司景磊 黃玥萌 李龍 陳秋明 嚴(yán)雪瑜 吳延軍 張?bào)?/p>

摘要：【目的】克隆廣西巴馬小型豬孕激素和脂聯(lián)素分子受體3（PAQR3）基因，并研究該基因在廣西巴馬小型豬不同組織中的表達(dá)特性，為揭示PAQR3的功能及其在疾病模型中的作用打下基礎(chǔ)。【方法】采用RT-PCR擴(kuò)增廣西巴馬小型豬PAQR3基因，應(yīng)用在線預(yù)測(cè)軟件對(duì)其功能和結(jié)構(gòu)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并以qRT-PCR分析PAQR3基因在不同組織中的表達(dá)特性及高脂高糖誘導(dǎo)后的表達(dá)水平?！窘Y(jié)果】廣西巴馬小型豬PAQR3基因編碼區(qū)（CDS）序列全長(zhǎng)936 bp，編碼312個(gè)氨基酸，與人類（XM_006714106.2）、獼猴（NM_001257693.1）、牛（XM_010806259.1）、家犬（XM_014109889.1）、家鼠（XM_ 006534874.2）、羊（XM_012180242.1）、雞（ XM_001233720.3） PAQR3氨基酸序列的一致性在81%以上，其中與獼猴的親緣關(guān)系最近，與牛的親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。PAQR3蛋白氨基酸序列包含保守的HlyIⅡ結(jié)構(gòu)域，為親水性蛋白，有7個(gè)跨膜螺旋結(jié)構(gòu)；其二級(jí)結(jié)構(gòu)主要是延伸鏈，占31.83%；該蛋白不存在信號(hào)肽，不屬于分泌蛋白。qRT-PCR分析結(jié)果表明，PAQR3基因在廣西巴馬小型豬的不同組織中均有表達(dá)，以在肺臟中的表達(dá)量最高、脂肪中的表達(dá)量最低；經(jīng)高脂高糖誘導(dǎo)后，PAQR3基因在廣西巴馬小型豬肝臟組織中的表達(dá)水平顯著降低（P<0.05）?！窘Y(jié)論】PAQR3基因在廣西巴馬小型豬不同組織中廣泛表達(dá)，在膽固醇和甘油三脂充裕的條件下，機(jī)體可通過(guò)下調(diào)PAQR3基因的表達(dá)量來(lái)平衡膽固醇含量。

關(guān)鍵詞： 廣西巴馬小型豬；PAQR3基因；克?。槐磉_(dá)譜分析

中圖分類號(hào)： S828.89 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2016）08-1390-06

Abstract：【Objective】The present experiment was conducted to clone progesterone and adipoQ receptor 3（PAQR3） gene of Guangxi Bama mini-pig and investigate its expresssion in different tissues of Guangxi Bama mini-pig， in order to lay a foundation for revealing PAQR3 fuction and its role in disease models. 【Method】The PAQR3 gene of Guangxi Bama mini-pig was cloned by RT-PCR， the protein structure of porcine PAQR3 was analyzed based on bioinformatics using online prediction software. The PAQR3 gene expression pattern in different tissues and its expression level after being induced by high fat and high sugar were detected by qRT-PCR. 【Result】The results showed that， the PAQR3 gene of Guangxi Bama mini-pig was 936 bp in length， encoding 312 amino acids. The phylogenetic tree analysis showed that， and the amino acid sequence of porcine PAQR3 protein shared identity of more than 81% with human（XM_006714106.2）， macaque（NM_001257693.1）， cattle（XM_010806259.1）， canis famliliaris（XM_014109889.1）， house mouse（XM_0065348

74.2）， sheep（XM_012180242.1） and chicken（XM_001233720.3）. It indicated that Guangxi Bama mini-pig had the closest genetic relationship with macaque， but the most distant genetic relationship with cattle. Furthermore， PAQR3 protein contained conserved HlyIⅡ domain and was hydrophilic protein， with 7 transmembrane helices， and the extended strand accounted for 31.83% in the secondary structure. And PAQR3 protein wasnt secretory protein because it had no signal peptide. The qRT-PCR results showed that， PAQR3 gene was expressed in the different tissues of Guangxi Bama mini-pig， especially in lung at the highest level， but in fat at the lowest level. In addition， after being induced by high fat and high sugar， the expression level of PAQR3 gene was reduced significantly in liver tissues of Guangxi Bama mini-pig（P<0.05）. 【Conclusion】Th PAQR3 gene can be expressed widely in different tissues of Guangxi Bama mini-pig， and under high content of cholesterol and triglyceride， body can balance cholesterol content by regulating PAQR3 gene expresssion.

Key words： Guangxi Bama mini-pig； PAQR3 gene； cloning； expression patterns analysis

0 引言

【研究意義】孕激素和脂聯(lián)素分子受體3（Progesterone and adipoQ receptor 3，PAQR3）又名RKTG（Raf kinase trapping to golgi），為PAQRs家族中的一員，是具有7次跨膜結(jié)構(gòu)且N端在外、C端在胞內(nèi)的膜蛋白受體（Yamauchi et al.，2003；Feng et al.，2007；Luo et al.，2008）。PAQRs家族在哺乳動(dòng)物中有11個(gè)成員，即PAQR1～PAQR11（Tang et al.，2005），其成員的功能各不相同，主要是由于具有非保守性的N末端和C末端結(jié)構(gòu)（陳雁和謝小多，2009）。因最初發(fā)現(xiàn)某些成員具有與脂聯(lián)素或孕酮相似的生物學(xué)功能，故被命名為孕酮及脂聯(lián)素受體家族（Tang et al.，2005）。PAQR3能參與細(xì)胞的多種信號(hào)通路，特別是與癌癥發(fā)生發(fā)展相關(guān)的信號(hào)通路，其在乳腺癌、胃癌、直腸癌等腫瘤組織中的表達(dá)水平降低，進(jìn)而增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞對(duì)抗腫瘤藥物的敏感性（李日恒等，2015；宋艷敏等，2015）。因此，研究PAQR3基因在不同組織中的表達(dá)特性對(duì)揭示其功能具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】自PAQR3被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，其功能多樣性正逐步被報(bào)道。Greene和Tischler（1976）研究表明，PAQR3基因過(guò)表達(dá)能抑制神經(jīng)生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的P12細(xì)胞分化；Fan等（2008）研究表明，PAQR3通過(guò)在空間上調(diào)控Raf激酶而達(dá)到抑制Ras/ Raf/MEM/ERK信號(hào)通路的目的；Wang等（2013）研究證實(shí)，PAQR3在調(diào)節(jié)機(jī)體能量代謝、肥胖及胰島素信號(hào)通路方面發(fā)揮重要作用；宋艷敏等（2015）研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌組織中PAQR3基因表達(dá)降低與啟動(dòng)子發(fā)生高甲基化密切相關(guān)；而李日恒等（2015）通過(guò)結(jié)直腸癌組織甲基化特異性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌組織中PAQR3基因甲基化與性別、年齡和腫瘤部位無(wú)關(guān)。此外，PAQR3基因過(guò)表達(dá)和敲除分別能夠降低或增強(qiáng)PI3K活性及PIP3的產(chǎn)生（王笑等，2013）；在機(jī)體膽固醇水平較低的條件下，PAQR3能夠?qū)cap/SREBP2錨定于高爾基體上，從而調(diào)節(jié)機(jī)體膽固醇的合成（Xu et al.，2015）。【本研究切入點(diǎn)】PAQR3不僅在抑制癌細(xì)胞生成方面有積極作用，還在膽固醇和脂肪酸的合成與代謝、胰島素抵抗信號(hào)通路等方面發(fā)揮重要作用（Wang et al.，2012；Xu et al.，2015），但目前針對(duì)豬PAQR3基因表達(dá)尚無(wú)研究報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】應(yīng)用RT-PCR擴(kuò)增廣西巴馬小型豬PAQR3基因編碼區(qū)（CDS）序列，應(yīng)用在線預(yù)測(cè)軟件對(duì)其功能和結(jié)構(gòu)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并以qRT-PCR分析PAQR3基因mRNA在不同組織中的表達(dá)特性及高脂高糖誘導(dǎo)后的表達(dá)水平，以期為進(jìn)一步研究PAQR3的功能及其在疾病模型中的作用打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

廣西巴馬小型豬樣品由廣西大學(xué)動(dòng)物遺傳育種實(shí)驗(yàn)室保存提供。除LA Taq DNA聚合酶、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、SYBP■ Green I定量試劑盒、DL2000 DNA Marker、pMD19-T載體、DNA回收試劑盒、DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司外，其他試劑均購(gòu)自TaKaRa公司。

1. 2 組織總RNA提取

采用Trizol提取廣西巴馬小型豬肝臟組織總RNA，以核酸儀檢測(cè)所提取RNA的濃度和純度，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所提取RNA完整性。cDNA第一鏈的合成按TaKaRa試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 3 PAQR3基因克隆及定量引物

根據(jù)GenBank上已公布的豬PAQR3基因CDS序列（登錄號(hào)XM_013998797.1）設(shè)計(jì)PAQR3基因擴(kuò)增引物PAQR3-F1和PAQR3-R1，同時(shí)針對(duì)PAQR3、SREBP2（固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白2）、HMGCS（3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合酶基因）、HMGCR（HMGCoA還原酶）、LDLR（低密度脂蛋白受體）、ABCA1（三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1）等基因分別設(shè)計(jì)不同的熒光定量PCR（qRT-PCR）擴(kuò)增引物，包括PAQR3-F2/R2、SREBP2- F/R、HMGCS-F/R、HMGCR-F/R、LDLR-F/R、ABCA1- F/R及管家基因GAPDH（內(nèi)參基因），所有引物均由深圳華大基因研究院合成（表1）。以廣西巴馬小型豬肝臟cDNA為模板進(jìn)行目的片段擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系50.0 μL：cDNA模板1.0 μg，10 μmol/L的上、下游引物（PAQR3-F1/PAQR3-R1）各0.5 μL，LA Taq DNA聚合酶12.5 μL，加ddH2O補(bǔ)足至50.0 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性1 min；98 ℃ 10 s，60 ℃ 35 s，72 ℃ 1 min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。

1. 4 目的片段克隆

用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物片段大小，并切膠回收連接至pMD19-T載體（膠回收產(chǎn)物4.0 μL、Ligase Buffer 5.0 μL、pMD19-T載體1.0 μL），然后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，并涂布于含有氨芐青霉素的LA培養(yǎng)基上，37 ℃下倒置培養(yǎng)過(guò)夜（10 h）后挑選陽(yáng)性克隆進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證，將陽(yáng)性菌落送至華大基因研究院進(jìn)行測(cè)序鑒定。

1. 5 PAQR3基因生物信息學(xué)分析

將測(cè)序結(jié)果用Lasergene 7.0進(jìn)行序列比對(duì)分析，用MEGA 6.0進(jìn)行同源性比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。利用ExPASy數(shù)據(jù)庫(kù)中的ProtParam預(yù)測(cè)PAQR3基因所編碼蛋白的親/疏水性、氨基酸組成和理化性質(zhì)、跨膜結(jié)構(gòu)域等生物學(xué)信息。

1. 6 PAQR3基因在不同組織中的表達(dá)水平分析

以稀釋后的cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR，反應(yīng)體系：SYBP Premix Ex TaqTMⅡ 10.0 μL，cDNA模板5.0 μL，上、下游引物各0.4 μL，ddH2O 4.2 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性30 s；94 ℃ 10 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 1 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。利用2-△△Ct計(jì)算PAQR3基因的相對(duì)表達(dá)量。所有樣品進(jìn)行3個(gè)重復(fù)，且均設(shè)陰性對(duì)照。

1. 7 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)分析PAQR3基因的表達(dá)水平，以Duncans多重和單因素方差分析比較其差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2. 1 PAQR3基因CDS序列和氨基酸序列分析結(jié)果

以廣西巴馬小型豬肝臟cDNA為模板，用PAQR3-F1和PAQR3-R1引物能擴(kuò)增出1條特異性條帶，長(zhǎng)度約930 bp（圖1），與預(yù)期結(jié)果一致。

將目的片段膠回收后連接至pMD19-T載體，再轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆進(jìn)行菌液PCR鑒定，結(jié)果獲得1條清晰的目的條帶（圖2），即表明菌液測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果正確。

擴(kuò)增獲得的PAQR3基因CDS序列全長(zhǎng)936 bp，編碼312個(gè)氨基酸，與NCBI已公布的豬PAQR3基因序列（XM_013998797.1）的同源性為100%，與人類（XM_006714106.2）、獼猴（NM_001257693.1）、牛（XM_

010806259.1）、家犬（XM_014109889.1）、家鼠（XM_

006534874.2）、羊（XM_012180242.1）、雞（XM_001233-

720.3）PAQR3氨基酸序列的一致性分別為93%、92%、91%、93%、89%、92%和81%，說(shuō)明PAQR3基因具有高度保守性。利用MEGA 6.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，發(fā)現(xiàn)廣西巴馬小型豬與獼猴的PAQR3基因親緣關(guān)系最近，而與牛PAQR3基因的親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)（圖3）。

2. 2 PAQR3基因理化性質(zhì)預(yù)測(cè)及蛋白保守域分析結(jié)果

2. 2. 1 PAQR3基因的理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果 使用ExPASy在線網(wǎng)站進(jìn)行PAQR3基因編碼蛋白親/疏水性分析，結(jié)果顯示，廣西巴馬小型豬PAQR3蛋白平均親水?dāng)?shù)為0.403，屬于親水蛋白（圖4）。ProtScale程序預(yù)測(cè)得到PAQR3蛋白的理論等電點(diǎn)（pI）為9.15，分子量為21893.6。用TMHMM程序預(yù)測(cè)PAQR3蛋白的7個(gè)跨膜螺旋區(qū)，結(jié)果（圖5）發(fā)現(xiàn)7個(gè)跨膜螺旋的位置分別位于PAQR3蛋白序列中的第74～96、106～128、141～163、173～195、202～224、239～256和276～298位氨基酸殘基處。SOPMA網(wǎng)站預(yù)測(cè)PAQR3蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，α-螺旋占31.19%，延伸鏈占31.83%，β-轉(zhuǎn)角占11.90%，無(wú)規(guī)則卷曲占25.08%。利用PSORTⅡ預(yù)測(cè)PAQR3蛋白的細(xì)胞器定位，發(fā)現(xiàn)其分布概率為：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)47.8%，線粒體34.8%，囊泡分泌系統(tǒng)4.3%，細(xì)胞核13.0%。SingIP 4.1 Server在線預(yù)測(cè)信號(hào)肽發(fā)現(xiàn)PAQR3不存在信號(hào)肽，即該蛋白不屬于分泌蛋白。

2. 2. 2 PAQR3蛋白保守域分析結(jié)果 根據(jù)NCBI網(wǎng)站BLAST檢索結(jié)果分析PAQR3蛋白保守結(jié)構(gòu)域，結(jié)果顯示，廣西巴馬小型豬PAQR3蛋白氨基酸序列符合蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，包含保守的HlyIⅡ結(jié)構(gòu)域（圖6）。2. 3 PAQR3基因在不同組織中的表達(dá)水平分析結(jié)果

2. 3. 1 PAQR3基因在10種不同組織中的表達(dá)譜 以廣西巴馬小型豬不同組織的cDNA為模板，分別進(jìn)行PAQR3基因和GAPDH基因的qRT-PCR擴(kuò)增分析，結(jié)果表明，PAQR3基因在肺臟中的表達(dá)量最高，而在脂肪中的表達(dá)量最低（圖7）。

2. 3. 2 高脂高糖誘導(dǎo)對(duì)PAQR3基因表達(dá)的影響 以高脂高糖飼料飼喂廣西巴馬小型豬12個(gè)月，以正常的飼料營(yíng)養(yǎng)水平為對(duì)照。采集廣西巴馬小型豬肝臟并提取cDNA為模板，qRT-PCR擴(kuò)增分析相關(guān)基因和內(nèi)參基因的表達(dá)情況，結(jié)果（圖8）表明，高脂高糖誘導(dǎo)后廣西巴馬小型豬肝臟的PAQR3基因表達(dá)量顯著低于對(duì)照組（P<0.05），LDLR基因表達(dá)量極顯著低于對(duì)照組（P<0.01），其他基因的表達(dá)量與對(duì)照組無(wú)顯著差異（P>0.05）。

3 討論

自PAQR3被發(fā)現(xiàn)至今，已不斷展現(xiàn)其在不同方面和代謝信號(hào)通路的作用，起初關(guān)于PAQR3的研究主要集中于癌癥方面，包括抑制結(jié)直腸癌、膀胱癌和肝癌的發(fā)生發(fā)展（Wu et al.，2014；Xiu et al.，2014；Yu et al.，2014）。PAQR3在調(diào)節(jié)由飲食誘導(dǎo)的肥胖、能量代謝、胰島素抵抗中同樣具有顯著作用。如PAQR3基因敲除鼠經(jīng)高脂高糖誘導(dǎo)16周后能有效抵抗肥胖和機(jī)體脂肪的生成，且其血液膽固醇和低密度脂蛋白水平顯著低于野生組（Wang et al.，2013）。機(jī)體膽固醇、脂質(zhì)代謝是人類許多疾病發(fā)生發(fā)展的基礎(chǔ)，如與糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化等疾病密切相關(guān)（Xu et al.，2015）。機(jī)體膽固醇合成主要通過(guò)食物吸收和體內(nèi)膽固醇合成，在哺乳動(dòng)物中，膽固醇從頭合成是機(jī)體膽固醇需求的一種重要方式（Xu et al.，2015）。本研究通過(guò)檢測(cè)高脂高糖誘導(dǎo)廣西巴馬小型豬肝臟PAQR3基因表達(dá)量及調(diào)控膽固醇合成與代謝的相關(guān)基因，發(fā)現(xiàn)高脂高糖誘導(dǎo)后PAQR3基因顯著下調(diào)，同時(shí)調(diào)控膽固醇合成的相關(guān)基因下調(diào)表達(dá)、調(diào)控膽固醇代謝的相關(guān)基因上調(diào)表達(dá)。

PAQR3雖屬于脂聯(lián)素受體家族成員，但有報(bào)道指出，同時(shí)敲除AdipoR1和AdipoR2基因能引起胰島素抵抗和葡萄糖耐受性，提高組織甘油三酯含量和炎癥氧化應(yīng)激（Yamauchi et al.，2007）；僅敲除AdipoR2基因也能促進(jìn)鼠Ⅱ型糖尿病發(fā)生（Liu et al.，2007）。與之相反，敲除PAQR3基因能提高能量代謝和胰島素敏感性，可區(qū)別于脂聯(lián)素受體敲除的表型（Wang et al.，2013）。PAQR3發(fā)揮這些作用主要是通過(guò)錨定p110α，從而在空間上調(diào)控PI3K信號(hào)通路來(lái)調(diào)控胰島素信號(hào)通路。本研究克隆獲得廣西巴馬小型豬PAQR3基因CDS序列，全長(zhǎng)936 bp，其核苷酸序列與人類、獼猴、牛、家犬、家鼠等核苷酸序列具有很高的一致性（在81%以上），且符合其家族蛋白的典型特征。PAQR3基因在廣西巴馬小型豬不同組織中廣泛表達(dá)，以在肺臟中的表達(dá)量最高、脂肪中的表達(dá)量最低；經(jīng)高脂高糖誘導(dǎo)后肝臟中的PAQR3基因表達(dá)量顯著下調(diào)，說(shuō)明在膽固醇和甘油三脂充裕的條件下，機(jī)體可通過(guò)下調(diào)PAQR3基因的表達(dá)量來(lái)平衡膽固醇含量。Xu等（2015）研究表明，PAQR3是通過(guò)將SREBPs/Scap錨定于高爾基體上而促進(jìn)膽固醇合成，但本課題組的前期研究結(jié)果表明，經(jīng)高脂高糖誘導(dǎo)廣西巴馬小型豬血液中膽固醇與甘油三酯的含量較對(duì)照組顯著提高（宋少銳，2014），可能是在機(jī)體負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用下，PAQR3發(fā)生錨定作用的可能性微小，同時(shí)Scap將SREBP2錨定于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，通過(guò)下調(diào)膽固醇合成相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)降低膽固醇合成，但具體原理有待進(jìn)一步探究。

4 結(jié)論

PAQR3基因在廣西巴馬小型豬不同組織中廣泛表達(dá)，在膽固醇和甘油三脂充裕的條件下，機(jī)體可通過(guò)下調(diào)PAQR3基因的表達(dá)量來(lái)平衡膽固醇含量。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）