2004）及Scariot等（2007）的研究也獲得了相似的結(jié)果。本研究發(fā)現(xiàn)，35份艾納香樣品的遺傳相似度為0.4450～0.9179，其遺傳距離與地理的遺傳距離呈現(xiàn)一定的相關(guān)性，兩種分子標記的相關(guān)系數(shù)r=0.47，也呈現(xiàn)一定的相關(guān)性。

4 結(jié)論

AFLP和SRAP分子標記均可用于艾納香的遺傳多樣性分析，但AFLP分子標記具有多樣性位點多、分子標記特征指數(shù)高等優(yōu)點，更適合艾納香的遺傳多樣性研究。

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（責任編輯 思利華）