陸家睛，丁楊峰，于寧，陳福娟，張怡，易雪梅（上海市皮膚病醫(yī)院，上海200443）

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308nm準(zhǔn)分子激光治療前后對(duì)尋常型銀屑病患者外周血Th17/Treg細(xì)胞免疫失衡的研究

陸家睛，丁楊峰，于寧，陳福娟，張怡，易雪梅
（上海市皮膚病醫(yī)院，上海200443）

摘要：目的探討308nm準(zhǔn)分子激光治療前后尋常型銀屑病患者外周血Th17細(xì)胞與Treg細(xì)胞的比例、Th17/Treg比值，分析308nm準(zhǔn)分子激光治療前后Th17/Treg細(xì)胞免疫失衡與銀屑病發(fā)病及病情嚴(yán)重程度之間的關(guān)系。方法選取60例尋常型銀屑病患者作為試驗(yàn)組，同時(shí)選20例健康人作為正常對(duì)照組，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)尋常型銀屑病患者308nm準(zhǔn)分子激光治療前后及正常人外周血Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞的比例、Th17/Treg的比值，同時(shí)以銀屑病面積和嚴(yán)重程度指數(shù)（PASI）評(píng)分評(píng)價(jià)尋常型銀屑病患者病情的嚴(yán)重程度。結(jié)果尋常型銀屑病患者308nm準(zhǔn)分子激光治療前外周血Th17細(xì)胞的比例、Th17/Treg比值顯著高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；Treg細(xì)胞的比例顯著低于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。尋常型銀屑病患者308nm準(zhǔn)分子激光治療后外周血Th17細(xì)胞的比例、Th17/Treg比值顯著低于治療前（P＜0.01）；Treg細(xì)胞的比例顯著高于治療前（P＜0.01）。尋常型銀屑病患者308nm準(zhǔn)分子激光治療后外周血Th17細(xì)胞的比例、Treg細(xì)胞的比例、Th17/Treg比值與正常對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。尋常型銀屑病患者PASI評(píng)分與Th17細(xì)胞的比例呈正相關(guān)（P＜0.01）；而Treg細(xì)胞的比例與疾病嚴(yán)重程度之間無相關(guān)性（P＞0.05）。結(jié)論Th17/Treg細(xì)胞免疫失衡可能對(duì)銀屑病的發(fā)病至關(guān)重要，308nm準(zhǔn)分子激光治療可望通過調(diào)節(jié)患者外周血Th17細(xì)胞與Treg細(xì)胞的比例，從而調(diào)節(jié)Th17/Treg細(xì)胞失衡達(dá)到治療銀屑病的目的。

關(guān)鍵詞：銀屑?。?08nm準(zhǔn)分子激光；Th17/Treg細(xì)胞免疫失衡

Th17細(xì)胞是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新型CD4+T細(xì)胞亞群，主要通過分泌白細(xì)胞介素-17A（IL-17A）、IL-17F、IL-22等細(xì)胞因子而參與銀屑病的發(fā)生與發(fā)展［1］。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）是一種具有免疫調(diào)節(jié)功能的T細(xì)胞亞群，對(duì)維持機(jī)體免疫耐受和相關(guān)免疫應(yīng)答的穩(wěn)態(tài)作用匪淺。因此Th17/Treg細(xì)胞失衡可能在一定程度上對(duì)自身免疫性疾病的調(diào)控也起著不可或缺的作用［2］。308nm準(zhǔn)分子激光即氯化氙（XeC1）準(zhǔn)分子激光，具有可調(diào)的靶向性良好的光斑，只針對(duì)銀屑病的皮損，克服了紫外線對(duì)正常皮膚的不良影響，在加大劑量、加快療程的同時(shí)可大大減少不良反應(yīng)［3］。本研究通過檢測(cè)尋常型銀屑病患者308nm準(zhǔn)分子激光治療前后外周血Th17/Treg細(xì)胞的表達(dá)水平，探討Th17/Treg細(xì)胞免疫失衡與銀屑病發(fā)病及病情嚴(yán)重程度之間的關(guān)系，及308nm準(zhǔn)分子激光治療銀屑病的機(jī)制。

1　對(duì)象與方法

1.1病例資料本研究為開放性研究，所選患者來自2013年1月—2015年1月我院皮膚內(nèi)科門診及病房患者，根據(jù)適應(yīng)證，確立入選標(biāo)準(zhǔn)、排除標(biāo)準(zhǔn)及剔除標(biāo)準(zhǔn)，篩選尋常型銀屑病60例，年齡18～70歲，平均（47.30±16.32）歲，病程1個(gè)月～20年，平均（5.04±3.81）年；銀屑病面積和嚴(yán)重程度指數(shù)（PASI）評(píng)分1.23～7.69，60例患者平均（4.68±1.26）分。篩選正常健康人20例作為對(duì)照組，年齡18～70歲，平均（47.15±14.70）歲。2組在性別、年齡上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。試驗(yàn)組與對(duì)照組均簽署知情同意書。

1.1.1適應(yīng)證符合尋常型銀屑病診斷標(biāo)準(zhǔn)，且皮損面積小于體表面積的5%的厚斑塊患者（非點(diǎn)滴型銀屑病、膿皰型銀屑病、關(guān)節(jié)病型銀屑病和紅皮病型銀屑病）。

1.1.2入選標(biāo)準(zhǔn)①臨床上診斷為尋常型銀屑病診斷標(biāo)準(zhǔn)，且皮損面積小于體表面積的5%的厚斑塊患者。②年齡18～70歲，性別不限。③無嚴(yán)重的心腦血管器質(zhì)性病變及肝、腎功能損害者。④無免疫功能低下者。⑤已簽署知情同意書的患者。

1.1.3排除標(biāo)準(zhǔn)①患者有光敏性皮膚病以及可能因光照射誘發(fā)或加重的疾病等；②近1周有服用光敏性藥物；③有惡性皮膚腫瘤史者；④孕婦及哺乳期婦女；⑤合并有精神、神經(jīng)疾患者；⑥有不宜入選的其他原因。

1.4剔除標(biāo)準(zhǔn)①未按照治療方案治療者；②入選后發(fā)現(xiàn)不符合入選標(biāo)準(zhǔn)或符合排除標(biāo)準(zhǔn)；③入組后無任何隨訪記錄者。

1.5評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)①紅斑（E）：0=無（無紅斑可見），1=輕度（呈淡紅色），2=中等度（紅色），3=重度（深紅色），4=極重度（紅色極深）；②鱗屑（S）：0=無（表面無可見鱗屑），1=輕度（部分皮損表面上覆有鱗屑，以細(xì)微的鱗屑為主），2=中等度（大多數(shù)皮損表面完全或不完全覆有鱗屑，鱗屑呈片狀），3=重度（幾乎全部皮損表面覆有鱗屑，鱗屑較厚成層），4=極重度（全部皮損表面均覆有鱗屑，鱗屑很厚成層）；③浸潤(rùn)程度（T）：0=無（皮損與正常皮膚平齊），1=輕度（皮損輕微高出于正常皮膚表面），2=中等度（中等度隆起，斑塊的邊緣為圓或斜坡形），3=重度（皮損肥厚，隆起明顯），4=極重度（皮損高度增厚，隆起極為明顯）。

各部位PASI得分的計(jì)算公式是：

PASI（頭部）=0.1（紅斑+浸潤(rùn)+脫屑）×皮損面積；

PASI（上肢）=0.2（紅斑+浸潤(rùn)+脫屑）×皮損面積；

PASI（軀干）=0.3（紅斑+浸潤(rùn)+脫屑）×皮損面積；

PASI（下肢）=0.4（紅斑+浸潤(rùn)+脫屬）×皮損面積；

PASI總分=PASI（頭部）+PASI（上肢）+PASI（下肢）+PASI（軀干）。

1.2方法

1.2.1308nm準(zhǔn)分子激光照射試驗(yàn)組給予308nm準(zhǔn)分子激光局部照射2次/周，照射前測(cè)定MED，患者初始劑量為1倍的MED，每次劑量均在前次照射劑量的基礎(chǔ)上增加10%～25%，如果局部出現(xiàn)明顯紅斑，則減少前次照射劑量的10%；如出現(xiàn)痛性紅斑或水皰則停止照射1次或2次。療程為10次，如照射部位痊愈則停止照射308nm準(zhǔn)分子激光。

1.2.2觀察時(shí)間每周1次，隨訪5次。

1.2.3觀察內(nèi)容①每周1次治療前研究者對(duì)患者疾病嚴(yán)重程度進(jìn)行評(píng)分；②每周1次治療前研究者對(duì)患者治療的靶部位拍照；③觀察記錄不良反應(yīng)；④預(yù)約下次治療、隨訪時(shí)間。

1.2.4治療前后流式細(xì)胞儀檢測(cè)試驗(yàn)組和對(duì)照組外周血Th17、Treg細(xì)胞的比例

①Th17細(xì)胞的比例檢測(cè)：按照文獻(xiàn)［5］進(jìn)行。每例患者和正常人均取靜脈血3mL，肝素抗凝，以PBS等體積稀釋。采用人淋巴細(xì)胞分離液獲取外周血單一核細(xì)胞（PBMC），RPMI1640調(diào)整細(xì)胞濃度至2×106/mL，接種至24孔板后加入佛波酯（50μg/L）、離子霉索（1μmo1/L）和莫能霉素（500μg/L），37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)4h。收集細(xì)胞根據(jù)計(jì)數(shù)等分為測(cè)定管和同型對(duì)照管，加入20μLPE標(biāo)記的鼠抗人CD4單抗，4℃避光孵育30min。PBS洗滌2次，固定液室溫避光固定反應(yīng)20min后離心棄去上清，PBS洗滌2次。加入破膜劑進(jìn)行細(xì)胞打孔利于細(xì)胞因子染色，離心棄去上清后予細(xì)胞因子染色。測(cè)定管加入FITC標(biāo)志的IL-17A0.5μL，對(duì)照管加入同型對(duì)照，4℃避光孵育30min。應(yīng)用流式細(xì)胞儀，根據(jù)前向散射光和側(cè)向散射光以淋巴細(xì)胞群設(shè)門，設(shè)置各通道間的熒光補(bǔ)償后，對(duì)Th17細(xì)胞的比例進(jìn)行檢測(cè)。

②Treg細(xì)胞的比例檢測(cè)：取抗凝全血3mL，加入PE標(biāo)記的鼠抗人CD4單抗和FITC標(biāo)記的鼠抗人CD25抗體20μL，IgG1-PE和IgG1-FITC作為同型對(duì)照，混勻后避光15min，再加入1mL紅細(xì)胞裂解液。37℃孵育10min。離心棄去上清，PBS洗滌3次后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS17.0版統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以x±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。相關(guān)性檢驗(yàn)采用Pearson相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1外周血Th17細(xì)胞比例

2.1.1尋常型銀屑病患者308nm準(zhǔn)分子激光治療前Th17細(xì)胞檢測(cè)的流式代表圖見圖1

2.1.2尋常型銀屑病患者308nm準(zhǔn)分子激光治療后Th17細(xì)胞檢測(cè)的流式代表圖見圖2

2.1.3正常對(duì)照組Th17細(xì)胞檢測(cè)的流式代表圖見圖3

圖1　尋常型銀屑病患者308nm準(zhǔn)分子激光治療前Th17細(xì)胞檢測(cè)的流式代表圖

圖2　尋常型銀屑病患者308nm準(zhǔn)分子激光治療后Th17細(xì)胞檢測(cè)的流式代表圖

圖3　正常對(duì)照組Th17細(xì)胞檢測(cè)的流式代表圖

2.2外周血Treg細(xì)胞比例

2.2.1尋常型銀屑病患者308nm準(zhǔn)分子激光治療前Treg細(xì)胞檢測(cè)的流式代表圖見圖4

2.2.2尋常型銀屑病患者308nm準(zhǔn)分子激光治療后Treg細(xì)胞檢測(cè)的流式代表圖見圖5

2.2.3正常對(duì)照組Treg細(xì)胞檢測(cè)的流式代表圖見圖6

圖4　尋常型銀屑病患者308nm準(zhǔn)分子激光治療前Treg細(xì)胞檢測(cè)的流式代表圖

圖5　尋常型銀屑病患者308nm準(zhǔn)分子激光治療后Treg細(xì)胞檢測(cè)的流式代表圖

圖6　正常對(duì)照組Treg細(xì)胞檢測(cè)的流式代表圖

2.3統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果

2.3.1外周血Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞的比例、Th17/Treg比值檢測(cè)結(jié)果比較尋常型銀屑病患者308nm準(zhǔn)分子激光治療前外周血Th17細(xì)胞的比例和Th17/Treg比值均顯著高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；Treg細(xì)胞的比例顯著低于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。尋常型銀屑病患者308nm準(zhǔn)分子激光治療后外周血Th17細(xì)胞的比例和Th17/Treg比值顯著低于治療前患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；Treg細(xì)胞的比例顯著高于治療前患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。尋常型銀屑病患者308nm準(zhǔn)分子激光治療后外周血Th17細(xì)胞的比例、Treg細(xì)胞的比例和Th17/Treg比值及正常對(duì)照組外周血Th17細(xì)胞的比例、Treg細(xì)胞的比例和Th17/Treg比值差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1　尋常型銀屑病患者308nm準(zhǔn)分子激光治療前后與正常對(duì)照組Th17/Treg細(xì)胞比較　?。ā纒）

表1　尋常型銀屑病患者308nm準(zhǔn)分子激光治療前后與正常對(duì)照組Th17/Treg細(xì)胞比較　?。ā纒）

注：t為試驗(yàn)組（治療前）與對(duì)照組比較，P為試驗(yàn)組（治療前）與對(duì)照組比較；t1為治療前與治療后比較，P1為治療前與治療后比較；t2為試驗(yàn)組（治療后）與對(duì)照組比較，P2為試驗(yàn)組（治療后）與對(duì)照組比較。

組別　n　 Th17（%）　Treg（%）　Th17/Treg試驗(yàn)組（治療前）　60　 2.20±0.96　 0.74±1.01　 6.20±13.75試驗(yàn)組（治療后）　60　 1.07±0.87　 2.16±1.42　 0.61±0.66對(duì)照組　20　 0.40±0.37　 3.49±1.65　 0.13±0.12 t 17.86　5.63　3.49 t1　11.97　12.2　3.22 t2　9.49　11.97　7.24 P 0.0037　 0.0033　 0.0013 P1　0.0046　 0.0041　 0.0017 P2　0.0728　 0.0601　 0.0731

2.3.2Th17/Treg細(xì)胞與PASI評(píng)分的相關(guān)性分析本研究中所選尋常型銀屑病患者PASI評(píng)分為（4.68±1.26）分。尋常型銀屑病患者PASI評(píng)分與Th17細(xì)胞的比例呈正相關(guān)（r=0.871，P＜0.01）；而Treg細(xì)胞的比例與疾病嚴(yán)重程度之間無相關(guān)性（r=-0.023，P＞0.05）。

3　討論

目前普遍認(rèn)為，Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞是初始CD4+T細(xì)胞在不同條件下分化而成的兩種T細(xì)胞亞群［7］，而銀屑病是以T淋巴細(xì)胞為主介導(dǎo)的免疫異常性疾病，Th17細(xì)胞通過分泌IL-17在銀屑病發(fā)病中起更為直接的作用［8］。Treg細(xì)胞是一類同時(shí)具有免疫調(diào)節(jié)和免疫抑制雙重作用的CD4+T細(xì)胞，能調(diào)控免疫應(yīng)答強(qiáng)度，削弱致病因素對(duì)機(jī)體產(chǎn)生的影響［9］。若因其細(xì)胞的數(shù)量、功能不足，本身的可塑性改變，亦或是炎癥因子及效應(yīng)性T細(xì)胞的抵抗作用，使其不能有效地發(fā)揮抑制功能，則嚴(yán)重影響銀屑病的預(yù)后［10］。由此，介導(dǎo)自身免疫性疾病的Th17細(xì)胞與維持自身免疫耐受的Treg細(xì)胞兩者之間存在著平衡，此平衡對(duì)維持機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)起著重要的作用［11］，一旦這種平衡被打破，可導(dǎo)致自身免疫性疾病的發(fā)病［12］。Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞及Th17/Treg細(xì)胞的平衡與銀屑病發(fā)生發(fā)展之間的關(guān)系已成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)［13］。

308nm準(zhǔn)分子激光用于治療銀屑病的機(jī)制可能與T淋巴細(xì)胞凋亡有關(guān)［14］。目前研究顯示，經(jīng)過308nm準(zhǔn)分子激光治療，原皮損不僅在肉眼水平上完全消失，而且在微觀水平上的組織結(jié)構(gòu)也趨于正常，免疫組化研究顯示該激光能夠基本消除皮損處浸潤(rùn)的效應(yīng)性T淋巴細(xì)胞［14］。另外Mavi1ia等［15］用308nm準(zhǔn)分子激光治療銀屑病患者，發(fā)現(xiàn)當(dāng)病情穩(wěn)定后，部分細(xì)胞因子在皮損和正常皮膚中的表達(dá)水平基本相同。由此說明308nm準(zhǔn)分子激光可通過抑制細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而達(dá)到治療銀屑病的效果。

本研究結(jié)果顯示308nm準(zhǔn)分子激光治療前尋常型銀屑病患者外周血Th17細(xì)胞的比例顯著高于正常對(duì)照組，并與PASI評(píng)分呈正相關(guān)，說明Th17細(xì)胞與銀屑病的致病密切相關(guān)，其可望成為評(píng)估銀屑病嚴(yán)重程度的指標(biāo)。Treg細(xì)胞的比例顯著低于正常對(duì)照組，提示銀屑病患者Treg細(xì)胞可能不同程度地受損，導(dǎo)致其不能有效地抑制效應(yīng)T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，從而引起銀屑病病情加重。308nm準(zhǔn)分子激光治療前尋常型銀屑病患者Th17/Treg比例顯著高于正常對(duì)照組，表明銀屑病患者體內(nèi)存在著Th17/Treg細(xì)胞表達(dá)失衡的情況，這可能是銀屑病免疫發(fā)病機(jī)制的中心環(huán)節(jié)，若對(duì)其進(jìn)行相應(yīng)地調(diào)節(jié)將成為銀屑病治療的關(guān)鍵。此外，該研究還發(fā)現(xiàn)308nm準(zhǔn)分子激光治療后尋常型銀屑病患者外周血Th17細(xì)胞的比例、Th17/Treg比值顯著低于治療前，而Treg細(xì)胞的比例顯著高于治療前，說明308nm準(zhǔn)分子激光在治療皮損的同時(shí)，可望通過調(diào)節(jié)患者外周血Th17細(xì)胞與Treg細(xì)胞的比例，從而調(diào)節(jié)Th17/Treg細(xì)胞失衡達(dá)到治療銀屑病的目的。而尋常型銀屑病患者308nm準(zhǔn)分子激光治療后外周血Th17細(xì)胞的比例、Treg細(xì)胞的比例、Th17/Treg比值與正常對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明通過308nm準(zhǔn)分子激光對(duì)皮損處的治療，能有效地使致病T細(xì)胞凋亡，充分調(diào)動(dòng)Treg細(xì)胞抑制免疫反應(yīng)的功能，從而可望成為治療銀屑病的有效靶點(diǎn)。

綜上所述，若銀屑病患者Th17細(xì)胞異常活化，導(dǎo)致Th17細(xì)胞中的IL-23/Th17細(xì)胞軸、Th17相關(guān)細(xì)胞因子的異常表達(dá)，使致病細(xì)胞總體功能占優(yōu)勢(shì)；而Treg細(xì)胞由于各種原因使其不能有效地發(fā)揮抑制Th17細(xì)胞的功能，是誘發(fā)銀屑病的關(guān)鍵因素。故探討銀屑病中Th17和Treg細(xì)胞的相互調(diào)節(jié)機(jī)制，研究銀屑病患者308nm準(zhǔn)分子激光治療前后在調(diào)控Th17/Treg細(xì)胞表達(dá)失衡中的作用，從一定程度上可成為銀屑病治療的靶點(diǎn)。

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·論著·

資助項(xiàng)目：上海市科委課題（12411951702）和上海市衛(wèi)生局課題（20124126）

Imbalance of the Peripheral Blood Th17/Treg Cells in Patients with Psoriasis Vulgaris before and after the 308 nm Excimer Laser

Lu Jiajing，Ding Yangfeng，Yu Ning，Chen Fujuan，Zhang Yi，Yi Xuemei
Shanghai Skin Diseases Hospital，Shanghai 200443，China

Abstract：Objective In order to investigate the quantity of peripheral bloodThelper 17（Th17） and regulatory T（Treg） cells and the ratio of Th17/Treg in psoriasis vulgaris before and after the 308 nm excimer laser in order to analyze the role of Th17/Treg imbalance in the pathogenesis of psoriasis and its relationship with the disease severity. Methods Peripheral bloods were collected from 60 patients with psoriasis vulgaris and 20 normal human controls. The percentage of Th17 and Treg cells in peripheral blood and the ratio of Th17/Treg were determined by flow cytometry. Meanwhile the psoriasis area and severity index（PASI） scores was used to assess the disease severity in patients with psoriasis vulgaris. Results Compared with normal human controls， patients with psoriasis vulgaris before the 308 nm excimer laser showed higher level of Th17 cells in peripheral blood and the ratio of Th17/Treg （P＜0.01）， but the percentage of Treg cells was significantly lower （P＜0.01）. Patients with psoriasis vulgaris after the laser treatment showed lower level of Th17 cells in peripheral blood and the ratio of Th17/Treg compared with those before treatment（P＜0.01）， but the percentage of Treg cells was significantly higher （P＜0.01）. Compared with normal human controls， the ratio of Th17/Treg and the percentage of Th17 and Treg cells in patients with psoriasis vulgaris after the 308 nm excimer laser showedno statistically significant difference （P＞0.05）. The PASI score inpatients withpsoriasisvulgariswas positively correlated with the percentage of Th17 （P＜0.01）， but the percentage of Treg cells were unrelated to the PASI score （P＞0.05）.Conclusion The imbalance between Th17 and Treg cells may play an important role in the pathogenesis of psoriasis. Regulating the percentageofTh17 and Treg cells in peripheral bloodthrough308nmexcimer laser andtherebalance of the Th17/Treg cellsmay become anovel treatment of psoriasis.

Key words：Psoriasis；308 nm excimer 1aser；Th17/Treg imba1ance

收稿日期：（2015-07-28）

通信作者：易雪梅，E-mail：xuemei_yi@aliyun.com

中圖分類號(hào)：R758.63

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1672-0709（2016）02-0069-06