李小婷 王丹 龐玉新 楊全 范佐旺 馬青松 許羅鳳

摘 要 觀察艾納香油對(duì)UVB照射后Blab/C小鼠曬傷皮膚氧化應(yīng)激及DNA損傷的影響。通過(guò)建立4組小鼠曬傷模型，在5個(gè)不同時(shí)間相點(diǎn)測(cè)定小鼠皮膚曬傷組織厚度和含水量，利用可見(jiàn)光分光光度法測(cè)各組皮膚組織中超氧化物岐化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、還原型谷胱甘肽（GSH）和8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷（8-OHdG）的含量。結(jié)果表明：艾納香油可明顯加快曬傷創(chuàng)面處結(jié)痂脫落，抑制曬傷皮膚組織增厚（P<0.05），減少曬傷組織皮膚含水量的喪失（P<0.05，P<0.01）；在整個(gè)治療過(guò)程，能明顯提高小鼠血清SOD活性（P<0.05，P<0.01），降低皮膚MDA含量（P<0.05），升高皮膚GSH的水平（P<0.05），降低皮膚8-OHdG含量（P<0.01）。艾納香油可抵抗UVB曬傷后小鼠表皮增厚，減少光產(chǎn)物表達(dá)，并通過(guò)清除氧自由基，提高抗氧化酶活性而發(fā)揮抗氧化作用。

關(guān)鍵詞 艾納香油 ；中波紫外線 ；抗氧化

分類(lèi)號(hào) R284.1 ；S567.23+9 Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2016.02.012

Effects of Blumea Balsamifera Oil on Oxidative Stree

and DNA Damages in a Model of Skin Sunburn in Mice

LI Xiaoting1，2，3） WANG Dan2，3） PANG Yuxin22，3）

YANG Quan1） FAN Zuowang1，2，3） MA Qingsong1，2，3） XU Luofeng1，2，3）

（1 School of Traditional Chinese Medicine， Guangdong Pharmaceutical University，

Guangzhou， Guangdong 510006， China；

2 Tropical crops Genetic Resources Institute， CATAS， Danzhou， Hainan 571737， China；

3 Hainan Provincial Engineering Research Center for Blumea Balsamifera，

Danzhou， Hainan 571737， China）

Abstract To evaluate the protective effect of Blumea balsamifera oil on UVB irradiation-induced skin sunburn in Blab/C mice. The sunburn mouse models were established by UVB irradiation. The mice were randomly divided into four groups. The skin erythema and edema were assessed. The thickness of epidermis and the water content of tissues were determined and the levels of superoxide dismutase （SOD）， malondialdehyde （MDA），glutathione （GSH）， 8-Hydroxy-desoxyguanosine in its epidermis were measured with visible spectrophotometry methods at 5 different time points. Results： The skin loss of Blumea balsamifera oil group was accelerated. The topical application of Blumea balsamifera oil resulted in a significant decreasing in UVB-induced increases in skin thickness. Further more， Blumea balsamifera oil treatments also resulted in a significant increasing the level of SOD and GSH， decreasing the loss of skin water content and MDA， especially depressing in UVB mediated generation of 8-OHdG. We suggest that Blumea balsamifera oil could be developed as an agent for the management of condition selicited by UV exposure including skin sunburn.

Keywords Blumea balsamifera oil ； ultraviolet B irradiation ； antioxidant

醫(yī)學(xué)研究表明，曬傷是由于皮膚接受了超過(guò)耐受量的UVB而引起的光毒反應(yīng)[1]。曬傷發(fā)生機(jī)制之一是產(chǎn)生高度反應(yīng)活性的活性氧族與各種細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)相互作用而造成皮膚曬紅和曬傷，引起DNA的直接改變和損傷，誘發(fā)炎癥甚至是皮膚癌，嚴(yán)重影響人們的健康[2]。多項(xiàng)研究表明，UVB輻射引起皮膚細(xì)胞DNA損傷標(biāo)志物主要為8-OHdG，這被認(rèn)為是造成UVB損傷皮膚的重要介質(zhì)之一[3]。艾納香為菊科艾納香屬艾納香[Blumea balsamifera（L.）DC.]的新鮮或干燥地上部分，具有清熱解毒，消腫止痛，止癢等功效，而艾納香油為艾納香中揮發(fā)性成分的提取物是提取天然冰片的附屬產(chǎn)品，含有L-龍腦、樟腦、α-蒎烯、芳樟醇、β-石竹烯等主要成分[5]。本研究以Balb/C小鼠為受試動(dòng)物制備曬傷模型，探討艾納香油是否具有治療皮膚曬傷的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物

Balb/C小鼠（4～6周），80只，雌性，體重18～22 g，購(gòu)自湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，生產(chǎn)許可證：SCXK（鄂）2015-0018。

1.1.2 藥物與試劑

艾納香油購(gòu)自貴州省艾源生態(tài)藥業(yè)開(kāi)發(fā)有限公司（批號(hào)：20110116）。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以85%乙醇稀釋至濃度40%，備用；小鼠8-OHdG ELISA試劑盒購(gòu)自北京鑫方程生物技術(shù)有限公司（批號(hào)：201505）；SOD（批號(hào)：20150518）、GSH（批號(hào)：20150522）、MDA（批號(hào)：20150522）試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所，其他相關(guān)溶劑均為分析純。

1.1.3 儀器與設(shè)備

UVB紫外線燈管（TL20W/12RS，荷蘭PHILIPS公司）；紫外線照度計(jì)（UV-340A，臺(tái)灣Lutron Electronics公司）；酶標(biāo)儀（ELX800，美國(guó)BioTek公司）；Sartorius CPA225D電子分析天平；紫外分光光度計(jì)（DU-800，美國(guó)Beckman Coulter公司）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型的制備及處理

實(shí)驗(yàn)前2 d在小鼠背部脊柱兩側(cè)剪去體表長(zhǎng)毛，面積約為3.0 cm ×3.0 cm，用8%硫化鈉進(jìn)行脫毛。將脫毛小鼠隨機(jī)分為4組：空白對(duì)照組（NC）、UVB模型組（UVB）、溶劑組（VC，85%乙醇）、艾納香油組（BB Oil，40%），每組20只[6]。除空白對(duì)照組外，對(duì)其余各組小鼠進(jìn)行以下處理：開(kāi)啟UVB紫外線燈，預(yù)熱15 min，固定光源距小鼠背部距離約為20 cm，照射時(shí)間為40 min，照射強(qiáng)度為0.25 mW/cm2，輻照量為600 mJ/cm2[7]；照射期間停止給水給食，照射后0.5 h恢復(fù)。置室溫（24 ±2）℃，濕度50%～60%，12 h白/黑環(huán)境下自由攝食、飲水。

照射后30 min起，開(kāi)始于照射部位均勻涂抹藥物0.25 mL/只，每天給藥1次，連續(xù)11 d。分別在曬傷后5個(gè)時(shí)間相點(diǎn)l、2、4、7、11 d，每組每次處死4只小鼠，取小鼠背部皮膚和血液。皮膚組織經(jīng)過(guò)漂洗、稱(chēng)重、勻漿、離心后留上清備用。全血室溫靜置20～30 min后，于4 500 r/min下離心5 min，取上清液得血清，置于-80 ℃冰箱保存，備用[8]。

1.2.2 小鼠曬傷創(chuàng)面結(jié)痂脫落時(shí)間觀察

每天在每次給藥前0.5 h觀察小鼠背部的表皮變化，將結(jié)痂完全脫落的時(shí)間記為小鼠曬傷創(chuàng)面結(jié)痂脫落時(shí)間。

1.2.3 螺旋測(cè)微器檢測(cè)小鼠背部皮膚厚度

用螺旋測(cè)微器測(cè)量小鼠背部皮膚厚度并記錄數(shù)據(jù)，每只小鼠取剃毛區(qū)中心背部不同皮膚部位10處進(jìn)行重復(fù)測(cè)量。

1.2.4 小鼠背部皮膚組織含水量測(cè)定

每只小鼠取相同部位的背部皮膚，約100 mg，濾紙吸干血液，電子天平稱(chēng)濕重，并記錄。然后放于80℃烤箱烘烤24 h，取出稱(chēng)干重，干濕法計(jì)算組織含水量。計(jì)算公式如下：

組織含水量（%）= ×100%

1.2.5 小鼠血清中SOD與皮膚組織中MDA、GSH測(cè)定

用可見(jiàn)光分光光度法檢測(cè)已制備的血清中SOD活性和皮膚組織上清液中MDA、GSH的含量，具體操作步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行。

1.2.6 小鼠皮膚組織中8-OHdG測(cè)定

用酶標(biāo)儀檢測(cè)皮膚組織上清液中8-OHdG的含量，具體操作步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，各組間采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 艾納香油對(duì)曬傷創(chuàng)面結(jié)痂脫落時(shí)間的影響

曬傷后前2 d，與空白組相比，模型組和溶劑組小鼠背側(cè)出現(xiàn)表皮增厚、脫屑、皺縮現(xiàn)象；艾納香油組小鼠背側(cè)表皮僅有稍許皮膚增厚，無(wú)脫屑、皺縮。第3天起曬傷處漸漸形成結(jié)痂并從邊沿開(kāi)始脫落，艾納香油組的脫落時(shí)間明顯快于模型組、溶劑組，模型組完全脫落平均時(shí)間為11 d，溶劑組為10.5 d，艾納香油組為9 d（圖1）。

2.2 艾納香油對(duì)曬傷皮膚厚度的影響

UVB曬傷后小鼠背部皮膚明顯增厚為（0.53±0.046）mm，與空白對(duì)照組（0.27±0.014）mm相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；溶劑組皮膚厚度低于模型組，但高于艾納香油組，與模型組、艾納香油組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；第1、2、4、7 天，艾納香油組厚度與模型組相較差異具有顯著性（P<0.01），提示艾納香油可以抑制皮膚增生（圖2）。

2.3 艾納香油對(duì)曬傷組織皮膚含水量的影響

紫外線照射后第1 天各組皮膚含水量均較高，艾納香油組>溶劑組>空白組>模型組，且艾納香油組與模型組比較差異有顯著性（P<0.05）。模型組和溶劑組皮膚含水量均隨時(shí)間的后移而逐漸下降，在整個(gè)治療過(guò)程中，艾納香油組皮膚含水量最高，于第4天含水量達(dá)最高值（73.13±3.34）%，隨后含水量逐漸下降穩(wěn)定至（69.29±5.10）%，與空白組、模型組、溶劑組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）（圖3）。

2.4 艾納香油對(duì)小鼠SOD活力、MDA含量、GSH含量的影響

曬傷后第1、2、4 天，模型組、溶劑組、艾納香油組SOD活性均低于空白組，第1、2天，模型組、溶劑組與空白組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），且二者SOD活性相仿，兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。外涂40%艾納香油后，小鼠血清中SOD活力明顯升高，第1 天與模型組、溶劑組相較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；第2天與模型組相較，差異仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；7 d后艾納香油組SOD活性高于空白組，提示艾納香油可增強(qiáng)機(jī)體清除氧自由基的能力（圖4）。

曬傷后第1 天，模型組、溶劑組的MDA含量顯著升高，與空白組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；艾納香油組顯著低于模型組（P<0.01）、溶劑組（P<0.05），高于空白組，但與空白組相較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。曬傷后第2 天，除空白組外，各處理組MDA含量均低于第1 天，但模型組、溶劑組與空白組比較差異仍均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01，P<0.05）；艾納香油組MDA含量仍低于模型組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。曬傷4 d后，隨著機(jī)體調(diào)節(jié)和給予相應(yīng)藥物，各處理組小鼠皮膚組織中的MDA含量趨于穩(wěn)定，并恢復(fù)到正常水平，表明艾納香油在曬傷前期能夠有效減少皮膚中脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物的堆積（圖5）。

曬傷后第1、2 天，模型組、溶劑組GSH含量均低于空白組和艾納香油組，第1 天，模型組、溶劑組與空白組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01，P<0.05），且兩者SOD活性相仿，兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。艾納香油組皮膚中GSH含量明顯升高，第1、2、4 天與模型組相較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示艾納香油可增強(qiáng)皮膚的抗氧化能力（圖6）。

2.5 艾納香油對(duì)小鼠皮膚8-OHdG的影響

在整個(gè)曬傷治療周期中，除空白組處于穩(wěn)定值外，其他3組8-OHdG含量總體呈上升趨勢(shì)。其中，在第1、4、7、11天，模型組、溶劑組8-OHdG含量均高于空白組，且差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01），而在第1、2、4、7、11天不同的5個(gè)時(shí)間點(diǎn)，艾納香油組8-OHdG含量均顯著低于模型組和溶劑組，差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01），艾納香油組與空白組相較無(wú)顯著性差異（P>0.05），提示艾納香油可以促進(jìn)UVB輻射光產(chǎn)物的清除（圖7）。

3 結(jié)論與討論

過(guò)度UV誘導(dǎo)的皮膚氧化損傷，可造成皮膚出現(xiàn)紅斑、水腫、炎癥、異常增生、色素沉著等皮膚曬傷表現(xiàn)，當(dāng)前市場(chǎng)上缺乏治療曬傷的專(zhuān)用藥[2]。研究表明，艾納香油具有抗氧化、抗菌[9]、治療皮膚燒燙傷[4]的作用，而艾納香油是否能抑制中波紫外線曬傷后諸多表現(xiàn)尚未被證實(shí)。本實(shí)驗(yàn)以Balb/C小鼠為對(duì)象，進(jìn)行急性UVB輻射，造成小鼠皮膚曬傷表現(xiàn)，對(duì)艾納香油的抗氧化藥效進(jìn)行檢測(cè)，研究結(jié)果顯示，艾納香油可以加速曬傷創(chuàng)面結(jié)痂脫落，促進(jìn)傷口愈合，明顯減輕UVB引起的皮膚增厚。UVB曬傷有一定的促細(xì)胞腫脹作用，這也是UVB曬傷引起皮膚炎癥產(chǎn)生的可能機(jī)制之一，艾納香油處理后皮膚增厚程度明顯減輕從而降低炎癥發(fā)生。皮膚曬傷后將會(huì)出現(xiàn)發(fā)紅、干燥、脫屑、含水量減少、彈性減少等現(xiàn)象，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，艾納香油在小鼠曬傷后期可升高皮膚的含水量，與模型相、溶劑組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），表明艾納香油對(duì)曬傷皮膚組織的恢復(fù)有良好的促進(jìn)作用。

紫外線輻射會(huì)引起體內(nèi)自由基激增，脂質(zhì)過(guò)氧化作用增強(qiáng)，并因此形成脂質(zhì)過(guò)氧化物MDA，故MDA的高低間接反應(yīng)了機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度。SOD是體內(nèi)清除氧自由基的重要酶，對(duì)活性氧異常敏感，易被活性氧氧化失活，破壞細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能。因而檢測(cè)SOD活性對(duì)探討皮膚曬傷的病因有重要作用。GSH是機(jī)體內(nèi)最重要的非酶性抗氧化物，具有清除自由基、維持DNA的生物合成及細(xì)胞免疫等重要生理功能，GSH量的多少是衡量機(jī)體抗氧化能力大小的重要因素。8-OHdG是UVB損傷皮膚細(xì)胞DNA而產(chǎn)生的主要光產(chǎn)物之一，反映了整個(gè)機(jī)體平均的氧化損傷率及體內(nèi)DNA氧化損傷與機(jī)體正常的修復(fù)作用。本研究中，經(jīng)紫外線曬傷后小鼠SOD活性降低，MDA含量明顯增加，GSH含量下降，與空白對(duì)照組各指標(biāo)變化比較差異有顯著性意義（P<0.05，P<0.01），外涂艾納香油后，小鼠血清中SOD活力明顯升高，皮膚中MDA含量顯著降低，GSH含量顯著升高，差異均有顯著性意義（P<0.05，P<0.01），而且艾納香油組8-OHdG含量均明顯低于模型組和溶劑組（P<0.05，P<0.01），說(shuō)明艾納香油可增強(qiáng)皮膚對(duì)自由基的防護(hù)功能，減少脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物堆積，減輕UVB輻射造成的DNA損傷，具有較好的抗氧化能力，且起效周期短，給藥前5 d較為明顯。

本實(shí)驗(yàn)僅測(cè)定了40%艾納香油對(duì)曬傷后小鼠皮膚的抗氧化作用以及對(duì)DNA損傷修復(fù)的作用，故下階段試驗(yàn)中將再增加幾個(gè)實(shí)驗(yàn)濃度，同時(shí)再設(shè)立使用不同濃度艾納香油而不照射UVB組，以便排除“藥物”本身對(duì)皮膚的影響，進(jìn)一步對(duì)血清及皮膚組織中的炎癥介質(zhì)或細(xì)胞因子進(jìn)行檢測(cè)，探討艾納香油治療曬傷的藥理作用機(jī)制。

參考文獻(xiàn)

[1] 蔣小云，肖風(fēng)麗. 紫外線與皮膚癌[J]. 中國(guó)麻風(fēng)皮膚病雜志，2013，29（1）：28-30.

[2] 葉小紅，宋洪濤. 中藥治療日曬傷的研究進(jìn)展[J]. 解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào)，2010，26（1）：83-86.

[3] 鄭 欣，吳 嚴(yán)，徐天華，等. 抗氧化劑復(fù)合物對(duì)急性紫外線照射所致皮膚日曬傷的保護(hù)作用[J]. 中國(guó)美容醫(yī)學(xué)，2012，21（7）：1 170-1 172.

[4] 范佐旺，王 丹，龐玉新，等. 艾納香油對(duì)大鼠深Ⅱ度燙傷的治療研究[J]. 中醫(yī)藥信息，2014，31（6）：93-96.

[5] 吳麗芬，龐玉新，楊 全，等. GC法同時(shí)測(cè)定艾納香油中5個(gè)主要成分的含量[J]. 藥物分析雜志，2015，07：1 179-1 184.

[6] 駱 丹，周炳榮. 黃芩苷對(duì)中波紫外線誘導(dǎo)后BALB/c小鼠表皮光產(chǎn)物形成的干預(yù)作用[J]. 中華皮膚科雜志，2009，42（2）：132-134.

[7] Lee C W， Ko H H， Lin C C， et al. Artocarpin attenuates ultraviolet B-induced skin damage in hairless mice by antioxidant and anti-inflammatory effect[J]. Food Chem Toxicol， 2013， 60：123-129.

[8] Silva M A， Trevisan G， Hoffmeister C， et al. Anti-inflammatory and antioxidant effects of Aloe saponaria Haw in a model of UVB-induced paw sunburn in rats[J]. J Photochem Photobio B，2014，133：47-54.

[9] 唐暉慧，金美東. 瓊產(chǎn)艾納香葉精油的抗氧化和抗菌活性[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)，2013，39（6）：47-52.