黃穗萍 郭堂勛 莫賤友 李其利 唐利華 陳軍 吳玉東 魏晴

摘要：【目的】明確廣西香蕉種植區(qū)香蕉枯萎病菌生理小種的類型及分布范圍，為發(fā)展其抗病育種技術(shù)及制定有針對性的綜合防控措施打下基礎(chǔ)?！痉椒ā繌膹V西香蕉主產(chǎn)區(qū)采集38份具典型香蕉枯萎病發(fā)病癥狀的病害樣本，采用常規(guī)組織分離法分離病原菌，根據(jù)分離菌株的形態(tài)特征和特異引物PCR擴增結(jié)果確定香蕉枯萎病菌的生理小種類型?！窘Y(jié)果】從38份病害樣本中分離出35株尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum），經(jīng)鑒定，有34株為尖孢鐮刀菌古巴?；停‵. oxysporum f. sp. cubense），病菌檢出率為89.47%，其中，9株為1號生理小種，25株為4號生理小種，檢出率分別為26.47%和73.53%；4號生理小種均為熱帶4號生理小種。1號生理小種在廣西香蕉種植區(qū)均有分布，4號生理小種主要分布于廣西中東部和南部的香蕉種植區(qū)。【結(jié)論】熱帶4號生理小種為廣西香蕉枯萎病菌的優(yōu)勢種群，在抗病育種中應(yīng)以熱帶4號生理小種為靶標(biāo)菌，且優(yōu)先選擇廣西西部和北部的香蕉適生區(qū)作為新的香蕉種植地。

關(guān)鍵詞： 香蕉枯萎病菌；生理小種鑒定；群體分布；廣西

中圖分類號： S435.79 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）08-1326-06

Abstract：【Objective】The present experiment was conducted to investigate type and distribution of Fusarium oxysporum f. sp. cubense physiological races in banana growing areas of Guangxi， in order to lay foundation for developing disease-resistant breeding techniques and taking comprehensive measures to control disease. 【Method】A total of 38 diseased samples with the typical symptom of banana wilt were collected from banana-producing areas of Guangxi， and pathogens were isolated through conventional tissue isolation method. Types of F. oxysporum f. sp. cubense physiological races were confirmed based on morphological features and PCR results of specific primers. 【Result】The results showed that， 35 strains of F. oxysporum were isolated from 38 diseased samples， 34 of which were identified as F. oxysporum f. sp. cubense. The detection rate of pathogen was 89.47%. Among 34 strains of F. oxysporum f. sp. cubense， 9 strains were F. oxysporum f. sp. cubense race 1（Foc1）， 25 strains were F. oxysporum f. sp. cubense race 4（Foc4）. The detection rates of Foc1 and Foc4 were 26.47% and 73.53%， respectively. Foc1 were distributed in banana-producing areas. Foc4 species belonged to tropical species race 4（TR4）， was mainly distrbuted in banana-producing areas of mid-eastern and southeastern Guangxi. 【Conclusion】TR4 is dominant population of F. oxysporum f. sp. cubense physiological races in Guangxi， so it should be choosed as target pathogen for breeding disease-resistant varieties. The areas suitable for bananas growth in west and north Guangxi should preferentially be elect as new banana-producing areas.

Key words： Fusarium oxysporum f. sp. cubense； identification of physiological races； population distribution； Guangxi

0 引言

【研究意義】香蕉枯萎?。˙anana fusarium wilt）是一種系統(tǒng)性土傳病害，其病原為尖孢鐮刀菌古巴專化型（Fusarium oxysporum f. sp. cubense）。香蕉感染枯萎病菌后，苗期一般生長良好，大多數(shù)植株到抽蕾后才表現(xiàn)癥狀，造成整株枯萎發(fā)黃（又稱黃葉?。未鸁o商品果或果小無商品價值，嚴(yán)重影響香蕉產(chǎn)量和制約香蕉產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。香蕉枯萎病菌在土壤中存活時間長，目前尚無有效的防治措施，采取嚴(yán)格的檢疫和隔離措施阻止病害蔓延，開辟新的香蕉種植地是目前生產(chǎn)上行之有效的辦法。不同香蕉枯萎病菌生理小種類型對香蕉品種致病性存在明顯差異，1號小種侵染Gros Michel等，2號小種侵染Bluggoe及其近緣屬，3號小種侵染Heliconiae，4號小種侵染Cavendish蕉和對1號、2號小種感病的香蕉品種（Waite and Stover，1960；Su et al.，1977，1986；Ploetz， 2006），4號生理小種又劃分為亞熱帶4號小種（STR4）和熱帶4號小種（TR4）。在廣西，香蕉是重要的外運、高效益型熱帶和亞熱帶著名水果，是廣西農(nóng)民增加經(jīng)濟收入的主要途徑之一。據(jù)統(tǒng)計，2012年廣西香蕉種植面積為8.57萬ha，產(chǎn)量210.66萬t，位居全國第二。因此，對廣西香蕉枯萎病菌生理小種進(jìn)行鑒定，明確廣西香蕉枯萎病菌的生理小種類型及在廣西的分布情況，對病害防控及保障廣西香蕉產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】2009年以前，香蕉枯萎病菌生理小種主要通過測定病原菌對不同香蕉品種的致病性來鑒定，試驗耗時長，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們開始采用PCR檢測香蕉枯萎病菌生理小種的類型。2001年，莫賤友等（2006，2008）通過致病力測定和PCR特異擴增技術(shù)確定廣西主要蕉區(qū)發(fā)生的西貢蕉枯萎病是由香蕉鐮刀菌枯萎病病原菌1號生理小種引起。Lin等（2009）通過RAPD隨機擴增得到4號生理小種（Foc4）的特異片段，根據(jù)特異片段設(shè)計特異引物，并優(yōu)化擴增體系和程序，得到能特異檢測4號生理小種的引物Foc-1/Foc-2。Dita等（2010）通過分析Foc的翻譯延伸因子1（TEF-1a）和核糖體操縱子的轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（IGS）的基因序列得到TR4的多態(tài)性片段，設(shè)計引物及優(yōu)化PCR擴增程序和體系，得到能特異檢測熱帶4號生理小種的特異引物FocTR4-F/FocTR4-R。Li等（2011）和曾莉莎等（2014）用TR4的特異引物FocTR4-F/FocTR4-R證明了廣東、海南、福建和臺灣的香蕉枯萎病4號生理小種主要為熱帶4號小種（TR4）。李敏慧等（2012）根據(jù)篩選到的4號生理小種候選致病相關(guān)基因序列設(shè)計引物，分別以來自海南、廣東和廣西的6個香蕉枯萎病菌1號生理小種菌株、7個4號生理小種菌株、7個尖鐮孢其他?；途昙?個外圍菌株DNA為模板篩選香蕉枯萎病菌1號、4號生理小種特異性引物及尖鐮孢菌的通用引物。莫賤友等（2012）用ST1/ST2特異引物擴增鑒定廣西部分蕉區(qū)受到香蕉枯萎病菌4號生理小種侵染為害?！颈狙芯壳腥朦c】目前，廣西出現(xiàn)了香蕉枯萎病菌1號生理小種和4號生理小種，但兩個生理小種在廣西的分布范圍尚待明晰；4號生理小種是熱帶4號生理小種（TR4）還是亞熱帶4號生理小種（STR4）亦需要進(jìn)一步確認(rèn)?！緮M解決的關(guān)鍵問題】從廣西香蕉主產(chǎn)區(qū)采集香蕉枯萎病疑似病害樣本進(jìn)行病原菌分離，根據(jù)分離菌株的形態(tài)特征和特異引物PCR擴增結(jié)果對香蕉枯萎病菌生理小種類型進(jìn)行鑒定，以明確廣西香蕉枯萎病菌的生理小種類型及在廣西的分布情況，為發(fā)展其抗病育種技術(shù)及制定針對性的綜合防控措施打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

在廣西香蕉主產(chǎn)區(qū)抽點調(diào)查，共采集38份香蕉枯萎病疑似病害樣本，記錄樣本采集時間、地點及香蕉品種。標(biāo)準(zhǔn)菌株Foc1由東莞香蕉研究所呂順高級農(nóng)藝師惠贈，F(xiàn)oc4由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)姜子德教授饋贈，STR4為澳大利亞Suzy Bentley博士惠贈（周而勛教授轉(zhuǎn)贈）。

1. 2 病原菌分離純化

剖開樣本病株假莖觀察維管束病變情況，描述癥狀并拍照。

從樣本病健交界處切取5 mm×5 mm組織，采用常規(guī)組織分離法分離病原菌，于25 ℃在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)2～3 d，待長出菌落后，挑取菌落邊緣菌絲純化培養(yǎng)。純化培養(yǎng)后的分離物采用稀釋法進(jìn)一步進(jìn)行單孢純化（李金花等，2011）。4 ℃保存菌種備用。

1. 3 菌株形態(tài)學(xué)鑒定

用PDA培養(yǎng)基活化菌株，待菌落長滿整皿時，挑取菌體在顯微鏡下觀察大、小孢子形態(tài)。

1. 4 病原菌生理小種鑒定

菌株培養(yǎng)：在PDA培養(yǎng)基上鋪一層玻璃紙，將菌株接種在培養(yǎng)基中央，封口后置于25 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)7～10 d。

DNA提?。河锰旄鵇NA提取試劑盒（DP305）提取菌株DNA，具體操作參照提取試劑盒說明。

特異片段擴增：采用尖孢鐮刀菌特異引物W106F/ W106R（李敏慧等，2012）、香蕉枯萎病菌1號生理小種特異引物W1805F/W1805R（李敏慧等，2012）、香蕉枯萎病菌4號生理小種特異引物Foc-1/Foc-2（Lin et al.，2009）和熱帶4號小種（TR4）特異引物FocTR-F/FocTR-R（Dita et al.，2010）確定菌株生理小種類型（表1）。

2 結(jié)果與分析

2. 1 病原菌初步鑒定結(jié)果

經(jīng)病原菌分離，從38份病害樣本中分離出35株菌株（表2）。35份菌株的菌落生長速度中等，菌絲蓬松，羊絨狀，初期為白色，后期產(chǎn)生紫色至深紫色色素。在顯微鏡下觀察到小型分生孢子長橢圓形、紡錘形、直或略彎曲成腎形等。大型分生孢子直至輕微彎曲，細(xì)胞壁薄，兩端漸尖，有時頂細(xì)胞微彎曲成鉤狀，多為3～5分隔。以上形態(tài)學(xué)特征符合鐮刀菌（Fusarium oxysporum）的形態(tài)描述（Leslie et al.，2006）。

2. 2 香蕉枯萎病菌生理小種鑒定結(jié)果

尖孢鐮刀菌特異引物W106F/W106R擴增結(jié)果表明，1～35號菌株均能擴增出大小為729 bp的片段（圖1-A），說明1～35號菌株均為尖孢鐮刀菌。1號生理小種特異引物W1805F/W1805R擴增結(jié)果表明，1、2、18、24、25、27、32、33和34號共9株菌株擴增出大小為354 bp的片段，為1號生理小種，占總菌株的26.47%（圖1-B）；4號生理小種特異引物Foc-1/Foc-2擴增結(jié)果表明，4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、19、20、21、22、23、26、28、29、30、31和35號共25株菌株擴增出大小為242 bp的片段，為4號生理小種，占總菌株的73.53%（圖1- C）；熱帶4號生理小種特異引物FocTR4-F/FocTR4-R的擴增結(jié)果表明，4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、19、20、21、22、23、26、28、29、30、31和35號共25個菌株擴增出大小為463 bp的片段，為熱帶4號生理小種，占總菌株的73.53%；3號菌株未擴增到條帶，僅為尖孢鐮刀菌?？梢?，鑒定為4號生理小種的25株菌株均為熱帶4號生理小種；采集的38份香蕉枯萎病疑似病害樣本中，34份病害樣本是由F. oxysporum f. sp. cubense（Foc）侵染引起，病菌檢出率為89.47%（表2）。

2. 3 香蕉枯萎病菌生理小種在廣西香蕉主產(chǎn)區(qū)的分布情況

由表2可知，35份病害樣本來自27個不同的香蕉種植點，其中來自南寧市壇洛鎮(zhèn)定頓村的3份病害樣本鑒定出1份1號小種和2份4號生理小種。由圖2可知，1號生理小種分布于百色市、崇左市、南寧市、欽州市等地，分布范圍較廣；4號生理小種分布于欽州市、北海市、南寧市等地，主要集中在廣西的中東部和南部的香蕉種植區(qū)，西南的崇左市、西北的百色市和東北的貴港市均未發(fā)現(xiàn)4號生理小種。

3 討論

從本研究鑒定結(jié)果看，廣西香蕉枯萎病菌為1號和4號生理小種，4號生理小種為熱帶4號生理小種（TR4）。Su等（1977）、謝藝賢等（2005）、劉景梅等（2006）、李敏慧等（2007）和韋紹龍等（2015）報道了中國存在1號和4號生理小種，Li等（2011）研究指出臺灣、廣東和福建的4號生理小種為熱帶4號小種。本研究結(jié)果與前人的研究結(jié)果一致。

從分離數(shù)量來看，1號生理小種分離出9株菌株，熱帶4號生理小種分離出25株菌株，分別占總菌株的26.47%和73.53%。可見，目前廣西香蕉枯萎病菌以熱帶4號生理小種為優(yōu)勢種群，而2001年前廣西主要以1號生理小種為主（莫賤友等，2006，2008）。目前市場上尚未出現(xiàn)抗熱帶4號生理小種且園藝性狀良好的香蕉品種，因此，發(fā)生熱帶4號生理小種為害的香蕉地應(yīng)實行與其他作物輪作，或開辟新地塊種植香蕉。

從分布情況來看，1號生理小種分布范圍廣，在廣西主產(chǎn)蕉區(qū)均有分布；熱帶4號生理小種主要分布于廣西的中東部和南部的香蕉種植區(qū)。故香蕉種植新地塊最好選擇在廣西西部和北部的香蕉適生區(qū)，種植的香蕉品種以抗1號生理小種的香芽蕉為主，以規(guī)避香蕉枯萎病菌的侵染風(fēng)險。在香蕉種植過程中要做好種苗檢疫工作，不從病區(qū)調(diào)運種苗，一旦出現(xiàn)香蕉枯萎病癥狀應(yīng)及時隔離病區(qū)，防止其蔓延。

廣西最先出現(xiàn)的香蕉枯萎病菌為1號生理小種，在近幾年的生產(chǎn)中漸漸發(fā)現(xiàn)香蕉枯萎病菌熱帶4號生理小種為害，熱帶4號生理小種出現(xiàn)的可能原因：一是外來的香蕉枯萎病菌經(jīng)帶病種苗傳播進(jìn)入廣西；二是隨著抗病品種的應(yīng)用及氣候條件的變化，使當(dāng)?shù)鼐臧l(fā)生突變形成適應(yīng)新品種和當(dāng)?shù)刈匀粭l件的新菌株。因此，廣西與相鄰省份的香蕉枯萎病菌的遺傳進(jìn)化關(guān)系有待進(jìn)一步研究，同時，在今后的工作中應(yīng)加強香蕉枯萎病菌生理小種動態(tài)變化的監(jiān)測，為防控該病和防止其擴散提供技術(shù)指導(dǎo)。

4 結(jié)論

廣西香蕉存在香蕉枯萎病菌1號和4號生理小種，4號生理小種均為熱帶4號生理小種。熱帶4號生理小種為廣西香蕉枯萎病菌的優(yōu)勢種群，主要分布于廣西中東部和南部的香蕉種植區(qū)。在抗病育種中應(yīng)以熱帶4號生理小種為靶標(biāo)菌，且優(yōu)先選擇廣西西部和北部的香蕉適生區(qū)作為新的香蕉種植地。

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（責(zé)任編輯 麻小燕）