李博勛　陳奕鵬　田維敏　陳珊　黃貴修

摘 要 植物營養(yǎng)儲藏蛋白VSP2是HAD家族蛋白（haloalcanoic acid dehalogenase super family， HAD）的主要成員之一。該蛋白具有酸性磷酸化酶的功能，在橡膠樹氮素儲存和植物凝集素防御脅迫中發(fā)揮著重要的作用。在前期研究中，利用cDNA-AFLP獲得了1條與橡膠樹棒孢霉落葉病抗病性相關(guān)的差異表達片段EST-IAN-24，通過Blast比對分析，發(fā)現(xiàn)該基因片段與其他物種的VSP2基因具有較高同源性。采用PCR和RT-PCR技術(shù)，克隆獲得了一個橡膠樹VSP2基因的cDNA和基因組序列，并將該基因命名為HbVSP2?；蛐蛄蟹治鲲@示，該基因編碼區(qū)全長（CDS）975 bp，含有4個內(nèi)含子和5個外顯子，編碼324個氨基酸，推測該蛋白的分子質(zhì)量為30.01 ku，等電點為4.80。該基因蛋白是HAD家族蛋白中的酸性磷酸酶，具有DXDXT基序特征。qRT-PCR 定量分析發(fā)現(xiàn)，受多主棒孢病菌侵染后，HbVSP2基因在橡膠樹抗、感品種中的表達量存在著明顯的差異，抗病品種（IAN873）的表達量顯著高于感病品種（PR107），且在接種12 h達到了峰值；此外，該基因在水楊酸、茉莉酸甲酯、乙烯的處理下均能誘導(dǎo)其表達，對茉莉酸甲酯的敏感性明顯高于其他2個激素。本研究初步表明，HbVSP2基因可能參與橡膠樹與多主棒孢病菌的互作并且與抗病性相關(guān)。

關(guān)鍵詞 橡膠樹；HbVSP2基因；克??；表達分析

中圖分類號 S794.1 文獻標識碼 A

Abstract VSP， Vegetative storage protein， is one of the main members of haloalcanoic acid dehalogenase super family（HAD）. It has acid phosphatase activity and plays an important role in nitrogen storage and plant lectin defense in rubber tree. In earlier study， we got a differential expression fragment related to Corynespora cassicola resistance in rubber tree with cDNA-amplified fragment length polymorphism（cDNA-AFLP）technology. Blast results showed that this fragment had high homology with VSP2 in other gene species. Using RT-PCR and PCR technology， cDNA and genomic sequences of a rubber tree VSP2 encoding gene OR VSP2 were cloned， and the gene was named as HbVSP2. Sequence analysis revealed that the CDS length of HbVSP2 was 975 bp， encoding a protein of 324 amino acids with molecular weight of 30.01 kD， and pI value of 4.80. Exon/intron structure analysis revealed 5 exons and 4 introns in HbVSP2 genomic sequence. The gene was an acid phosphatase gene，which had the characteristic of DXDXT domain in HAD family protein. The expression pattern of HbVSP2 in rubber plants was assessed by qRT-PCR. The tissue-specific expression analysis indicated that the HbVSP2 was mainly expressed in the stem. When C. cassiicola infected， the expression level of HbVSP2 was significantly higher in the resistant rubber germplasm（IAN873）than in the susceptible rubber germplasm（PR107）. The expression of HbVSP2 was up-regulated under ethylene， salicylic acid and methyl lasmonate treatment， especially methyl jasmonate. These results showed that HbVSP2 involved in rubber tree resistance signal pathway.

Key words Hevea brasiliensis； HbVSP2； Cloning； Expression analysis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.06.010

植物營養(yǎng)儲藏蛋白（Vegetative Storage Proteins， VSPs）是植物營養(yǎng)組織中，氮素和氨基酸臨時儲存的主要形式，對減少植物在越冬期間營養(yǎng)物質(zhì)的損失、生物量的積累以及抵抗不良環(huán)境的能力具有重要作用[1]。相關(guān)研究都充分肯定了植物營養(yǎng)貯藏蛋白質(zhì)（VSPs）在氮素貯藏，植物凝集素積累，以及具有酸性磷酸化酶活性等方面的重要功能[2-4]，而VSP2作為植物防御相關(guān)蛋白的研究較少。VSP2是一種植物防御蛋白，能被多種因素如病蟲侵害、創(chuàng)傷、茉莉酸甲酯等誘導(dǎo)表達，在參與植物抗病信號傳導(dǎo)途徑中的茉莉酸信號途徑中發(fā)揮著重要的作用[5-6]。VSP在分類上屬于HAD家族成員，具有保守的的DXDXT基序[7]。Liu等[8]發(fā)現(xiàn)VSP2能明顯延遲昆蟲的發(fā)育和增加其死亡率，將保守基序DXDXT中親和的Asp119進行點突變成谷氨酸，會導(dǎo)致VSP2酸性磷酸化酶活性完全喪失，同時抗蟲活性也完全喪失。Berger等發(fā)現(xiàn)vsp1和vsp2 mRNA及蛋白的表達能被昆蟲的食草作用誘導(dǎo)[5]。cev1突變體組成型表達VSP1和VSP2，具有更高的抗病性[6]。上述研究揭示了擬南芥中的VSP2可能是一種防御蛋白，其防御功能與酸性磷酸酶的活性有關(guān)。

本研究前期利用cDNA-AFLP技術(shù)篩選到一個與橡膠樹抗棒孢霉落葉病反應(yīng)相關(guān)的基因片段EST-IAN-24，該基因片段與植物抗病相關(guān)的HAD家族蛋白酸性磷酸化酶基因VSP2具有高度的同源性，目前有關(guān)VSP2基因在橡膠樹中的作用機理和表達特性等研究國內(nèi)外尚未見報道。因此，本文對橡膠樹VSP2基因進行克隆，通過qRT-PCR分析該基因的組織表達特性，分析病原菌誘導(dǎo)后在橡膠樹抗病和感病種質(zhì)中的表達差異，以及不同外源激素處理后的表達特性，為揭示VSP2基因在橡膠樹中的作用機理以及橡膠樹分子抗病機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株為本實驗室分離保存的多主棒孢病原菌菌株YN49。供試橡膠樹品種為IAN873和PR107，取自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護研究所橡膠、木薯抗病性育種材料保存基地。瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自Biomiga公司；反轉(zhuǎn)錄第一鏈合成試劑盒Prime ScriptTM RTreafent Kit with gDNA Eraser（RR047A），SYBR Prime ScriptTM RT-PCR Kit（TaKaRa， Code：DRR036A），實時熒光定量試劑盒SYBR Premix Ex TaqTMⅡTli RNaseH Plus（RR820A）均購自TaKaRa公司；RNA plant plus Reagent植物總RNA提取試劑（DP441）購自天根生化科技有限公司。熒光定量PCR分析儀ABI PRISM 7500 Fast Real-Time PCR System。

1.2 方法

1.2.1 DNA和總RNA提取 采用CTAB法對IAN873橡膠葉片的DNA進行提取。參照RNA提取試劑盒說明書，對橡膠葉片，以及不同組織器官根、莖、葉的RNA進行提取。通過1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，在紫外分光光度計下測定其在230 、260、280 nm處的吸光值，確保RNA樣品的純度。反轉(zhuǎn)錄cDNA用18S rRNA基因擴增檢測cDNA第一鏈的合成質(zhì)量。

1.2.2 基因克隆 將差異片段序列在NCBI網(wǎng)站上利用Blastn程序進行同源性比對分析，同時也與中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所提供的橡膠樹品種‘熱研7-33-97基因組序列進行比對，獲得包含該基因片段的大片段序列，將該序列在Softberry（http：//www.softberry.com）上進行目的基因的預(yù)測，選用已知的模式植物全基因組序列，對基因全長進行預(yù)測，獲得VSP2基因的cDNA和基因組序列。根據(jù)預(yù)測結(jié)果，設(shè)計簡并引物HbVSP2-F和HbVSP2-R（表1），以橡膠樹抗病品種（INA873）葉片總DNA 和RNA為模板，采用PCR和RT-PCR方法對基因進行克隆。PCR反應(yīng)體系為 10×PCR buffer（Mg2+plus）2.5 μL，dNTPs（10 mmol/L）1 μL，Taq DNA polymerase（5 U/μL）0.3 μL，上下游引物（10 μmol/L）各1 μL，模板（30 ng）1 μL，加水補足至25 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性3 min； 94 ℃變性30 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸3 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測獲得目的片段經(jīng)凝膠回收純化試劑盒回收連接到pMD18-T載體上送公司測序。

1.2.3 序列分析 利用DNAMAN軟件分析目的基因編碼的氨基酸序列，ProtParam軟件（http：//www.expasy.org/tools/protparam.html）預(yù)測蛋白質(zhì)的相關(guān)信息。同時，下載近源物種的同源基因氨基酸序列，用MEGA version5.0中的NJ（Neighbor-Joining）方法生成系統(tǒng)樹，用Bootstrap對系統(tǒng)樹進行檢驗，1 000次重復(fù)。

1.2.4 表達分析 采用SYBR Green嵌合熒光法進行實時熒光定量PCR擴增反應(yīng)，以組成型表達基因18S rRNA做為內(nèi)參基因，分析HbVSP2基因在橡膠樹抗（IAN873）、感（PR107）葉片受多主棒孢病菌（YN49）和外源激素茉莉酸甲酯（0.2 mmol/L MeJA）、水楊酸（0.5 mmol/LSA）、乙烯（0.1% ET）處理后不同時間段（12、24、48、72 h）的差異表達情況。將反轉(zhuǎn)錄成cDNA的模板稀釋10倍，反應(yīng)體系為20 μL，參照熒光定量試劑盒SYBR Premix Ex TaqTMⅡTli RNaseH Plus（TaKaRa）說明書。反應(yīng)程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，40個循環(huán)后作熔解曲線。每個樣品均重復(fù)3 次，在ABI 7500實時PCR儀上進行，采用2-ΔΔCT法計算分析。2-ΔΔCT=2-[（Ct E-Ct F）-（Ct A-Ct B）]=2（Ct F-Ct B）-（Ct E-Ct A），其中Ct A為處理前待測基因Ct值；Ct B為處理前參照基因Ct值；Ct E為處理后待測基因Ct值；Ct F為處理后參照基因Ct值。表達分析引物為VSP2-QF和VSP2-QR，橡膠樹抗、感品種中的選取為本實驗室前期研究結(jié)果[9]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件包中的單因素方差分析（One-way ANOVA）和Duncan's多重比較進行分析。所有結(jié)果均以平均值±標準誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因的克隆

分別以橡膠樹IAN873的cDNA和DNA作為模板，進行PCR和RT-PCR擴增。擴增產(chǎn)物（圖1）經(jīng)測序和序列分析發(fā)現(xiàn)，該基因全長3 509 bp，基因編碼區(qū)全長975 bp，具有一個完整的開放閱讀框，編碼324個氨基酸，含有4個內(nèi)含子和5個外顯子（圖2），將該基因命名為HbVSP2，其cDNA序列GenBank登錄號：KT361645。

2.2 氨基酸序列分析

ProtParam軟件預(yù)測該蛋白的分子質(zhì)量為30.01 ku，等電點為4.80。Blastp比對發(fā)現(xiàn)，HbVSP2的氨基酸序列與麻風樹（XP_012090492）、蓖麻（XP_002510996）、胡楊（XP_011028463）等酸性磷酸酶的氨基酸序列同源性較高，分別達到了86%、85%、和81%。用InterProScan 工具對HbVSP2基因的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測，并結(jié)合NCBI的結(jié)果對其保守結(jié)構(gòu)域進行分析表明，該基因含有植物磷酸酸化酶的保守結(jié)構(gòu)域，是HAD家族蛋白（haloalcanoic acid dehalogenase super family， HAD）中的酸性磷酸酶（圖3），具有DXDXT基序特征（圖4紅色框標示部分），該結(jié)構(gòu)域是HAD超家族中所共有的保守結(jié)構(gòu)域。橡膠樹HbVSP2的DXDXT基序位于VSP2的中間部位靠近N端（圖4）。

2.3 HbVSP2的系統(tǒng)進化樹分析

將HbVSP2基因的氨基酸序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中的10種植物VSP2基因的氨基酸序列共同構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示，橡膠HbVSP2基因與麻風樹和蓖麻聚在一個大枝上，親緣關(guān)系最近，另外橡膠與同為楊柳科的胡楊，蕓香科的柑橘以及無患子科的龍眼親緣關(guān)系也較近，而與薔薇科的蘋果和梅花，以及梧桐科的可可等親緣關(guān)系較遠（圖5）。

2.4 抗病相關(guān)基因的組成型表達特性

通過組成型表達特性來分析發(fā)現(xiàn)，HbVSP2在莖的表達量最高，其次是葉片，表達量最低的是根部，此外，在古銅期的表達量為最高，其次是老葉，淡綠期葉片中的表達最低（圖6）。說明該基因在橡膠樹中存在著明顯的組織特異性表達。

2.5 病原菌誘導(dǎo)對HbVSP2基因表達的影響

qRT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在多主棒孢病菌（YN49）接種后不同的時間段，與對照相比，HbVSP2基因在抗病品種（IAN873）中的表達量呈極顯著升高（p<0.01）。說明接種病原菌能夠誘導(dǎo)該基因的表達，但抗、感品種的表達模式有所不同，抗?。↖AN873）和感?。≒R107）品種在病原菌接種12 h時表達量均達到峰值，且抗病品種的表達量顯著高于感病品種（p<0.05），之后在抗病品種中的表達量呈緩慢下降的趨勢，至接種72 h時趨于正常；而該基因在感病品種（PR107）24 h時有明顯的下調(diào)，48 h時又有所上升，到72 h時趨于正常，表達模式不如抗病品種中的有規(guī)律（圖7）。總之，HbVSP2基因受多主棒孢病菌（YN49）侵染后，均能誘導(dǎo)其表達，且抗病品種（IAN873）的表達量要顯著高于感病品種（PR107）（p<0.05）。進一步推測該基因可能與橡膠樹和多主棒孢病菌的互作有關(guān)，且在抗病品種中的表達量較高，說明該基因在參與橡膠樹抗病過程中發(fā)揮著一定的作用，但是否與橡膠樹的抗病性相關(guān)，還有待進一步研究。

2.6 不同外源激素處理后的基因表達

抗病品種（IAN873）受茉莉酸甲酯（MeJA）、水楊酸（SA）、乙烯（ET）3種外源激素處理后均能誘導(dǎo)HbVSP2表達量的升高，但茉莉酸甲酯（MeJA）處理下的表達量明顯高于其他2個激素的處理，且在處理后的24 h達到了峰值。而在水楊酸和乙烯處理下的表達量分別在處理后12 h和48 h達到最高，推測該基因在橡膠樹中主要參與茉莉酸介導(dǎo)的信號途徑（圖8）。但不同的外源激素處理之后其表達量有明顯的差異，進一步推測，該基因可能參與橡膠樹抗病信號轉(zhuǎn)到途徑的相關(guān)調(diào)控，且在不同的信號途徑中可能起著不同作用。

3 討論與結(jié)論

項目組前期研究中獲得了一個與HAD家族蛋白酸性磷酸化酶基因VSP2具有高度同源性的差異表達片段DE-TDFs-24，本研究將該序列與中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所提供的橡膠樹品種‘熱研7-33-97基因組序列進行比對，從橡膠樹中克隆得到一個VSP2基因，將其命名為HbVSP2。該基因是HAD超家族VSP蛋白的成員，該蛋白是Utsugi等最先從擬南芥中鑒定出來的[10]。序列分析發(fā)現(xiàn)，該基因的氨基酸序列與麻風樹、蓖麻、胡楊等酸性磷酸酶的氨基酸序列同源性較高，在進化上與麻風樹的親緣關(guān)系最近；此外，該基因含有植物磷酸酸化酶的保守結(jié)構(gòu)域DXDXT基序，該結(jié)構(gòu)域是HAD超家族中所共有的結(jié)構(gòu)特征，位于VSP2的中間位置，該結(jié)構(gòu)域決定了VSP2的空間二級結(jié)構(gòu)。相關(guān)研究表明VSP2除了在氮儲存中發(fā)揮重要作用之外，VSP2還具有不同的酶活性，發(fā)揮著不同的生理功能。Dewald等[11]證明大豆VSPα和VSPβ同型和異型二聚體具有酸性磷酸酶活性，RuBP羧化酶存在于葉綠體基質(zhì)中，參與植物光合作用的碳同化。

本研究中HbVSP2受多主棒孢病菌侵染后能誘導(dǎo)其表達量的升高，且抗病品種（IAN873）的表達量明顯的高于感病品種（PR107），初步說明該基因在橡膠樹與病原菌之間互作過程中發(fā)揮作用。而Berger S等（2002）發(fā)現(xiàn)vsp1和vsp2 mRNA及蛋白的表達能被昆蟲的食草作用誘導(dǎo)，同時用擬南芥fad-3-2，fad7-2，fad8的三突變體來破壞vsp2和其他創(chuàng)傷誘導(dǎo)基因的表達，發(fā)現(xiàn)植株對昆蟲的侵食變得非常敏感[5]。而乙烯不敏感突變體（ein2， ein3， etr1）具有更高的抗蟲性，同時顯示出擬南芥VSP積累增加[12-13]，cev1突變組成型表達VSP1和VSP2，具有更高的抗病性[6]。本研究還發(fā)現(xiàn)，源激素茉莉酸甲酯（MeJA）、水楊酸（SA）、乙烯（ET）處理后也均能誘導(dǎo)VSP2表達量的升高，茉莉酸甲酯（MeJA）處理下的表達量明顯的高于其他2個激素的處理，推測該基因可能參與植物抗病信號傳導(dǎo)途徑，并且在不同的抗病信號途徑中所起到的作用可能不同。Corné等[14]研究證實，VSP2是茉莉酸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑下游的重要調(diào)控因子，且與病原菌發(fā)生互作，本研究中茉莉酸甲酯處理和水楊酸結(jié)果與病原菌誘導(dǎo)結(jié)果較為一致，從而進一步佐證了該基因在橡膠樹與病原菌互作過程中發(fā)揮作用。

上述研究表明，HbVSP2在橡膠樹和病原菌互作過程中發(fā)揮著一定的作用，并且在橡膠樹抗病品種和感病品種中的表達存在明顯的差異，但是是否與橡膠樹抗病性相關(guān)還需要對其功能和所參與的信號途徑進行深入的研究。同時本研究還發(fā)現(xiàn)該基因在橡膠樹中具有組成型表達的特性發(fā)現(xiàn)其在橡膠樹根、莖、葉以及古銅、淡綠和老葉中的表達特性均存在一定的差異，這是否與其參與調(diào)控抵御病原菌的作用有關(guān)還有待進一步的證實。

致 謝 感謝中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所、農(nóng)業(yè)部橡膠樹生物學(xué)與遺傳資源利用重點實驗室對本研究的支持。感謝中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所、膠乳代謝課題組唐朝榮研究員在HbVSP2基因序列的比對和基因數(shù)據(jù)的提供方面給予的支持。

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