饒穎竹 梁靜真 陳蓉 楊廷寶

摘要：【目的】了解海水養(yǎng)殖斜帶石斑魚(yú)弧菌病的病原，為生產(chǎn)中有效防治石斑魚(yú)弧菌病提供科學(xué)依據(jù)?！痉椒ā坎捎贸Ｒ?guī)方法進(jìn)行患病斜帶石斑魚(yú)病原菌分離，人工感染試驗(yàn)確定其致病性，以形態(tài)學(xué)觀察、生理生化測(cè)試結(jié)合16S rRNA和gyrB基因序列分析等方法進(jìn)行菌株鑒定，并以K-B紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。【結(jié)果】從廣東省湛江市某養(yǎng)殖場(chǎng)患病斜帶石斑魚(yú)中分離獲得1株優(yōu)勢(shì)菌株（M1），經(jīng)人工感染試驗(yàn)證實(shí)其對(duì)斜帶石斑魚(yú)具有較強(qiáng)的致病性。M1菌株的16S rRNA序列和gyrB基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的鰻弧菌具有較高相似性，其同源性均在95.7%以上。根據(jù)M1菌株的形態(tài)特征、生理生化特性及分子特征，可鑒定其屬于弧菌屬的鰻弧菌（Vibrio anguillarum）。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，M1菌株對(duì)慶大霉素、新生霉素、阿奇霉素、氟苯尼考、利福平、諾氟沙星和左氟沙星等7種藥物高度敏感，對(duì)阿洛西林、強(qiáng)力霉素、鏈霉素、復(fù)方新諾明和甲氧芐啶等14種藥物敏感?！窘Y(jié)論】引起廣東省湛江市某養(yǎng)殖場(chǎng)海水養(yǎng)殖患病斜帶石斑魚(yú)弧菌病的病原菌為弧菌屬鰻弧菌，生產(chǎn)中可適度選用氟苯尼考、強(qiáng)力霉素、復(fù)方新諾明和甲氧芐啶等抗菌藥物進(jìn)行防治。

關(guān)鍵詞： 斜帶石斑魚(yú)；鰻弧菌；16S rRNA序列；gyrB基因；藥敏試驗(yàn)

中圖分類(lèi)號(hào)： S965.334.42 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2016）08-1416-07

Abstract：【Objective】In order to provide scientific basis for effective prevention and control of grouper vibriosis， the pathogen was isolated and identified from diseased Epinephelus coioides， and its drug sensitivity was tested. 【Method】The pathogen was isolated by conventional method， and its pathogenicity was determined by artificial infection. Based on morphological observation， physiological-biochemical test， and sequences analysis of 16S rRNA and gyrB gene， the pathogen was identified. And its drug sensitivity was tested by Kirby-Bauer disc diffusion method. 【Result】One dominant bacterium strain was isolated from diseased E. coioides from fish farm in Zhanjiang， Guangdong， and named M1. It was pathogenic to E. coioides in artificial challenge test. The sequence analysis showed that， 16S rRNA and gyrB gene sequences of M1 shared high homology（more than 95.7%） with Vibrio anguillarum from GenBank database. Moreover， the strain M1 was identified as V. anguillarum based on its morphology， physiological-biochemical characteristics and molecular features， and it was highly sensitive to gentamicin， novobiocin， azithromycin， florfenicol， rifampicine， norfloxacin and levofloxacin， and moderately sensitive to 14 kinds of drugs， viz.， azlocillin， doxycycline， streptomycin， trimethoprim（TMP）， SMZ+TMP and so on. 【Conclusion】V. anguillarum is pathogen causing vibriosis of E. coioides cultured in a fish farm of Zhanjiang， Guangdong， and can be controlled by florfenicol， doxycycline， SMZ+TMP， TMP， etc.

Key words： Epinephelus coioides； Vibrio anguillarum； 16S rRNA sequence； gyrB gene； drug sensitivity test

0 引言

【研究意義】斜帶石斑魚(yú)（Epinephelus coioides）俗稱(chēng)青斑，隸屬于鱸形目（Perciformes）鮨科（Serranidae）石斑魚(yú)亞科（Epinephelinae）石斑魚(yú)屬（Epinephelus），因具有生長(zhǎng)快、適應(yīng)能力強(qiáng)、飼養(yǎng)成活率高、經(jīng)濟(jì)價(jià)值高等特點(diǎn)，現(xiàn)已成為重要的海水魚(yú)類(lèi)養(yǎng)殖對(duì)象。近年來(lái)，隨著石斑魚(yú)養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大和養(yǎng)殖密度的增加，加上有毒有害物質(zhì)的侵襲及水體環(huán)境污染等因素的影響，各種石斑魚(yú)病害頻發(fā)（張永嘉，1990；貝維全等，2010；王大鵬等，2012），給其養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。在石斑魚(yú)養(yǎng)殖過(guò)程中，極易出現(xiàn)神經(jīng)壞死病毒病、白點(diǎn)病、魚(yú)虱病、爛鰓病和細(xì)菌性疾病，而弧菌是引起海水養(yǎng)殖石斑魚(yú)細(xì)菌性疾病的最主要病原菌之一（羅鳴等，2013），因此，加強(qiáng)弧菌病原研究對(duì)有效防治石斑魚(yú)弧菌病及提高其養(yǎng)殖效益具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】弧菌是水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中最常見(jiàn)的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌類(lèi)群，其中鰻弧菌（Vibrio anguillarum）又是水產(chǎn)養(yǎng)殖中最常見(jiàn)的條件性致病菌。鰻弧菌是一類(lèi)革蘭氏陰性桿菌，廣泛存在于海水、沉積物和水生動(dòng)物體內(nèi)，當(dāng)養(yǎng)殖環(huán)境條件不利或水產(chǎn)動(dòng)物受傷時(shí)會(huì)誘發(fā)一系列病癥，造成大規(guī)模暴發(fā)（張新中等，2007）。肖慧等（1999）從山東發(fā)生爛鰓、爛尾病的鱸魚(yú)體內(nèi)分離鑒定出1株鰻弧菌，人工感染有較強(qiáng)的致病性；李清祿和陳強(qiáng)（2001）從福建海水養(yǎng)殖的患病大黃魚(yú)體內(nèi)分離獲得2株致病性鰻弧菌，并進(jìn)行藥敏試驗(yàn)和臨床治療試驗(yàn)；莫照蘭等（2002）從山東患潰爛癥的養(yǎng)殖牙鲆體內(nèi)分離獲得1株致病性鰻弧菌，與弧菌屬的同源性高達(dá)94%～98%；陳吉祥等（2005）、張曉君等（2009）分別從山東沿海患病大菱鲆體內(nèi)分離鑒定出多株鰻弧菌，并檢測(cè)了部分毒力基因和主要外膜蛋白基因；Mikkelsen等（2007）從挪威的大西洋鱈魚(yú)體上分離鑒定出不同血清型的致病性鰻弧菌；趙魯寧等（2015）收集了自1999年以來(lái)的山東、河北和江蘇等地海水養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)的31株鰻弧菌，通過(guò)生理生化、16S rRNA基因序列、血清分型和抗生素敏感性研究，發(fā)現(xiàn)我國(guó)海水養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)攜帶的鰻弧菌普遍存在多重耐藥性?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】近年來(lái)，石斑魚(yú)弧菌病暴發(fā)頻繁，嚴(yán)重制約了其養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，但至今有關(guān)廣東省海水養(yǎng)殖石斑魚(yú)弧菌病的報(bào)道較少（劉葒和江育林，2002），尚未見(jiàn)針對(duì)石斑魚(yú)鰻弧菌分子鑒定、致病性和藥物敏感性的研究報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】對(duì)海水養(yǎng)殖患病斜帶石斑魚(yú)的病原菌進(jìn)行分離和致病性研究，在常規(guī)微生物分類(lèi)的基礎(chǔ)上采用16S rRNA和gyrB基因序列分析進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定及藥敏試驗(yàn)，旨在了解斜帶石斑魚(yú)弧菌病的病原，為生產(chǎn)中有效防治石斑魚(yú)弧菌病提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

患病斜帶石斑魚(yú)采自廣東省湛江市某養(yǎng)殖場(chǎng)；供人工感染試驗(yàn)的斜帶石斑魚(yú)購(gòu)自廣東省湛江市東海島某養(yǎng)殖場(chǎng)（80尾，體重25～35 g，體長(zhǎng)10～15 cm），活動(dòng)正常，體表無(wú)損和體色正常。硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖（TCBS）瓊脂培養(yǎng)基和弧菌科細(xì)菌生理生化鑒定試劑盒購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，藥物敏感紙片購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司，PCR試劑盒和DNA純化回收試劑盒均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司，16S rRNA基因和gyrB基因的擴(kuò)增引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1. 2 病原菌分離

無(wú)菌條件下從患病斜帶石斑魚(yú)肝臟、潰爛皮膚等部位取樣，接種在TCBS培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)20～24 h后挑取優(yōu)勢(shì)單菌落再次劃線接種在TCBS培養(yǎng)基上，以獲得純培養(yǎng)菌株（M1）。挑取單菌落移入LB液體培養(yǎng)基中，150 r/min振蕩培養(yǎng)12 h后進(jìn)行生理生化鑒定，同時(shí)挑取相同單菌落進(jìn)行革蘭氏染色鑒定。最后將擴(kuò)大培養(yǎng)的菌液加入滅菌甘油至終濃度為20%，-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 3 人工感染試驗(yàn)

將M1菌株接種于普通營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)12 h后用無(wú)菌0.1 mol/L PBS（pH 7.0）振蕩清洗、離心，棄上清液，再用0.1 mol/L PBS重懸菌體，采用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定菌濃度。菌液用0.1 mol/L PBS稀釋成107 CFU/mL。挑取80尾健康斜帶石斑魚(yú)，隨機(jī)均分為4組，其中2組為試驗(yàn)組，每尾腹腔注射0.1 mL菌液，剩下2組為對(duì)照組，每尾注射相同劑量的0.1 mol/L PBS（pH 7.0）。注射后每天觀察記錄斜帶石斑魚(yú)的發(fā)病和死亡情況，連續(xù)觀察10 d，對(duì)死亡魚(yú)及時(shí)解剖，并以相同方法對(duì)致病菌再次進(jìn)行分離鑒定。以引起試驗(yàn)魚(yú)發(fā)病死亡并能重新分離到感染菌株作為分離菌株致病與否的判定標(biāo)準(zhǔn)。

1. 4 細(xì)菌鑒定

1. 4. 1 形態(tài)觀察及常規(guī)生理生化測(cè)試 挑取M1單菌落接種于TCBS培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)18～24 h，觀察TCBS培養(yǎng)基上菌落的生長(zhǎng)特征，經(jīng)革蘭氏染色后光學(xué)顯微鏡觀察其形態(tài)、大小，表型特征鑒定參照Schiewe等（1981）的方法。采用弧菌科細(xì)菌生理生化鑒定試劑盒對(duì)純化的M1菌株進(jìn)行生理生化特性鑒定，并根據(jù)鑒定結(jié)果判定弧菌種類(lèi)。

1. 4. 2 16S rRNA和gyrB基因序列測(cè)定與分析 將M1菌株接種于普通營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基上，30 ℃振蕩培養(yǎng)12 h后取10 μL菌液95 ℃滅活5 min，菌液上清液可直接作為PCR模板。16S rRNA序列的PCR擴(kuò)增引物為27F（正向引物）：5'-AGAGTTTGATC（A/C）TGGCTCA

G-3'和1492R（反向引物）：5'-TACGG（C/T）TACCTTG

TTACGACTT-3'。PCR反應(yīng)體系50.0 μL，即5.0 μL 10×PCR緩沖液，5.0 μL的2.5 mmol/L dNTPs，4.0 μL的5 μmol/L引物，1.25 U Taq DNA聚合酶，5.0 μL PCR模板，去離子水補(bǔ)足至50.0 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 40 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 90 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。

gyrB基因序列的PCR擴(kuò)增引物為UP-1（正向引物）：5'-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCA（C/T）GC（A/T/G/C）GG（A/T/G/C）GG（A/T/G/C）AA（A/G）TT（C/

T）GA-3'和UP-2r（反向引物）：5'-AGCAGGGTACGGA

TGTGCGAGCC（A/G）TC（A/T/G/C）AC（A/G）TC（A/

T/G/C）GC（A/G）TC（A/T/G/C）GTCAT-3'。除引物不同外，PCR反應(yīng)體系及其擴(kuò)增程序與16S rRNA序列的擴(kuò)增一致。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳確定特異條帶后，進(jìn)行膠回收純化，送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比較，再采用ClustalX進(jìn)行多序列比對(duì)，序列一致性由DNASTAR的MegAlign進(jìn)行計(jì)算，采用MEGA 3.0鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。

1. 5 藥敏試驗(yàn)

按常規(guī)的K-B紙片擴(kuò)散法進(jìn)行病原菌的藥敏試驗(yàn)，再根據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）藥敏試驗(yàn)判斷標(biāo)準(zhǔn)判斷藥敏結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

1. 1 M1菌株的形態(tài)特征及生理生化特性

M1菌株在TCBS培養(yǎng)基上30 ℃培養(yǎng)18～24 h，其菌落呈黃色，直徑約2.0 mm。顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，M1菌體半透明、桿狀、略顯弧形、可運(yùn)動(dòng)，菌體革蘭氏染色呈陰性。常規(guī)生理生化特性測(cè)試結(jié)果表明，M1菌株的氧化酶反應(yīng)、葡萄糖磷酸鹽胨水反應(yīng)（V-P）、蛋白胨水（吲哚）試驗(yàn)和精氨酸雙水解酶試驗(yàn)呈陽(yáng)性，能發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、阿拉伯糖和甘露醇，對(duì)弧菌抑制劑O/129（150 μg/mL）敏感。在無(wú)鹽培養(yǎng)基（無(wú)鹽胨水）上不生長(zhǎng)，在3%～6% NaCl胨水培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，葡萄糖產(chǎn)氣、賴(lài)氨酸脫羧酶和鳥(niǎo)氨酸脫羧酶等反應(yīng)呈陰性（表1）。上述生理生化特性與鰻弧菌的特征特性基本一致，參考《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》、《伯杰鑒定細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》和弧菌生理生化鑒定試劑盒說(shuō)明，初步判定M1菌株為鰻弧菌（V. anguillarum）。

2. 2 人工感染試驗(yàn)結(jié)果

腹腔注射M1菌株的活菌液3～5 d后，試驗(yàn)組斜帶石斑魚(yú)病情加重，陸續(xù)死亡，8 d后試驗(yàn)組的斜帶石斑魚(yú)累計(jì)死亡率達(dá)100%，而對(duì)照組斜帶石斑魚(yú)未表現(xiàn)出任何病癥。人工感染發(fā)病的斜帶石斑魚(yú)主要表現(xiàn)為無(wú)力、身體不平衡、體表潰爛、腹水、肝臟腫大糜爛，與自然發(fā)病斜帶石斑魚(yú)的臨床癥狀相似。從人工感染死亡斜帶石斑魚(yú)可再次分離獲得與M1菌株形態(tài)、生理生化特性、16S rRNA和gyrB基因序列均一致的菌株，表明所分離獲得的M1菌株即為斜帶石斑魚(yú)的致病菌。

2. 3 基因序列分析結(jié)果及其系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)

以引物27F和1492R擴(kuò)增的16S rRNA序列長(zhǎng)度為1509 bp（圖1），GenBank登錄號(hào)JX966409。從NCBI核苷酸數(shù)據(jù)庫(kù)中選取21株弧菌菌株的16S rRNA序列進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果表明，M1菌株的16S rRNA序列與鰻弧菌（AB680389）16S rRNA序列的一致性最高，為99.8%（表2）。由16S rRNA序列構(gòu)建的弧菌系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)（圖2）可知，M1菌株與鰻弧菌AB680389和NR042509、標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC19264）、奧德弧菌（V. ordalii，AY530930）聚為一支，對(duì)應(yīng)的16S rRNA序列一致性依次為99.8%、99.7%、97.8%和99.1%；M1菌株與其他弧菌的16S rRNA序列一致性在94.2%～99.1%（表2）。

由引物UP-1和UP-2r擴(kuò)增的gyrB基因序列長(zhǎng)度為1259 bp（圖1），GenBank登錄號(hào)JX966408。BLAST分析結(jié)果顯示，與該基因序列同源性較高的100個(gè)序列均為弧菌屬細(xì)菌的gyrB基因序列。選取19個(gè)弧菌菌株的gyrB基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果表明，M1菌株與鰻弧菌AB373054和JQ698507聚為一支（圖3），對(duì)應(yīng)的gyrB基因序列一致性分別為99.2%和98.7%（表2）。此外，M1菌株與鰻弧菌AB373055、AB373056和AB373057的gyrB基因序列一致性均為98.3%，與鰻弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC19264）的序列一致性為95.7%，與奧德弧菌（AB298237）的序列一致性為98.5%，與其他弧菌的gyrB基因序列一致性在79.9%～83.6%（表2）。

綜合M1菌株的形態(tài)特征、生理生化特性、16S rRNA和gyrB基因序列分析結(jié)果，將其鑒定為弧菌屬的鰻弧菌（V. anguillarum）。

2. 4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

由表3可以看出，M1菌株對(duì)慶大霉素、新生霉素、阿奇霉素、氟苯尼考、利福平、諾氟沙星和左氟沙星等7種抗菌藥物高度敏感，對(duì)阿洛西林、哌拉西林、壯觀霉素、頭孢克洛、頭孢曲松、頭孢哌酮、頭孢咪唑、頭孢拉定、多黏霉素B、強(qiáng)力霉素、甲氧芐啶、鏈霉素、四環(huán)素和復(fù)方新諾明等14種藥物敏感，對(duì)青霉素、苯唑霉素、氨芐青霉素、羅紅霉素、克林霉素、阿莫西林、甲硝唑、頭孢呋辛和桿菌肽等9種藥物不敏感（耐藥）。

3 討論

弧菌是海水養(yǎng)殖環(huán)境中最常見(jiàn)的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌類(lèi)群，其中鰻弧菌是危害魚(yú)類(lèi)的主要條件性致病菌（羅鳴等，2013），在某種應(yīng)激因素刺激使魚(yú)體抵抗力下降的情況下極易造成感染發(fā)病，可引起世界范圍內(nèi)的多種海水和淡水養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)發(fā)生弧菌?。∕ikkelsen et al.，2007），也是我國(guó)鱸魚(yú)、牙鲆、大菱鲆和大黃魚(yú)等海水養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)的主要病原菌（李清祿和陳強(qiáng)，2001；莫照蘭等，2002；陳吉祥等，2005），給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成較大危害。石斑魚(yú)是廣東沿海地區(qū)最重要的養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)之一，由于養(yǎng)殖方式多樣、養(yǎng)殖密度高，鰻弧菌病也是石斑魚(yú)養(yǎng)殖過(guò)程中需重點(diǎn)防治的疾?。_鳴等，2013）。本研究從廣東省湛江市患病斜帶石斑魚(yú)中分離獲得1株優(yōu)勢(shì)菌株（M1），經(jīng)人工感染試驗(yàn)，證實(shí)M1菌株對(duì)斜帶石斑魚(yú)表現(xiàn)出較強(qiáng)的致病性，人工感染后3～5 d發(fā)生死亡，臨床癥狀以肝臟腫脹糜爛、發(fā)黑為特征，與鱸魚(yú)（肖慧等，1999）和大菱鲆（陳吉祥等，2005）等感染鰻弧菌的癥狀類(lèi)似。

有關(guān)弧菌的鑒定，過(guò)去多采用以形態(tài)學(xué)和生理生化特征為主的表型鑒定方法。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，現(xiàn)代細(xì)菌分類(lèi)鑒定已從傳統(tǒng)的表型分類(lèi)轉(zhuǎn)向基因型分類(lèi)（Clarridge，2004）。小亞單位核糖體RNA的16S rRNA約1500 bp，由可變區(qū)和保守區(qū)交替組成，是細(xì)菌分類(lèi)鑒定中最常用的指標(biāo)工具（Janda and Abbott，2007），但16S rRNA適用于描述較遠(yuǎn)的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，對(duì)于一些親緣關(guān)系密切的細(xì)菌，還需用其他基因序列進(jìn)行輔助分析（侯曉麗和陳智，2005）。gyrB基因是編碼細(xì)菌DNA促旋酶（Gyrase）的亞單位，屬于單拷貝的看家基因，平均堿基替換率比16S rRNA的速率快，且不發(fā)生水平轉(zhuǎn)移，普遍存在于各種細(xì)菌中，滿(mǎn)足作為系統(tǒng)發(fā)育分析靶基因的要求，能克服16S rRNA難以準(zhǔn)確區(qū)分細(xì)菌近緣種的困難（La Duc et al.，2004）。本研究在進(jìn)行細(xì)菌形態(tài)特征和生理生化特性等常規(guī)細(xì)菌檢測(cè)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行16S rRNA和gyrB基因分子水平鑒定，結(jié)果表明，M1菌株的16S rRNA序列與鰻弧菌AB680389和NR042509、鰻弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC19264）、奧德弧菌（AY530930）聚為一個(gè)類(lèi)群，但與雙氮養(yǎng)弧菌（V. diazotrophicus）、河口弧菌（V. aestuarianus）和創(chuàng)傷弧菌（V. vulnificus）的序列一致性也較高，均在97.0%以上，即采用16S rRNA序列難以將M1菌株鑒定到種；M1菌株的gyrB基因序列除了與鰻弧菌和奧德弧菌的序列一致性達(dá)95.7%～99.2%外，與其他弧菌的序列一致性均在90.0%以下，說(shuō)明在鰻弧菌鑒別方面gyrB基因比16S rRNA序列更具優(yōu)越性。

由于操作方便、見(jiàn)效快和療效好，使用抗菌藥物仍是控制水生養(yǎng)殖動(dòng)物疾病的主要手段（張新中等，2007；王玉堂和呂永輝，2011）。肖慧等（1999）研究認(rèn)為，痢特靈、呋喃妥因、氯霉素、復(fù)方新諾明、美洛西林、新生霉素、利福平和新霉素等10種藥物對(duì)鱸魚(yú)的鰻弧菌有顯著抑制作用，可有效降低鰻弧菌引發(fā)的鱸魚(yú)苗爛鰓、爛尾病。張昕和蔡俊鵬（2003）研究表明，鰻弧菌對(duì)氯霉素、慶大霉素敏感，對(duì)卡那霉素、頭孢婁新、青霉素、四環(huán)素、紅霉素和鏈霉素已表現(xiàn)出耐藥性。公衍軍等（2006）研究發(fā)現(xiàn)，從發(fā)病鱸魚(yú)中分離獲得的鰻弧菌對(duì)青霉素、氨芐青霉素、強(qiáng)力霉素、磺胺嘧啶等常用抗菌藥已產(chǎn)生耐藥性，但對(duì)新生霉素、呋喃妥因、利福平、新霉素敏感。趙魯寧等（2015）用ATB藥敏檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)了31株海水養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)鰻弧菌的耐藥性，結(jié)果顯示，鰻弧菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)（阿莫西林、阿莫西林/克拉維酸、苯唑西林、青霉素）、林可酰胺類(lèi)（克林霉素）、硝咪唑類(lèi)（甲硝唑）和夫西地酸的耐藥率為100%。本研究中的藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，鰻弧菌M1菌株對(duì)氨基糖苷類(lèi)的慶大霉素和新生霉素、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)的阿奇霉素、酰胺類(lèi)的氟苯尼考、利福霉素類(lèi)的利福平及氟喹諾酮類(lèi)的諾氟沙星和左氟沙星等7種抗菌藥物高度敏感，對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)的青霉素、苯唑霉素、氨芐青霉素、阿莫西林，林可酰胺類(lèi)的克林霉素，硝咪唑類(lèi)的甲硝唑，糖肽類(lèi)的桿菌肽等7種藥物具有耐藥性，與公衍軍等（2006）、趙魯寧等（2015）報(bào)道的試驗(yàn)研究結(jié)果基本一致。目前，我國(guó)農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)使用的水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物國(guó)標(biāo)獸藥抗菌藥物有14個(gè)品種（郭秀平等，2014；中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部，2015），包括本研究中斜帶石斑魚(yú)鰻弧菌菌株對(duì)之高度敏感的氟苯尼考粉（水產(chǎn)用）及敏感的鹽酸多西環(huán)素粉（強(qiáng)力霉素，水產(chǎn)用）、復(fù)方磺胺甲噁唑粉（復(fù)方新諾明，水產(chǎn)用）和復(fù)方磺胺嘧啶粉（甲氧芐啶，水產(chǎn)用）。因此，在生產(chǎn)中可適度選用氟苯尼考、強(qiáng)力霉素、復(fù)方新諾明和甲氧芐啶等抗菌藥物控制廣東省湛江地區(qū)海水養(yǎng)殖斜帶石斑魚(yú)的鰻弧菌病。

4 結(jié)論

引起廣東省湛江市某養(yǎng)殖場(chǎng)海水養(yǎng)殖斜帶石斑魚(yú)弧菌病的病原菌為弧菌屬鰻弧菌，生產(chǎn)中可適度選用氟苯尼考、強(qiáng)力霉素、復(fù)方新諾明和甲氧芐啶等抗菌藥物進(jìn)行防治。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）