蘇慧慧，萬(wàn)春友，魏蔚，孟海妹，焦亞沖，邢冬紅，鄭芳△

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血清淀粉樣蛋白A誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)形成

蘇慧慧1，萬(wàn)春友2，魏蔚3，孟海妹1，焦亞沖1，邢冬紅1，鄭芳1△

摘要：目的探究血清淀粉樣蛋白A（SAA）能否在體外誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞形成中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)（NETs）。方法建立穩(wěn)定的體外誘導(dǎo)NETs形成方法，包括外周血中性粒細(xì)胞的分離、細(xì)胞體外培養(yǎng)、NETs的誘導(dǎo)和形態(tài)學(xué)觀察。提取健康志愿者的外周血中性粒細(xì)胞，分為陰性對(duì)照（NC）組、SAA組和脂多糖（LPS）組，給予相應(yīng)的刺激后，觀察NETs的形成并計(jì)算百分率，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)培養(yǎng)上清中人組蛋白3（h3）的含量。結(jié)果提取的外周血中性粒細(xì)胞純度與細(xì)胞活力均在95%以上。顯微鏡下觀察到部分細(xì)胞的細(xì)胞核失去原有核型，向外擴(kuò)散形成網(wǎng)狀，即NETs。與NC組相比，接受SAA刺激的中性粒細(xì)胞有更多的NETs形成（P < 0.05）。培養(yǎng)液上清中的h3含量顯著高于NC組（P < 0.05）。結(jié)論SAA可在體外誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞形成NETs。

關(guān)鍵詞：血清淀粉樣蛋白A；中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)；中性粒細(xì)胞；炎癥；人組蛋白3

△通訊作者E-mail：zhengfang@tijmu.edu.cn

中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)（neutrophil extracellular traps，NETs）是中性粒細(xì)胞受到相應(yīng)刺激時(shí)形成的以DNA為骨架，顆粒蛋白等黏附其上的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[1]。NETs形成后可限制感染的擴(kuò)散，有免疫防御的功能[1]。此外，NETs還參與炎癥過(guò)程和一些自身免疫病的發(fā)生與發(fā)展[2]。血清淀粉樣蛋白A（serum amyloid A，SAA）是一種主要的急性時(shí)相反應(yīng)蛋白，在一些炎癥性疾病中表達(dá)水平可大幅度升高。SAA作用于中性粒細(xì)胞，可趨化其向炎癥部位聚集，并誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞表達(dá)多種細(xì)胞因子[3]。但SAA與中性粒細(xì)胞形成NETs這一過(guò)程的關(guān)系目前尚鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究旨在探究SAA是否能夠誘發(fā)中性粒細(xì)胞形成NETs這一過(guò)程。

1　材料與方法

1.1材料Histopaque- 1119、Histopaque- 1077、脂多糖（LPS）均購(gòu)于Sigma-Aldrich（德國(guó)）公司。重組人Apo-SAA購(gòu)于peprotech（美國(guó)）公司。人組蛋白3（histone 3，h3）酶聯(lián)免疫試劑盒購(gòu)于鑫樂(lè)（中國(guó)，上海）公司。無(wú)酚紅1640購(gòu)于康寧公司。DAPI染料、紅細(xì)胞裂解液購(gòu)于solarbio（中國(guó)）公司。

1.2方法

1.2.1中性粒細(xì)胞的分離選取4名2015年3—4月到天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院進(jìn)行健康體檢的健康志愿者，清晨空腹采集靜脈血，EDTA抗凝，按如下步驟分離中性粒細(xì)胞。EDTA抗凝全血、Histopaque-1119、Histopaque-1077按2∶1∶1的比例加入離心管。首先加入3 mL Histopaque-1119，再將3 mL Histopaque-1077加于其上避免晃動(dòng)，然后加入EDTA抗凝全血6 mL。700×g離心30 min低速制動(dòng)。離心后His?topaque-1119及Histopaque-1077之間的細(xì)胞層為中性粒細(xì)胞。收集中性粒細(xì)胞，加入紅細(xì)胞裂解液1 mL，室溫裂解2 min，450×g離心3 min，加入PBS重懸，450×g離心3 min，如此洗2遍。加入無(wú)血清無(wú)酚紅的1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)并將細(xì)胞稀釋至所需密度備用。4 g/L臺(tái)盼藍(lán)染色后觀察細(xì)胞活力。HE染色觀察（×400），隨機(jī)取10個(gè)視野并分類(lèi)計(jì)數(shù)視野中全部細(xì)胞，計(jì)算中性粒細(xì)胞百分率。DAPI染色觀察細(xì)胞核形態(tài)。

1.2.2NETs的誘導(dǎo)提取中性粒細(xì)胞，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞個(gè)數(shù)。將細(xì)胞密度調(diào)至1.5×105個(gè)/孔，接種于鋪有蓋玻片的24孔板，置于含有5%CO2、37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min。實(shí)驗(yàn)分為3組：SAA組加入SAA，終濃度為25 mg/L（基于之前預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果）；陰性對(duì)照（NC）組加入等體積的Tris-HCL緩沖液作溶劑對(duì)照；LPS組加入LPS，終濃度為1 mg/L。每組樣本各設(shè)3個(gè)復(fù)孔。4 h后收集上清，350×g離心5 min，留取上清，存于-20℃?zhèn)溆?。孔中加?%多聚甲醛固定細(xì)胞爬片10 min，用于后續(xù)研究。

1.2.3NETs的觀察與評(píng)估細(xì)胞爬片固定后，0.01 mol/L PBS浸洗3次，每次5 min。之后0.05% trition通透1 min，0.5 mg/L DAPI染液避光染色5 min，0.01 mol/L PBS浸洗3次，甘油與水1∶1比例配置的封片液封片，熒光顯微鏡觀察。每個(gè)細(xì)胞爬片隨機(jī)計(jì)數(shù)10個(gè)視野中的NETs數(shù)和細(xì)胞總數(shù)，計(jì)算NETs形成百分率。

1.2.4細(xì)胞培養(yǎng)液上清中h3含量的檢測(cè)將樣本用稀釋液稀釋4倍后，按說(shuō)明書(shū)上標(biāo)明的程序，采用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液上清中h3含量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 17.0軟件分析數(shù)據(jù)，作圖采用GraphPad Prism 5軟件，計(jì)量資料采用±s表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用Dunnett-t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05。

2　結(jié)果

2.1中性粒細(xì)胞的提取鏡下可見(jiàn)中性粒細(xì)胞占所提取細(xì)胞總數(shù)的95%以上，見(jiàn)圖1 A。DAPI染色顯示細(xì)胞核為典型的分葉核，胞核邊界清晰可見(jiàn)，沒(méi)有模糊擴(kuò)散等現(xiàn)象，見(jiàn)圖1 B。臺(tái)盼藍(lán)染色鑒定細(xì)胞活力顯示，細(xì)胞活力在98%以上，提示該提取方法切實(shí)可行。

2.2SAA體外誘導(dǎo)NETs形成

2.2.1各組NETs形成情況比較部分中性粒細(xì)胞細(xì)胞核失去原有的分葉形態(tài)，胞核邊界消失變得模糊，細(xì)胞核向外擴(kuò)散，即形成NETs，見(jiàn)圖2。且SAA組與LPS組形成NETs的細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分率顯著高于NC組（P < 0.05）。提示SAA可促使中性粒細(xì)胞形成NETs，見(jiàn)圖3。

Fig. 1 Picture showing purified neutrophils圖1　提純的中性粒細(xì)胞

Fig. 2 Morphologic observation of neutrophils exposed to stimulants圖2　中性粒細(xì)胞被誘導(dǎo)后的形態(tài)學(xué)觀察（DAPI，×200）

Fig. 3 Comparison of percentages of NETs neutrophils between three groups圖3　各組形成NETs的細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分率比較

2.2.2各組細(xì)胞培養(yǎng)液上清中h3含量比較SAA組與LPS組細(xì)胞培養(yǎng)液上清中h3的含量高于NC組（P < 0.05）。說(shuō)明SAA組比NC組有更多的細(xì)胞形成NETs，見(jiàn)圖4。

Fig. 4 Comparison of concentrations of h3 in supernatant between three groups圖4　各組細(xì)胞培養(yǎng)液上清中h3含量比較

3　討論

3.1NETs、SAA與炎癥自2004年NETs被首次報(bào)道[1]后，有關(guān)NET的研究取得了較快進(jìn)展。研究顯示NETs除參與生理性的免疫防御外，還與多種炎癥相關(guān)疾病的病理過(guò)程密切相關(guān)。如系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）、微小血管炎以及癌癥[2,4]等疾病中均有NETs的參與。SAA作為一種急性時(shí)相反應(yīng)蛋白，在各種炎癥疾病中多有表達(dá)水平的升高，且發(fā)揮著復(fù)雜的免疫調(diào)節(jié)作用[5]。在一些感染性疾病和慢性炎癥性疾病如敗血癥[6-7]和類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎[2,8]中，可見(jiàn)SAA表達(dá)量和NETs形成量同時(shí)升高。提示SAA與NETs的形成之間可能有一定程度的相關(guān)。

3.2培養(yǎng)液上清中h3的含量與NETs的形成h3是一種核蛋白，正常情況下存在于細(xì)胞核內(nèi)。在NETs形成過(guò)程中，由于細(xì)胞膜及核膜的破裂，h3可進(jìn)入培養(yǎng)液。因此培養(yǎng)液中的h3含量可以在很大程度上反映NETs的形成量。在分析ELISA與形態(tài)學(xué)計(jì)數(shù)的百分率結(jié)果時(shí)發(fā)現(xiàn)，二者的結(jié)果相一致，即不管是細(xì)胞培養(yǎng)液中h3的含量還是形成NETs細(xì)胞的百分率，SAA組與LPS組均顯著高于NC組。但是ELISA結(jié)果相較于百分率結(jié)果整體數(shù)值略高，可能由于實(shí)驗(yàn)處理過(guò)程中不可避免有細(xì)胞損傷和胞膜破裂，致使h3的含量升高；另外NETs形成后隨時(shí)間推移可能會(huì)有擴(kuò)散或分解。

3.3SAA與NETs的形成本研究顯示，SAA組與LPS組形成NETs細(xì)胞的百分率和細(xì)胞培養(yǎng)上清中h3的含量顯著高于NC組，提示SAA能夠誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞形成NETs。之前的研究表明LPS能夠誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞形成NETs[9]，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致，說(shuō)明本研究的實(shí)驗(yàn)方法可靠。關(guān)于SAA與NETs形成之間的關(guān)系，目前尚鮮見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。但是近來(lái)研究顯示SAA可誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞產(chǎn)生活性氧簇（reac?tive oxygen species，ROS）[10]，而ROS的生成是NETs形成過(guò)程中的關(guān)鍵步驟。有研究指出，ROS可直接誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞形成NETs[11]；在抑制與ROS生成相關(guān)的NADPH氧化酶和髓過(guò)氧化物酶后，NETs的形成受到抑制[11-12]。上述研究成果間接支持了本研究的結(jié)論，同時(shí)提示SAA或許經(jīng)誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生，進(jìn)一步誘發(fā)中性粒細(xì)胞形成NETs這一過(guò)程。

綜上，本研究結(jié)果提示SAA能夠在體外誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞形成NETs。在體內(nèi)環(huán)境中SAA也可能通過(guò)相似的機(jī)制影響免疫反應(yīng)的進(jìn)程。中性粒細(xì)胞形成NETs是一種新發(fā)現(xiàn)的重要的免疫過(guò)程。研究其與SAA之間的相互作用關(guān)系有助于進(jìn)一步認(rèn)識(shí)機(jī)體的免疫反應(yīng)和相關(guān)疾病的病理機(jī)制。

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（2015-10-19收稿2015-11-01修回）

（本文編輯李鵬）

作者單位：1天津醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院免疫學(xué)教研室（郵編300203）；2天津市天津醫(yī)院；3天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院

Serum amyloid A induces the formation of NETs

SU Huihui1, WAN Chunyou2, WEI Wei3, MENG Haimei1, JIAO Yachong1, XING Donghong, ZHENG Fang1△
1 Department of Immunology, School of Laboratory Medicine, Tianjin Medical University, Tianjin 300203, China; 2 Tianjin Hospital; 3 General Hospital of Tianjin Medical University
△Corresponding Author E-mail: zhengfang@tijmu.edu.cn

Abstract：Objective To explore whether serum amyloid A (SAA) can induce the formation of neutrophil extracellular traps（NETs）in neutrophils in vitro. Methods A stable method for inducing NETs formation in vitro was established, in?cluding isolation of peripheral blood neutrophils, cell culture, and NETs formation and observation. The neutrophils were iso?lated from peripheral blood of healthy volunteers. And cells were cultured in vitro and classified into three groups: negative control (NC) group, SAA group and lipopolysaccharide (LPS) group. Following the distinct stimulation in three groups, NETs formation was observed and its percentage was calculated. The concentration of hinstone (h) 3 in supernatant was detected by ELISA. Results The purification and vitality of isolated neutrophils were both more than 95%. The nuclei of neutrophils lost their shape and spread, NETs formation was found. More NETs formation was found in SAA group than that in NC group (P < 0.05). Moreover, the concentration of h3 in supernatant was significantly higher in SAA group than that in NC group (P < 0.05). Conclusion SAA can induce the formation of NETs in vitro.

Key words：serum amyloid A protein；neutrophil extracellular traps; neutrophil；inflammation；hinstone 3

中圖分類(lèi)號(hào)：R392.11

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

DOI:10.11958/20150240

基金項(xiàng)目：天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃項(xiàng)目（14JCYBJC25600）

作者簡(jiǎn)介：蘇慧慧（1990），女，碩士在讀，主要從事中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)與類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎相關(guān)研究