趙方方　羅金輝　謝德芳　呂岱竹

摘 要 為建立烯啶蟲胺（nitenpyram，NIT）殘留免疫分析方法，通過合成烯啶蟲胺新型半抗原并進(jìn)行紫外和質(zhì)譜等技術(shù)的分析確證，分別將半抗原與牛血清蛋白（BSA）和卵清蛋白（OVA）偶聯(lián)成完全的免疫抗原和包被抗原。免疫小鼠后測定抗血清的效價，隨著免疫次數(shù)的增加先逐漸升高后再逐漸降低，最高達(dá)到1 ∶ 16 000。選取抗血清效價最高的小鼠，用間接競爭ELISA法測定其靈敏度，其半抑制濃度（IC50）較低，為1.68 μg/mL，競爭效果明顯。將建立的檢測方法與液相色譜方法進(jìn)行比較，雖線性范圍和靈敏度較液相色譜方法稍低，但回收率均≥80%，無明顯差異，具有明顯的識別效應(yīng)，為烯啶蟲胺高靈敏的單克隆抗體制備及殘留免疫分析奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 烯啶蟲胺；新型半抗原；合成；免疫效果

中圖分類號 TQ450.2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

Abstract A new type of nitenpyram hapten was analyzed and confirmed after being synthesized by UV spectrum and mass spetrum in order to establish a method for the analysis of the residues of nitenpyram（NIT）. And the NIT hapten was then coupled with BSA and OVA to prepare immunogen （NIT-BSA） and coating antigen （NIT-OVA）. The titer of the antiserum was determined by immune mice， and the titer increased and then reduced gradually with the increase of the number of times. The maximum reached 1 ∶ 16 000. The mice with the highest titer were selected， and the sensitivity was determined by indirect competitive ELISA method. The IC50 was 1.68 μg/mL， the semi inhibition concentration was low and the competition effect was obvious. Compared with the method of liquid chromatography， the linearity range and sensitivity are slightly lower than that of liquid chromatography. The two recovery rates were more than 80% without obvious difference which showed obvious recognition effect. This study laid a foundation for the preparation of monoclonal antibodies that has the high sensitivity and the immunoassay.

Key words Nitenpyram；New type of hapten；Synthesis；Immune effect

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.07.024

烯啶蟲胺是日本繼吡蟲啉、啶蟲脒之后開發(fā)的又一種新煙堿類農(nóng)藥，具有較強的內(nèi)吸性和滲透性，對于飛虱、蚜蟲、粉虱等刺吸式口器害蟲具有較強的滅殺效果，廣泛應(yīng)用于水果、蔬菜、水稻等作物害蟲的防治，現(xiàn)已成為有機(jī)磷、有機(jī)氯等高毒農(nóng)藥及產(chǎn)生抗性的擬除蟲菊 酯類等農(nóng)藥的優(yōu)秀替代品種[1-4]。然而該藥在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中廣泛、大量的使用，同時因其強大的內(nèi)吸和滲透作用，很容易造成果蔬等生鮮食用的作物中殘留超標(biāo)，嚴(yán)重威脅消費者的身體健康[5-6]。因此，加強對上市果蔬中烯啶蟲胺殘留檢測十分必要。

文獻(xiàn)報道的烯啶蟲胺檢測方法主要有液相色譜[7-9]、氣相色譜[10]、色譜質(zhì)譜聯(lián)用等方法[11-12]。而針對果蔬等貨架期較短的產(chǎn)品，這些方法普遍存在時間久、費用高、操作復(fù)雜等不適用性，因此，建立快速、靈敏、廉價的免疫檢測方法對于此類產(chǎn)品具有重要意義[13-15]。彭方毅等[15]建立了定量測定吡蟲啉的間接競爭ELISA方法；李廣領(lǐng)等[13]建立了噻蟲嗪殘留酶聯(lián)免疫吸附的檢測方法，線性范圍良好，檢出限達(dá)到0.001 mg/L。而目前針對烯啶蟲胺建立的殘留免疫分析方法只有王俊平等[16]在烯啶蟲胺分子芳環(huán)上添加連接臂連接載體蛋白進(jìn)行免疫。本研究將煙堿類農(nóng)藥的特征性芳環(huán)結(jié)構(gòu)進(jìn)行暴露，對烯啶蟲胺分子結(jié)構(gòu)的化學(xué)修飾，從遠(yuǎn)芳環(huán)端進(jìn)行修飾，再與大分子載體共價偶聯(lián)制備其完全抗原，通過免疫實驗動物產(chǎn)生針對烯啶蟲胺的特異性抗體，為烯啶蟲胺殘留免疫分析奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與耗材 烯啶蟲胺（98%）購自武漢康泰寶精細(xì)化工公司；牛血清白蛋白（BSA）、卵清蛋白（OVA）、羥基琥珀酰亞胺（NHS）、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC-HCl），弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑均購自sigma公司；其他試劑購自國藥公司，水為實驗室制備超純水

1.1.2 儀器設(shè)備 酶標(biāo)儀（ELx800，Biotek公司）、超純水系統(tǒng)（ULUP-IV-20T，成都超純科技有限公司）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（R-3，Buchi公司）、洗板機(jī)（Elx50，Biotek公司）、電泳儀（PowerPac，bio-rad公司）、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（API4000，AB SCIEX公司）

1.2 方法

1.2.1 半抗原的合成 稱取5.26 g（19 mmol）烯啶蟲胺（98%）置于三口瓶中，加適量無水乙醇溶解后，在70 ℃恒溫通入氮氣，加入二水合氯化亞錫21.44 g，加入無水乙醇使氯化亞錫完全溶解，通氮氣15 min后密封，持續(xù)通入冷凝水，磁力攪拌反應(yīng)2 h后揮干乙醇，加入碳酸鈉溶液（6.00 g碳酸鈉溶于40 mL水），使混合液pH=8-9，劇烈振搖后靜置過濾，用乙酸乙酯萃取上清3次，無水硫酸鈉干燥過夜后蒸干，用硅膠柱凈化后得到4.08 g淺黃色膠狀物質(zhì)，產(chǎn)率為89.2%，Rf=0.329（乙酸乙酯∶石油醚=1 ∶ 3），反應(yīng)線路見圖1。

1.2.2 完全人工抗原的合成 稱取400 mg BSA（合成免疫原）或OVA（合成包被原），溶于3 mL pH=5的PBS溶液中，加入2 g EDC，攪拌使其完全溶解活化20 min，然后加入0.20 g NHS攪拌反應(yīng)30 min。稱取200 mg半抗原溶于少量DMF中，并滴入上述蛋白活化液中，邊滴邊攪拌，反應(yīng)過夜。將反應(yīng)液裝入透析袋中于4度下透析，透析液為PBS緩沖液，每6～10 h換一次透析液，透析72 h后將反應(yīng)液定容，反應(yīng)線路見圖2。

1.2.3 抗原濃度的測定 根據(jù)蛋白溶液光密度值測定抗原濃度[17]，測定波長為280 nm和260 nm抗原溶液的OD值，按照公式：蛋白濃度（mg/mL）=1.45×OD280-0.74×OD260，計算抗原濃度。

1.2.4 免疫試驗 將免疫原對小鼠按照表1所示流程進(jìn)行免疫。

1.2.5 抗血清多克隆抗體的應(yīng)用 包被不同濃度梯度抗原，使用上述小鼠的抗血清進(jìn)行梯度稀釋，使用十字交叉法進(jìn)行抗原和抗體濃度的優(yōu)化，建立間接競爭ELISA方法。確定烯啶蟲胺最大吸收波長，優(yōu)化流動相組成及配比，建立烯啶蟲胺液相色譜檢測方法。液相色譜采用紫外檢測器，波長為272 nm，甲醇 ∶ 水=15 ∶ 85為流動相，進(jìn)行檢測。分別建立2種方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線，前處理按照標(biāo)準(zhǔn)[18]進(jìn)行；同時進(jìn)行2種方法的樣品加標(biāo)回收試驗（濃度為0.10 μg/g），并進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 半抗原的合成鑒定

半抗原合成反應(yīng)進(jìn)行時用TLC監(jiān)測，反應(yīng)結(jié)束時，在紫外燈下觀察唯一吸收點（Rf=0.32），比原料點（Rf=0.75）小，說明極性比烯啶蟲胺大，與理論分析結(jié)果一致。

對半抗原進(jìn)行核磁共振（氫譜）分析，1H-NMR（600 M，CDCl3，TMS），δ：4.63（s，1H，CHN）；1.88～2.12（t，1H，NH）；2.35～2.53（d，3H，CH3）；2.33～2.63（m，2H，CH2CH3）；0.88～1.12（t，3H，CH2CH3）；3.83（s，1H，CHN）；7.75～9.06（m，3H，CH）；所得數(shù)據(jù)與氫原子位移的理論分析結(jié)果一致。

質(zhì)譜結(jié)果見圖3，其中準(zhǔn)分子離子峰（[M-H]-=239.26）豐度最大，與目標(biāo)產(chǎn)物的分子量一致，且存在Cl元素的同位素峰；從分子結(jié)構(gòu)分析，在電離時能量較低的2個雙鍵C原子與N原子成鍵能量較低且容易斷裂，脫掉-NH-CH3、-NH2成鍵斷裂后形成新的離子，理論分子量為195，與質(zhì)譜圖中195.24峰吻合，說明半抗原合成成功。

2.2 抗原的鑒定

將透析后的人工抗原離心后除去變性及自身結(jié)合的蛋白質(zhì)分子，采用電泳進(jìn)行完全抗原的鑒定，結(jié)果見圖4，與半抗原反應(yīng)以后的載體蛋白質(zhì)（BSA、OVA）均比載體蛋白在電場中的位移要小，說明載體蛋白結(jié)合了其他物質(zhì)，導(dǎo)致分子量增大，而且根據(jù)電場力公式及加速度公式有S=F/2m×t2，說明在電泳時間相同的情況下，位移跟質(zhì)量成正比，說明不是蛋白質(zhì)之間的結(jié)合而是蛋白質(zhì)結(jié)合了小分子量的半抗原。

2.3 抗原濃度

抗原溶液的OD值見表2，經(jīng)過計算，得出免疫原的濃度為0.163 mg/mL，包被原的濃度為0.168 mg/mL。

2.4 抗血清效價

從第2次開始，每次免疫后1周對小鼠斷尾取血，間接ELISA法測定抗血清效價，結(jié)果見圖5，隨著免疫次數(shù)的增加，效價逐漸增加至最大值，然后開始出現(xiàn)下降，1號小鼠效價最高達(dá)1 ∶ 16 000。

2.5 免疫效果

選取抗血清效價較高的1號小鼠，間接競爭ELISA法測定其抗血清中多克隆抗體的靈敏度，其IC50為1.68 μg/mL（圖6），免疫效果明顯，直接證明了半抗原及完全抗原的合成成功。

2.6 抗血清的應(yīng)用

選擇十字交叉法中OD值為1所對應(yīng)的抗原和抗體濃度建立間接ELISA法，其中包被抗原濃度為0.2 μg/g，抗血清進(jìn)行1 ∶ 8 000倍稀釋，將結(jié)果與所建立的液相方法進(jìn)行比較，其標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品加標(biāo)回收結(jié)果見表3。2種方法回收率均位于80%～90%，均為較佳結(jié)果且無明顯差異，但ELISA方法的線性范圍較窄為0.72～3.30 μg/mL，對比之下液相色譜法線性范圍較寬，為0.025～5.00 μg/mL。因此，所建立的ELISA方法適宜測量的樣品濃度范圍小。此外，ELISA檢測限也較液相色譜法高，說明多克隆抗體直接應(yīng)用于樣品的檢測還存在一定的局限性。但本研究為高質(zhì)量的單克隆抗體的研制提供了較好的預(yù)期。

3 討論與結(jié)論

目前，普遍的烯啶蟲胺殘留檢測主要采用色譜、色譜質(zhì)譜聯(lián)用等儀器檢測法。然而這些方法普遍存在著分析時間久、費用高、操作專業(yè)等缺點。相對于這些缺點，免疫檢測具有速度快、價格低廉、操作簡單等優(yōu)點，對烯啶蟲胺這種水溶性大的農(nóng)藥尤其適用。

王俊平等[16]報道的烯啶蟲胺的半抗原是從新煙堿農(nóng)藥的特征結(jié)構(gòu)-芳香環(huán)處進(jìn)行修飾，添加連接臂，與其不同的是本研究針對此特征性芳環(huán)結(jié)構(gòu)，設(shè)計了新型的半抗原，并通過對烯啶蟲胺分子進(jìn)行改造，在遠(yuǎn)離芳環(huán)端改造基團(tuán)，成功合成了能夠暴露其特征結(jié)構(gòu)的烯啶蟲胺半抗原，與從頭合成相比，最大程度的保留了烯啶蟲胺的原有特征，以確保動物機(jī)體對烯啶蟲胺或新煙堿類農(nóng)藥的識別程度，以獲得靈敏度較高的多克隆抗血清。

與彭方毅等[15]、王俊平等[16]、李廣領(lǐng)等[19]所做的新煙堿類農(nóng)藥單克隆抗體進(jìn)行比較，本研究所制備的多克隆抗血清的靈敏度與其還存在一定差距，這是由于初步免疫時，抗原組分復(fù)雜，產(chǎn)生的多克隆抗體的抗原識別位點較多，導(dǎo)致非特異性較強，靈敏度較差，是多克隆抗體的特性所決定的。通常此類研究都是從靈敏度和特異性相對較強的多克隆抗體入手，進(jìn)行進(jìn)一步的篩選、馴化，以得到靈敏度和特異性較高的單克隆抗體。與液相色譜法相比，通過該多克隆抗體建立的檢測方法回收率較好，無明顯差異，但線性范圍比液相色譜法小，檢測靈敏度較低，說明多克隆抗體直接應(yīng)用于樣品的檢測還存在一定的局限性，但其為高質(zhì)量的單克隆抗體的研制提供了較好的預(yù)期。

本研究初步驗證了該新型抗原具有較好的免疫原性和反應(yīng)原性，為烯啶蟲胺高靈敏度或高通用性新煙堿類單克隆抗體的研制做了前期研究，也奠定了較為良好的基礎(chǔ)，以期能夠研制出高靈敏度或高通用性的單克隆抗體。

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