朱欣 譚新球 張德詠 劉勇

摘要：【目的】明確危害湖南永州奈李果實新發(fā)生病害的病原物種類，為更好地識別并防控該病害提供理論依據?！痉椒ā坑贸Ｒ?guī)分離方法對湖南永州奈李果園發(fā)病樣品進行病原菌分離，通過形態(tài)學特征觀察，ITS、TUB、CAL和ACT序列和系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析及致病性測定，對分離獲得的病原菌進行鑒定。【結果】分離獲得的病原菌形態(tài)學特征與大豆擬莖點霉（Phomopsis longicolla）一致；其ITS、TUB、CAL、ACT序列與P. longicolla同源性分別為98%、99%、99%和98%。室內人工接種病原菌3～5 d后果實形成橢圓形至不規(guī)則形褐色病斑、后轉腐爛等癥狀，與田間果實危害癥狀一致。【結論】初步確定危害湖南永州奈李果實的病原菌為P. longicolla YZ。

關鍵詞： 大豆擬莖點霉；奈李；ITS序列；TUB序列；CAL序列；ACT序列

中圖分類號： S432.44 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）08-1318-08

Abstract：【Objective】In order to provide theoretical basis for recognizing and controlling new disease， the pathogen causing new disease of Prunus salicina Lindl. var. cordata Y. He et J. Y. Zhang cv. younai from Yongzhou， Hunan was identified. 【Method】Using conventional isolation method， the pathogen was isolated from diseased fruits of P. salicina collected from orchard of Yongzhou， Hunan. Then， the pathogen was identified based on pathogenicity test， morphological characteristics observation， and analysis of rDNA-ITS， beta-tubulin（TUB）， calmodulin（CAL） and actin（ACT） sequences and phylogenetic tree. 【Result】The morphological characteristics of pathogen were consistent with those of Phomopsis longicolla. ITS， TUB， CAL and ACT sequences analysis showed that the pathogen shared 98%， 99%， 99% and 98% homology with P. longicolla， respectively. Furthermore， the disease symptoms were found on P. salicina fruits within 3-5 d after indoor artificial inoculation， such as first forming elliptic or irregular brown necrosis then rotting， which were in accordance with those of fruits in the field. 【Conclusion】The pathogen is identified as P. longicolla YZ， which can cause new disease of P. salicina.

Key words： Phomopsis longicolla； Prunus salicina Lindl. var. cordata Y. He et J. Y. Zhang cv. younai； ITS sequence； TUB sequence； CAL sequence； ACT sequence

0 引言

【研究意義】奈李（Prunus salicina Lindl.var.cordata Y. He et J. Y. Zhang cv. younai）為薔薇科（Rosaceae）李屬（Prunus）果樹，素有“李中之王”美稱，在我國南方地區(qū)大面積種植（馬振峰等，2010），是我國特有的名優(yōu)珍貴經濟樹種，有重要的經濟價值。湖南地區(qū)奈李一般3月上中旬開花，7月下旬～8月上旬成熟。2013年6月中旬在湖南永州奈李上發(fā)現一種危害奈李果實的真菌病害，由于過往未發(fā)生過類似病害，缺乏防治措施，導致園區(qū)該病害發(fā)病率高達70%，給果農帶來了嚴重的經濟損失。因此，對湖南奈李新病害進行鑒定，明確其病原菌種類，對該奈李病害的防治具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】奈李病害發(fā)生種類多且危害嚴重。戴良英和高必達（1993）首次對湖南奈李病害種類進行了系統(tǒng)調查，高必達等（1995）在此基礎上對湖南奈李發(fā)病情況進行了補充，明確了湖南奈李上共存在30種病害，如炭疽病、細菌性黑斑病、輪斑病等。曹華國等（1997）在江西安遠、安義兩地奈李產區(qū)進行了奈李病害種類調查，結果共鑒定出14種病害種， 其中褐斑病和霜霉病是國內首次報道。大豆擬莖點種腐病菌（Phomopsis longicolla）主要引起大豆擬莖點霉莖枯種腐病，是全世界范圍內廣泛影響大豆生產的一種病原真菌，崔友林等（2010）報道在我國大豆田間首次發(fā)現該病害；Shan等（2012）和Chen等（2013）則分別首次在我國南方大豆莖和大豆種子中分離獲得該病原物；Shu等（2014）研究表明，在我國自然環(huán)境下P. longicolla能夠侵染茄子；耿肖兵等（2015）通過形態(tài)學鑒定和ITS序列分析首次在大豆苗期根腐病病樣中分離到P. longicolla?！颈狙芯壳腥朦c】目前已報道的奈李病害癥狀與湖南永州發(fā)現的奈李病害癥狀存在一定差異，且前人對病原菌鑒定研究主要采取形態(tài)學特征結合ITS序列分析的方法。本研究在此基礎上進一步結合β-微管蛋白（Beta-tubulin，TUB）、鈣調蛋白（Calmodulin，CAL）和肌動蛋白（Actin，ACT）序列進行分析鑒定，這在相似種間鑒定方面更具優(yōu)勢?！緮M解決的關鍵問題】對湖南永州奈李果園發(fā)病樣品進行病原菌分離純化，光學顯微鏡下觀察病原菌的形態(tài)、分生孢子等生物學特征，并進行致病力測定，結合其ITS、TUB、CAL和ACT序列對病原菌進行鑒定，以明確該病害的病原，為奈李病害防治提供科學依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

發(fā)病奈李果實采自湖南永州江華瑤族自治縣東田鎮(zhèn)謝家灣村奈李果園，健康奈李果實購于湖南省農業(yè)科學院水果市場，品種均為青奈。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 病原菌分離純化及培養(yǎng) 用無菌水沖洗病果后用75%酒精清洗3次，用常規(guī)分離方法進行病原物分離，接種于28 ℃ PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)并進行單孢純化3次，獲得純化病原菌，備用。

1. 2. 2 病原菌形態(tài)學觀察 光學顯微鏡下觀察病原菌菌落特點及分生孢子器、分生孢子大小及形態(tài)等特征。

1. 2. 3 DNA提取及擴增

1. 2. 3. 1 病原菌總DNA提取 病原菌總DNA提取采用改良CTAB法：PD液體培養(yǎng)基搖床培養(yǎng)病原菌菌體，28 ℃下200 r/min搖床培養(yǎng)6 d；取200 mg干菌絲液氮迅速研磨后加入3 mL 2% CTAB（w/v）提取緩沖液，65 ℃水浴45 min后4 ℃下4000 r/min離心20 min；取上清液轉至離心管中，加入4 μL 10 mg/mL蛋白酶，37 ℃水浴1 h；加入800 μL Tris飽和酚（pH 8.0）混勻，4 ℃ 13000 r/min離心10 min；取上清液，加入等體積的氯仿/異戊醇（24∶1）混勻，4 ℃ 13000 r/min離心10 min；取上清液，加入RNA酶至終濃度20 μg/mL，37 ℃水浴2 h；加入800 μL氯仿/異戊醇（24∶1）混勻，4 ℃ 13000 r/min離心10 min；取上清液，加入600 μL異戊醇混勻，-20 ℃沉淀30 min后4 ℃ 12000 r/min離心20 min；收集沉淀，75%酒精混勻沖洗，4 ℃ 12000 r/min離心20 min，重復3次，超凈工作臺真空干燥；取35 μL無菌水溶解DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2. 3. 2 PCR擴增及測序 PCR擴增引物共4對，分別為：ITS通用引物ITS4/ITS5（ITS4： 5′-TCCTCCGCT

TATTGATATGC-3′；ITS5：5′-GGAAGTAAAAGTGTA

ACAAGG-3′）；TUB引物（Bt2a：5′-GGTAACCAAATC

GGTGCTGCTTTC-3′；Bt2b：5′-ACCCTCAGTGTAGT

GACCCTTGGC-3′）；CAL引物（CL1：5′-GARTWCAAG

GAGGCCTTCTC-3′；CL2：5′-TTTTGCATCATGAGT

TGGAC-3′）；ACT引物（AT1：5′- ATGTGCAAGGCCG

GTTTCGC-3′；AT2：5′-TACGAGTCCTTCTGGCCCA

T-3′）。PCR反應體系25.0 μL：10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP（2.5 mmol/L）2.5 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL）l.0 μL，引物ITS4（10 μmol/L）和ITS5（10 μmol/L）各1.0 μL，模板DNA 1.0 μL，無菌水16.0 μL。擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 45 s，ITS（55 ℃）、TUB（58 ℃）、CAL（56 ℃）、ACT（54 ℃）退火45 s，72 ℃ 1 min，進行35個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。擴增產物采用l%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像儀進行觀察并拍照。擴增產物割膠回收后連接轉化，陽性克隆菌液委托華大生物工程有限公司測序。

1. 2. 3. 3 序列分析與數據處理 測序結果經NCBI BLAST比對，應用MEGA 5.05構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

1. 2. 4 致病性測定 取新鮮健康奈李果實，設為A、B、C、D 4組，分別用空白培養(yǎng)基液、菌絲孢子混合液、菌絲和分生孢子懸浮液（孢子液濃度為5×106個/mL）處理，每組5個奈李。處理方法：奈李用無菌水清洗后用75%酒精表面消毒，取固定細針輕微刺扎果表造成傷口，然后用對應接種體液浸潤處理，處理后用無菌濾紙移除多余的菌液，置于滅菌玻璃器皿中于恒溫箱中28 ℃保濕培養(yǎng)，定期觀察記錄病害發(fā)生發(fā)展情況。對接種后發(fā)病果實進行病菌再分離，進行形態(tài)學驗證及ITS鑒定。上述致病性測定試驗重復1次。

2 結果與分析

2. 1 田間果實受害癥狀

發(fā)病初期奈李果實出現橢圓形至不規(guī)則形黃褐色病斑，隨著病情的逐漸蔓延發(fā)展，奈李果實病斑逐漸變大，出現黑褐色壞死小點，壞死部分凹陷，后期多個病斑連接形成大面積黃褐色病斑，部分病果腐爛，潮濕環(huán)境下能觀察到白色菌絲（圖1）。

2. 2 病原菌形態(tài)特征

病原菌在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)時產生白色菌絲，氣生菌絲棉毛狀、致密生長，培養(yǎng)基接種生長迅速，5～6 d即可完全覆蓋整個培養(yǎng)皿（圖2-A、2-B）；背面初為白色，16 d后逐漸產生埋生、暗褐色至黑色、擴展的子座（圖2-C、2-D）；分生孢子器球形、燒瓶形或扁球形，單腔室，具有明顯的喙（圖2-E）。觀察到α型分生孢子，卵圓形至紡錘形，單胞，無色，大小5.41～7.51 μm×2.33～

3.22 μm，兩端各有一個油球（圖2-F）。未見β型分生孢子，也未見有性世代。

2. 3 序列分析結果

ITS、TUB、CAL和ACT引物進行PCR擴增可分別獲得602、557、894和287 bp左右條帶（圖3），割膠回收及連接轉化后，菌落PCR篩選陽性克隆測序。

將供試菌株的ITS、TUB、CAL和ACT序列與GenBank中大豆擬莖點霉莖枯種腐病菌（Phomopsis longicolla）進行同源性比對，其ITS序列（登錄號KU517876）與P. longicolla（登錄號AY857868.1）ITS序列同源性為98%，TUB序列（登錄號KU517878）與P. longicolla（登錄號HQ333512.1）TUB序列同源性為99%，CAL序列（登錄號KU517877）與P. longicolla[登錄號KC343438.1，命名為Diaporthe sojae，根據其發(fā)表文章（Gomes et a1.， 2013）確定屬于P. longicolla]CAL序列同源性為99%，ACT序列與P. longicolla（登錄號KT021552.1）ACT序列同源性為98%；且比對發(fā)現病原菌TUB、CAL和ACT序列與P. longicolla以外菌株的同源性均低于94%。根據病原菌ITS、TUB、CAL和ACT序列，選取GenBank BLAST同源性較高菌株及擬莖點霉屬部分代表性菌株（表1）構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹（圖4），發(fā)現病原菌與P. longicolla聚集在同一分支上。根據上述結果，結合病原菌形態(tài)學特征，初步確定該病原菌為擬莖點霉屬菌株P. longicolla YZ。

2. 4 P. longicolla YZ的致病性測定

選取與發(fā)病奈李品種相同的青奈李果實作為試驗材料，以P. longicolla YZ的菌絲、分生孢子懸浮液和菌絲孢子混合液3種類型作為接種體，以確定P. longicolla YZ的致病性。結果表明，各接種體的發(fā)病時間及侵染力存在明顯差異，菌絲孢子混合液對奈李果實具有較強的侵染性，接種1 d后即開始表現癥狀，且發(fā)病癥狀與田間癥狀一致，能觀察到病斑處有菌絲生長；菌絲接種組發(fā)病癥狀稍輕；分生孢子液侵染力較弱，接種5 d后開始表現輕微癥狀（表2和圖5）?？梢酝茰y田間奈李果實病害傳播主要以分生孢子和菌絲混合侵染為主。

對室內接種后的奈李病斑進行再分離，純化的病原物在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，其菌落、分生孢子器及分生孢子形態(tài)特征與接種前病原物一致；ITS重測測序結果與接種體病原物序列的相似度達99.67%，證明重新分離的病原物與接種體病原相同，可以確定危害奈李的病原為接種病原菌P. longicolla YZ。

3 討論

本研究從湖南永州病變奈李果實上分離純化獲得的菌株，28 ℃時菌絲生長迅速且能產生較多孢子；病原菌在PDA培養(yǎng)基上生長的形態(tài)特征，分生孢子器及分生孢子大小、形態(tài)等特征均與崔友林等（2010）和耿肖兵等（2015）所報道的P. longicolla一致。核糖體DNA的轉錄間隔區(qū)（ITS）序列是鑒定真菌屬種的一種工具，被廣泛應用于種的鑒定（林劍偉等，2007），ITS結合TUB、CAL和ACT序列用于擬莖點霉屬的鑒定，尤其是相似種的鑒定則更具說服力。本研究供試菌株ITS、TUB、CAL和ACT序列通過BLAST比對發(fā)現與P. longicolla的ITS、TUB、CAL和ACT序列同源性分別為98%、99%、99%和98%，具有高同源性；結合比對結果中同源性較高的菌種構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹發(fā)現，病原菌與P. longicolla聚在同一分支，因此初步確定病原菌是P. longicolla。根據目前相關文獻資料，未見P. longicolla侵染奈李報道，在湖南是首次發(fā)現P. longi-

colla為害奈李，因此將供試菌株命名為P. longicolla YZ。

與前人對P. longicolla致病性測定研究不同的是，本研究利用菌絲、分生孢子懸浮液和菌絲孢子混合液分別作為不同接種體進行接種，結果顯示菌絲孢子混合液接種健康奈李果實2～3 d即表現出明顯發(fā)病癥狀，接種后第4 d出現腐爛（相對濕度90%），與田間癥狀一致，而其他接種體發(fā)病癥狀表現較輕、發(fā)病時間滯后，可以推測田間奈李果實病害傳播主要以分生孢子和菌絲混合侵染為主。

擬莖點霉屬是半知菌亞門、腔孢綱、球殼孢目中的一個重要屬，有性態(tài)為間座殼屬（Diaporthe）（戚佩坤等，2007），其種類繁多、形態(tài)特殊、影響廣泛（張居念等，2013；李濤等，2015），該屬真菌既可以是危害作物的病原菌，又可作用為生防菌應用，越來越多的科研工作者不斷加深對擬莖點霉屬的研究與應用（王海艷等，2013；康燦昆等，2014；盧松茂等，2015）。盡管擬莖點霉屬作為致病真菌具有高度的?；裕ɡ钛┕獾?，2012；張岳平等，2013），但擬莖點霉屬真菌危害寄主范圍廣，包括豆科、旋花科、葫蘆科及桃樹等；另外，擬莖點霉屬P. citri能夠侵染柑橘，引起柑橘黑點?。悋鴳c等，2010），Diaporthe sp. JTXHS1（Phomopsis sp.的有性態(tài)）能夠侵染葡萄，引起葡萄樹干疾?。―issana-

yake et a1.， 2014），展現出較強的寄主適應性。而P. longicolla是擬莖點霉屬中一個重要的種，可侵染大豆、三葉草、綠豆、豌豆、花生、洋蔥、大蒜、辣椒、番茄等（耿肖兵等，2015），擁有較廣的寄主范圍，高溫、高濕、多雨的環(huán)境極易導致病害大量發(fā)生（張岳平等，2013），與本研究致病性測定結果一致。但是已報道擬莖點霉屬每個種的寄主范圍尚不完全清楚（姜子德等，2003），因而寄主對其協(xié)同進化的影響無法得到確認。本研究的P. longicolla YZ為在奈李上發(fā)現的菌株，是否對湖南永州地區(qū)柑橘、茶樹、葡萄等也具有侵染性還有待進一步研究；此外，該病原菌在我國的危害情況、區(qū)域分布和寄主范圍等尚不清楚，亦有待進一步探究。

目前對擬莖點霉屬引起病害的防治研究相對薄弱（張岳平等，2013），且該真菌引起的病害尚無系統(tǒng)的防治對策，導致果農使用常規(guī)化學農藥不能達到理想的防治效果，一旦該病害發(fā)生極易造成大面積暴發(fā)，果農損失嚴重?；瘜W防治因速效而深受農民歡迎，因此在明確病原菌生物學基礎上，需加強化學藥劑對該病原菌的防控效果篩選，為指導奈李種植和該病害的防治提供科學依據。

4 結論

本研究結果表明，危害湖南永州奈李果實的新發(fā)生病害的病原物屬于擬莖點霉屬，初步確定病原菌為P. longicolla YZ。

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（責任編輯 麻小燕）