桂意云 汪淼 秦翠鮮 陳忠良 廖青 李楊瑞 黃東亮

摘要：【目的】通過時空表達特性分析，初步推測甘蔗各家族蔗糖磷酸合成酶（SPS）基因在甘蔗蔗糖積累途徑中的功能，為研究甘蔗各家族SPS基因的生物學功能奠定基礎。【方法】采用熒光定量PCR分析甘蔗4個家族SPS基因在高、中、低糖甘蔗品種未成熟葉片、成熟葉片和莖中的時空表達特性?！窘Y果】在甘蔗伸長期、蔗糖積累前期和蔗糖積累后期，SofSPSDⅢ基因在所有甘蔗品種的未成熟葉片、成熟葉片和莖中均高水平穩(wěn)定表達，相對表達量在5.3～8.1； SofSPSB基因在成熟葉片中幾乎不表達，而以莖中表達量最高。在伸長期，SofSPSC和SofSPSA基因表達較強，相對表達量分別為7.3～14.2和1.5～4.4；在蔗糖積累前期，SofSPSC基因表達稍有降低，但仍處于較高水平，相對表達量達為4.6～8.9，而SofSPSA基因表達加強，相對表達量達3.8～6.9；在蔗糖積累后期，SofSPSC基因在成熟葉片中的表達量比蔗糖積累前期下降4.0～7.2倍，且均比未成熟葉和莖中下降約6.0倍，而SofSPSA基因在不同組織中的表達量比蔗糖積累前期下降1.8～5.7倍。各家族SPS基因在不同糖分甘蔗品種間的表達趨勢一致?！窘Y論】甘蔗D家族SPS基因維持甘蔗蔗糖合成的基本功能，通過調控C、A家族SPS基因的表達來調控蔗糖合成的強度，B家族SPS基因不參與甘蔗源葉中蔗糖合成而參與蔗糖的積累與利用。

關鍵詞： 甘蔗；蔗糖磷酸合成酶；蔗糖積累；表達特性

中圖分類號： S566.1 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）02-0174-06

0 引言

【研究意義】甘蔗是全球第一大糖料作物和重要的能源作物，也是我國種植面積最大的熱帶作物。作為我國最重要的糖料作物，蔗糖產(chǎn)量約占全國食糖總產(chǎn)量的90%，其中廣西占65%以上。當前我國甘蔗單產(chǎn)60 t/ha、蔗糖分13.7%，與先進國家的80～110 t/ha和15%蔗糖分相比仍有差距。甘蔗是高生物量作物，為異源多倍和非整倍體植物，遺傳背景復雜，常規(guī)遺傳學手段難以闡明其遺傳規(guī)律，限制了甘蔗糖分性狀的進一步改良（李楊瑞，2010）。蔗糖磷酸合成酶（SPS）是植物體內控制蔗糖合成的關鍵酶（Huber and Huber， 1996），植物體內蔗糖的積累與SPS活性呈正相關（Grof et al.， 2007）；此外，SPS還參與植物的生長和產(chǎn)量形成（Park et al.， 2008； Tian et al.， 2010），并在植物抗逆過程中發(fā)揮重要作用（Abdel-latif， 2007； 黃東亮等，2012）。因此，闡明甘蔗SPS基因的生物學功能，對從分子水平上調控SPS基因的表達，改良甘蔗品種具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】Langenkamper等（2002）對高等植物基因組和已知的SPS基因進行生物信息學分析，并將SPS基因分為A、B、C 3個家族；Castleden等（2004）分析單子葉植物的SPS基因，認為單子葉禾本科植物中的SPS基因可分為A、B、C和D 4個家族，D家族又可分為DШ和DⅣ兩個亞家族（Castleden et al.， 2004； Lutfiyya et al.， 2007）。各種植物不同家族的SPS基因表達特性各異，其所發(fā)揮的功能也不同（Reimholz et al.， 1997）。柑橘A家族的CitSPS1基因在整個發(fā)育期的果實中均表達，且在成熟期達到最高；B家族的CitSPS2在果實發(fā)育前期（花后187 d）的可食組織中不表達，但在成熟期（花后223 d）表達量達到最高；而C家族的CitSPS3在整個果實發(fā)育期的可食組織中均沒有轉錄，推測CitSPS1和CitSPS2在柑橘果實蔗糖的合成或積累方面起重要作用（Komatsu et al.， 1999）。煙草C家族NtSPSC基因只在成熟的源葉中表達，結合RNA干擾技術推測NtSPSC參與非光照條件下淀粉的運輸，用于合成蔗糖（Chen et al.， 2005）?！颈狙芯壳腥朦c】甘蔗是高光合效率C4作物，其蔗糖含量在所有植物中最高，表明其控制蔗糖合成的關鍵酶SPS的作用效率極高效。甘蔗是單子葉禾本科植物，所以甘蔗基因組中至少具有4個不同家族的SPS基因，但迄今鮮見有關甘蔗SPS基因家族功能的研究報道?！緮M解決的關鍵問題】分析甘蔗不同家族SPS基因在高、中、低糖甘蔗品種不同組織中的時空表達特性，初步推測甘蔗各家族SPS基因的生物學功能，為進一步闡明甘蔗各家族SPS基因的功能，并通過分子手段調控SPS基因的表達以培育甘蔗高糖品種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試甘蔗材料分為3個類型，分別包括3個高糖品種（蔗糖分15%～17%）桂糖35號（GT35）、桂糖28號（GT28）和新臺糖22號（ROC22），1個中糖品種（蔗糖分12.6%）粵糖71-210（YT71-210），1個低糖品種（蔗糖分6.0%）閩糖86-877（MT86-877）。分別于甘蔗伸長期（7月）、蔗糖積累前期（10月）和蔗糖積累后期（12月）取未成熟葉（未伸展葉，Im leaf）、成熟葉（+2葉，+2 leaf）和莖（+6節(jié)，+6 stalk）等樣品，清洗擦干后取50～100 mg在液氮中研磨成粉末，用于分析。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 RNA樣品制備 用Spin Column Plant total RNA Purification Kit[生工生物工程（上海）股份有限公司]試劑盒提取每個樣品的RNA，用RQ1 RNase-Free DNase（Promega， USA）除去RNA樣品中的DNA。以1.5%瓊脂糖凝膠于1×TAE緩沖液電泳檢測RNA完整性，用ND-2000C微量紫外可見分光光度計（美國Thermo）檢測RNA濃度。

1. 2. 2 cDNA第一鏈合成 將提取的RNA以AMV Reverse Transcriptase First Strand cDNA Synthesis Kit[生工生物工程（上海）股份有限公司]反轉錄合成第一鏈cDNA。反應體系及程序：在0.2 mL PCR管中加入5.0 μL總RNA、1.0 μL Random Primer（0.2 g/μL）、5.0 μL Rnase-free ddH2O， 70 ℃溫浴5 min， 冰浴10 s，離心后加入4.0 μL 5×Reaction Buffer、2.0 μL dNTP Mix（10 mmol/L）、1.0 μL Rnase inhibitor（20 U/L）、2.0 μL AMV Reverse Transcriptase（10 U/L），總體積為20.0 μL；于37 ℃溫浴5 min，42 ℃溫浴60 min，最后70 ℃溫浴10 min終止反應，將上述溶液于-20 ℃保存。

1. 2. 3 實時熒光定量PCR 以甘蔗甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）基因（EF189713）為內參基因。根據(jù)基因SofSPSA（HM854011）（黃東亮等，2011）、SofSPSB（JN584485）（黃東亮等，2013）、SPSC（CA068686）（Grof et al.， 2006）和SofSPSDⅢ（HQ117935）（汪淼等，2014）的序列設計定量PCR引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。內參基因引物：S-GAPDH-F（5'-CTTGCCAAGGTCA

將cDNA樣品稀釋8倍作為模板，利用熒光定量PCR試劑（2×ABI SybrGreen PCR Master Mix）在ABI STEPONE PLUS型熒光定量PCR儀上檢測不同基因的相對表達量。PCR反應體系：2×SybrGreen qPCR Master Mix 10.0 μL，10 μmol/L上、下游引物各1.0 μL，cDNA第一鏈模板2.0 μL，加6.0 μL ddH2O至總體積20.0 μL。擴增程序： 95 ℃預變性2 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 40 s，進行40個循環(huán)。

2 結果與分析

2. 1 SofSPSDⅢ基因在不同甘蔗品種中的表達特性

通過熒光定量PCR技術檢測甘蔗各家族SPS基因在高、中、低糖甘蔗品種不同組織中的時空表達特性，結果表明，在甘蔗伸長期、蔗糖積累前期和蔗糖積累后期，SofSPSDⅢ基因在所有品種中的平均表達量幾乎均表現(xiàn)為莖>未成熟葉>成熟葉，且均表現(xiàn)為高水平穩(wěn)定表達，在不同蔗糖分品種同一部位的表達量沒有明顯差異，相對表達量在5.3～8.1（圖1），其中以蔗糖積累后期表達量更高，其次為伸長期，表明SofSPSDⅢ基因組成型表達，維持甘蔗蔗糖合成的穩(wěn)定進行。

2. 2 SofSPSA和SofSPSC基因在不同甘蔗品種中的表達特性

在伸長期（7月），甘蔗需要較多的光合產(chǎn)物用于生長發(fā)育，各種酶的活性較強，SofSPSA和SofSPSC基因表達也較強；SofSPSA基因相對表達量在1.5～4.4，而SofSPSC基因相對表達量更高，達7.3～14.2。到了蔗糖積累前期（9月），SofSPSC基因表達量稍有降低，但仍處于較高水平，為4.6～8.9；而SofSPSA基因表達量不斷加強，達3.8～6.9，使甘蔗蔗糖合成酶的活性處于較高水平。到了蔗糖積累后期（12月），SofSPSC基因在成熟葉片中的表達量明顯比蔗糖積累前期下降4.0～7.2倍，比未成熟葉和莖中的表達量下降約6.0倍；而SofSPSA基因在不同組織中的表達量比蔗糖積累前期下降1.8～5.7倍，可能是因為此時甘蔗蔗糖的合成需求下降，不需要太強的SPS活性（圖2）。

在所有不同蔗糖分甘蔗品種中，SofSPSC基因在伸長期和蔗糖積累后期均以成熟葉表達量最低，而在莖和未成熟葉中表達量相當。在蔗糖積累前期，SofSPSC基因在不同部位的表達量差異不明顯，在MT86-877和YT71-210中均以未成熟葉最高，其次為成熟葉和莖（圖2）。在不同時期，SofSPSA基因在所有蔗糖分甘蔗品種中的表達量均表現(xiàn)為成熟葉>未成熟葉>莖（圖2）。

2. 3 SofSPSB基因在不同甘蔗品種中的表達特性

成熟葉片是甘蔗進行光合作用、合成蔗糖的源頭。在甘蔗伸長期、蔗糖積累前期和蔗糖積累后期，SofSPSB基因在所有品種的未成熟葉片和莖中表達量較高，尤其以莖中表達量最高，而在成熟葉片中均幾乎不表達（圖3），表明SofSPSB基因不參與甘蔗成熟葉片中蔗糖的合成，而參與蔗糖的積累與利用。

2. 4 不同SPS基因在不同蔗糖分甘蔗品種間的表達趨勢

SofSPSDⅢ基因在低糖（MT86-877）、中糖（YT71- 210）和高糖（GT35， GT28和ROC22）品種中的表達表現(xiàn)為：在伸長期和蔗糖積累前期幾乎均為莖>未成熟葉>成熟葉，而在蔗糖積累后期幾乎均為未成熟葉>莖>成熟葉，且在不同蔗糖分甘蔗品種同一部位的表達量無明顯差異（圖1）。SofSPSC基因在不同蔗糖分品種甘蔗中的表達，伸長期和蔗糖積累后期均為成熟葉表達量最低，而莖和未成熟葉中表達量相當；在蔗糖積累前期，其在不同部位的表達量差異不明顯，也無明顯規(guī)律性（圖2）。在不同取樣時期，SofSPSA基因在不同蔗糖分甘蔗品種中的表達表現(xiàn)均為成熟葉>未成熟葉>莖（圖2），而SofSPSB基因的表達表現(xiàn)均為莖>未成熟葉>成熟葉（圖3）。說明甘蔗各家族SPS基因在低糖（MT86-877）、中糖（YT71-210）和高糖（GT35、 GT28和ROC22）品種的各組織中的表達變化趨勢是一致，表明各家族SPS基因在各種糖分甘蔗品種間的表達特性無明顯差異。

3 討論

SPS基因首先在玉米中被成功克隆（Worrell et al.， 1991），隨后在菠菜（Klein et al.， 1993）、甜菜（Hesse et al.， 1995）、柑桔（Komatsu et al.， 1996）、蠶豆（Heim et al.， 1996）、水稻（Valdez-Alarcón et al.， 1996）、甘蔗（Sugiharto et al.， 1997； 何文錦等，2007）、文心蘭（Li et al.， 2003）和甜瓜（于喜艷等，2007）中相繼克隆了SPS基因。進化分析結果表明，植物SPS可分為A、B、C、D 4個家族，而D家族又進一步分為DШ和DⅣ亞家族（Langenkamper et al.， 2002； Castleden et al.， 2004； Lutfiyya et al.， 2007）。在前期研究中，本課題組從NCBI數(shù)據(jù)庫中共獲得植物SPS序列77條，其中全長序列43條（黃東亮等，2012）。迄今為止，D家族僅獲得5個全長序列的基因，其中，TaSPS9（AF534907）與Castleden等（2004）報道的wheat9為同一基因，被分在DⅢ家族，而SofSPSⅢ（BAA19242）與Lutfiyya等（2007）報道的SofSPS1F（gi854378）為同一基因，也被分在DIII家族。從進化樹上看，這5個基因未被進一步分類，所以均為DIII家族SPS基因。因此，根據(jù)這5個基因序列克隆獲得的D家族SPS基因也為DIII家族，故命名為SofSPSDⅢ（HQ117935）（汪淼等，2014）。由于沒有參考序列，本研究沒有分析甘蔗DⅣ家族SPS基因的表達特性。

不同植物各家族SPS基因的表達特性不同，它們所發(fā)揮的功能也不同（Reimholz et al.， 1997）。水稻OsSPS1基因主要在葉肉細胞、萌發(fā)芽胚盾片細胞和未成熟的花粉中表達（Chávez-Bárcenas et al.， 2000）。玉米ZmSPS1、ZmSPS6和ZmSPS7在葉片中表達量很高，而ZmSPS2在葉片和花粉中表達量均很高；ZmSPS3、ZmSPS4和ZmSPS5在各種組織中均低量組成型表達，表明它們負責維持各種組織基本的蔗糖需求（Lutfiyya et al.， 2007）。本研究發(fā)現(xiàn)，SofSPSDⅢ基因在所有甘蔗品種的未成熟葉片、成熟葉片和莖中均高水平穩(wěn)定表達，與Grof等（2007）的研究結果一致。此外，Grof等（2007）的研究結果表明，D家族SPS基因（D1和D2）在各種組織中均高水平穩(wěn)定表達，說明甘蔗D家族基因組成型表達，行使甘蔗蔗糖合成的基本功能。在本研究中，SofSPSC和SofSPSA在甘蔗伸長期均表達較強；到了蔗糖積累前期，SofSPSC基因表達稍有降低，但仍處于較高水平，而SofSPSA基因表達加強，可使甘蔗蔗糖合成酶的活性仍處于較高水平；但到了甘蔗積累后期，SofSPSC和SofSPSA基因在成熟葉片中的表達明顯下降，表明甘蔗此時蔗糖的合成需求下降，不需要太強的SPS活性。因此，甘蔗通過調控SPSC和SPSA基因的表達而調控蔗糖的合成強度。

本研究還表明，甘蔗SofSPSB基因在3個時期所有品種的成熟葉片中表達均極低，與用成熟葉與未成熟葉混合樣品分析的結果相似（未發(fā)表結果）；但Grof等（2007）認為，甘蔗B家族SPS基因在未成熟葉和成熟葉中均高量表達。由于成熟葉片是甘蔗蔗糖積累的源頭，因此推測SofSPSB基因不參與甘蔗源葉中蔗糖的合成而主要參與蔗糖的積累與利用。在本研究中，甘蔗各家族SPS基因在低、中、高糖品種的未成熟葉（心葉）、成熟葉（+2葉）及莖中的表達變化趨勢一致，表明各家族SPS基因在不同蔗糖分甘蔗品種間的表達特性相似，與Grof等（2006）的研究結果一致，即甘蔗各家族SPS基因在高糖基因型（I-H2）和低糖基因型（I-L2）的葉片和節(jié)間的表達特性沒有差異，因此認為SPS的活性是受轉錄后調控。但是，甘蔗各家族SPS基因具體的生物學功能仍需進一步通過過量表達和基因沉默等手段研究闡明。

4 結論

本研究結果表明，甘蔗通過D家族SPS基因維持甘蔗蔗糖合成的基本功能，通過調控C和A家族SPS基因的表達來調控蔗糖合成的強度，B家族基因不參與甘蔗源葉中蔗糖的合成而主要參與甘蔗蔗糖的積累與利用。

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（責任編輯 韋莉萍）