強(qiáng)燕，肖青青，迮侃，李福倫，馬天，李欣，李斌（.上海市松江區(qū)中心醫(yī)院，上海0600；.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽(yáng)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，上海00437）

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MMP-3和TIMP-1在不同類型慢性皮膚潰瘍創(chuàng)面表達(dá)研究

強(qiáng)燕1，肖青青2，迮侃2，李福倫2，馬天2，李欣2，李斌2
（1.上海市松江區(qū)中心醫(yī)院，上海201600；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽(yáng)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，上海200437）

摘要：目的觀察基質(zhì)金屬蛋白酶-3（MMP-3）和基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑-1（TIMP-1）蛋白在不同類型慢性皮膚潰瘍創(chuàng)面組織中的表達(dá)，探討其病理機(jī)制。方法以靜脈曲張性潰瘍、血管炎性潰瘍、壓力性潰瘍和壞疽性膿皮病患者及正常皮膚志愿者為研究對(duì)象，通過(guò)免疫組化法檢測(cè)MMP-3和TIMP-1蛋白在不同類型慢性皮膚潰瘍創(chuàng)面組織中的表達(dá)和分布規(guī)律。結(jié)果免疫組化顯示：MMP-3和TIMP-1蛋白均呈核表達(dá)，相比正常皮膚，靜脈曲張性潰瘍、血管炎性潰瘍和壓力性潰瘍MMP-3表達(dá)顯著升高（P＜0.05）；相比血管炎性潰瘍，靜脈曲張性潰瘍、壓力性潰瘍、壞疽性膿皮病和正常皮膚組織TIMP-1表達(dá)均降低（P＜0.05）。結(jié)論MMP-3和TIMP-1蛋白在不同類型慢性皮膚潰瘍創(chuàng)面組織中表達(dá)存在差異：靜脈曲張性潰瘍和壓力性潰瘍創(chuàng)面組織中，MMP-3表達(dá)上調(diào)，TIMP-1表達(dá)下調(diào)；在血管炎性潰瘍創(chuàng)面組織中TIMP-1表達(dá)上調(diào)。

關(guān)鍵詞：皮膚潰瘍；創(chuàng)面修復(fù)；基質(zhì)金屬蛋白酶-3；基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1

壓力性潰瘍、糖尿病潰瘍、靜脈曲張性潰瘍、血管炎性潰瘍等許多慢性皮膚潰瘍是臨床常見(jiàn)病、多發(fā)病，具有病因復(fù)雜，病程長(zhǎng)，愈后容易復(fù)發(fā)，治療費(fèi)用高等特點(diǎn)，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量，給家庭和社會(huì)帶來(lái)了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，已日益成為影響人民群眾健康的重要問(wèn)題之一。

慢性皮膚潰瘍創(chuàng)面修復(fù)涉及諸多因素。近來(lái)國(guó)內(nèi)外研究表明，基質(zhì)金屬蛋白酶（Matrixmeta11oproteinases，MMPs）是參與細(xì)胞外基質(zhì)（Extrace11u1ar matrix，ECM）降解的主要酶蛋白家族，在傷口愈合、血管增生等正常生理過(guò)程中，參與基質(zhì)蛋白的細(xì)胞外降解和分解，促使細(xì)胞穿越基底膜。ECM與創(chuàng)面成纖維細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞、增殖、遷移，以及毛發(fā)再生等關(guān)系密切，ECM的變化與重構(gòu)，多種基質(zhì)降解酶及其抑制酶的共同作用其蛋白水解是創(chuàng)面修復(fù)的關(guān)鍵［1-2］?；|(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑（Tissue inhibitor of meta11oproteinases，TIMPs）能特異性地抑制MMPs家族的活性，兩者之間的動(dòng)態(tài)平衡對(duì)創(chuàng)面修復(fù)起著至關(guān)重要作用［3］。本研究從ECM重構(gòu)角度，運(yùn)用免疫組化法測(cè)定不同類型慢性皮膚潰瘍患者創(chuàng)面組織中MMP-3和TIMP-1蛋白表達(dá)，分析、探討上述蛋白參與慢性皮膚潰瘍的病理過(guò)程，為進(jìn)一步臨床干預(yù)和治療提供理論依據(jù)。

1　資料與方法

1.1一般資料

1.1.1診斷標(biāo)準(zhǔn)參考普通高等中醫(yī)藥類規(guī)劃教材七版《中醫(yī)外科學(xué)》、國(guó)家中醫(yī)藥管理局1994-6-28發(fā)布的中華人民共和國(guó)中醫(yī)藥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)ZY/ T001 1-001.9-94、《中醫(yī)證候鑒別診斷學(xué)》（人民衛(wèi)生出版社，2002年9月版）和《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》（中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2002年5月版）制定標(biāo)準(zhǔn)：慢性皮膚潰瘍：皮膚破潰病程大于1個(gè)月。

1.1.2納入標(biāo)準(zhǔn)（1）符合診斷標(biāo)準(zhǔn)；（2）年齡≥18周歲且≤85周歲，男女不限；（3）瘡面面積≥1cm2，病程超過(guò)1個(gè)月；（4）知情同意，簽署知情同意書(shū)，并自愿受試。

1.1.3排除標(biāo)準(zhǔn)（1）不符合診斷標(biāo)準(zhǔn)和納入標(biāo)準(zhǔn)者；（2）妊娠或哺乳期婦女；（3）合并心腦血管、肝、腎、造血系統(tǒng)等原發(fā)性疾病，精神病患者；（4）合并嚴(yán)重感染者，結(jié)核病及創(chuàng)面局部有癌變（病理證實(shí)）傾向者。

1.1.4病例來(lái)源2011年1月—2013年12月上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽(yáng)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院、上海市松江區(qū)中心醫(yī)院門診及住院具有完整病史的慢性難愈性皮膚潰瘍患者：靜脈曲張性潰瘍5例、血管炎性潰瘍、壓力性潰瘍和壞疽性膿皮病各4例。4例正常皮膚源于正常志愿者。

1.2方法

1.2.1臨床標(biāo)本采集分別采集4種類型慢性皮膚潰瘍創(chuàng)面標(biāo)本和正常皮膚樣本，經(jīng)福爾馬林固定24 h后，乙醇梯度脫水、石蠟包埋，5 μm厚連續(xù)切片，用于免疫組化。

1.2.2主要試劑、儀器及設(shè)備抗體：MMP-3購(gòu)于EPITMICS公司，TIMP-1購(gòu)于Stanta Cruz Biotechno1ogy公司。儀器及設(shè)備：Leica超薄切片機(jī)（Jung RM2015，Leica）上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽(yáng)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院病理科提供；ImageJ 1.42q圖像分析軟件；OLYMPUS BH2顯微鏡；NIKON數(shù)碼相機(jī)。

1.2.3MMP-3、TIMP-1免疫組化檢測(cè)按照SABC免疫組化試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。石蠟切片常規(guī)脫蠟水化；甲醇50﹕1H2O2滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，室溫避光10min；切片經(jīng)ddH2O沖洗后，置于0.01mo1/L枸櫞酸鈉溶液微波加熱“3-5-3”法，進(jìn)行抗原修復(fù)；切片自然冷卻至室溫，PBST浸泡5min，PBS沖洗2min×3次，分別滴加抗MMP-3和TIMP-1單克隆抗體，4℃冰箱過(guò)夜；次日PBST再次洗滌2min×3次；滴加二抗生物素，室溫孵化30min；顯微鏡下DAB顯色，陽(yáng)性反應(yīng)為切片中出現(xiàn)黃褐色顯影，蒸餾水沖洗，終止反應(yīng)。蘇木精襯染，中性樹(shù)膠封固。已知陽(yáng)性切片為陽(yáng)性對(duì)照，以1×PBS代替血清為陰性對(duì)照。

1.2.4結(jié)果檢測(cè)免疫組化染色陽(yáng)性反應(yīng)為黃棕色顆粒且明顯高于背景染色。2人雙盲法觀察切片，在10×40倍光鏡下觀察10個(gè)陽(yáng)性細(xì)胞較多的視野，計(jì)算其平均數(shù)，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，共計(jì)1000個(gè)細(xì)胞。根據(jù)染色陽(yáng)性細(xì)胞占細(xì)胞的百分比，將結(jié)果分為：染色陽(yáng)性細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)1%～10%為+，11%～50%為++，51%～75%為+++，大于75%為++++。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 14.0 for Windows軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。定性資料采用卡方檢驗(yàn)或精確概率法。假設(shè)檢驗(yàn)統(tǒng)一使用雙側(cè)檢驗(yàn)，給出檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量及其對(duì)應(yīng)的P值，以P＜0.05作為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1MMP-3蛋白在不同類型患者創(chuàng)面中的表達(dá)實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)靜脈曲張性潰瘍見(jiàn)圖1，血管炎性潰瘍見(jiàn)圖2，壓力性潰瘍見(jiàn)圖3，壞疽性膿皮病患者創(chuàng)面組織見(jiàn)圖4，正常皮膚組織見(jiàn)圖5。進(jìn)行MMP-3免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：MMP-3蛋白主要定位在表皮棘層鱗狀上皮和創(chuàng)面愈合組織增生的皮膚全層，棕黃色顆粒主要位于細(xì)胞核，即呈核表達(dá)，正常組織真皮、皮下組織未見(jiàn)表達(dá)。不同組織MMP-3表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）：正常皮膚組織中MMP-3蛋白表達(dá)呈陰性（陽(yáng)性率0%），顯著低于靜脈曲張性潰瘍（陽(yáng)性率100%）、血管炎性潰瘍（陽(yáng)性率75%）和壓力性潰瘍（陽(yáng)性率100%）。見(jiàn)表1。

2.2TIMP-1蛋白在不同類型患者創(chuàng)面中的表達(dá)實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)靜脈曲張性潰瘍見(jiàn)圖6，血管炎性潰瘍見(jiàn)圖7，壓力性潰瘍見(jiàn)圖8，壞疽性膿皮病患者創(chuàng)面組織見(jiàn)圖9及正常皮膚組織見(jiàn)圖10。進(jìn)行TIMP-1免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：TIMP-1蛋白主要定位在表皮棘層鱗狀上皮和創(chuàng)面愈合組織增生的皮膚全層，棕黃色顆粒主要位于細(xì)胞核，即呈核表達(dá)，正常組織真皮、皮下組織未見(jiàn)表達(dá)。免疫組化結(jié)果與TIMP-1為MMPs家族抑制劑預(yù)期基本相符。不同組織TIMP-1表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）：血管炎性潰瘍創(chuàng)面組織中TIMP-1蛋白表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性（陽(yáng)性率100%），高于靜脈曲張性潰瘍（陽(yáng)性率60%）、壓力性潰瘍（陽(yáng)性率50%）、壞疽性膿皮?。?yáng)性率25%）和正常皮膚組織（陽(yáng)性率75%）。見(jiàn)表2。

表1　MMP-3蛋白在不同類型創(chuàng)面中的表達(dá)例

表2　TIMP-1蛋白在不同類型患者創(chuàng)面中的表達(dá)例

3　討論

圖1　MMP3蛋白在靜脈曲張性潰瘍創(chuàng)面組織的表達(dá)

圖2　MMP3蛋白在血管炎性潰瘍創(chuàng)面組織的表達(dá)

圖3　MMP3蛋白在壓力性潰瘍創(chuàng)面組織的表達(dá)

圖4　MMP3蛋白在壞疽性膿皮病創(chuàng)面組織的表達(dá)

圖5　MMP3蛋白在正常皮膚組織的表達(dá)

圖6　TIMP-1蛋白在靜脈曲張性潰瘍創(chuàng)面組織的表達(dá)

圖7　TIMP-1蛋白在血管炎性潰瘍創(chuàng)面組織的表達(dá)

圖8　TIMP-1蛋白在壓力性潰瘍創(chuàng)面組織的表達(dá)

圖9　TIMP-1蛋白在壞疽性膿皮病創(chuàng)面組織的表達(dá)

圖10　TIMP-1蛋白在正常皮膚組織的表達(dá)

MMP-3也稱基質(zhì)溶素-1（Strome1ysin-1）或前明膠酶（Proge1atinase），屬于MMPs家族中基質(zhì)降解酶，對(duì)Zn2+依賴的蛋白酶。MMP-3能夠降解多種ECM成分，參與組織形態(tài)發(fā)生、創(chuàng)面修復(fù)、炎癥反應(yīng)等生理、病理過(guò)程，其水解底物包括Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅸ型膠原，蛋白聚糖、纖維連接蛋白、層粘連蛋白、彈性蛋白等，是一種重要的細(xì)胞外基質(zhì)調(diào)節(jié)酶［3］。MMPs的激活是導(dǎo)致ECM降解的關(guān)鍵步驟，MMP-3能通過(guò)水解各種ECM成分而激活其他的MMPs（如MMP1、7、8、13等）［4-5］，因而被認(rèn)為其在MMPs的生物活性中起始動(dòng)作用，進(jìn)而在創(chuàng)傷修復(fù)的基質(zhì)重構(gòu)中發(fā)揮重要功能。MMP-3的表達(dá)可見(jiàn)于組織創(chuàng)傷后的不同時(shí)間段，有研究顯示甚至在創(chuàng)傷后28d仍可檢測(cè)到MMP-3的表達(dá)［6］，表明MMP-3不僅參與了ECM降解，而且也與創(chuàng)面修復(fù)、ECM重塑和組織改建密切相關(guān)。本研究證實(shí)，相比正常皮膚組織，靜脈曲張性潰瘍、血管炎性潰瘍和壓力性潰瘍MMP-3表達(dá)顯著升高（P＜0.05），表明靜脈曲張性潰瘍、血管炎性潰瘍和壓力性潰瘍病理狀態(tài)下，創(chuàng)面組織MMP-3活性顯著增加。

TIMPs是一組低分子質(zhì)量的蛋白，廣泛分布于組織和體液中，可由成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等產(chǎn)生。目前報(bào)道的TIMPs家族成員至少有4種：TIMP-1，TIMP-2，TIMP-3，TIMP-4。TIMPs是組織中MMPs主要的內(nèi)源性抑制因子，能特異性抑制MMPs家族的基質(zhì)降解酶。有研究發(fā)現(xiàn)，TIMP-1能被多種細(xì)胞因子誘導(dǎo)產(chǎn)生，以可逆的非共價(jià)鍵形式按1﹕1比例與MMP-3結(jié)合成復(fù)合物，TIMP-1可抑制幾乎所有MMPs，尤其是MMP-9的活性［7-8］，而由于MMPs間存在交叉激活現(xiàn)象，MMP-3是pro-MMP-9最有效和體內(nèi)天然的活化劑，因此在炎癥過(guò)程中，MMP-9的激活依賴于MMP-3，當(dāng)pro-MMP-9與TIMP-1結(jié)合成復(fù)合物時(shí)，則能激活某些基質(zhì)，進(jìn)而特異性、可逆性抑制其活性，使ECM處于動(dòng)態(tài)平衡中。此外，TIMPs是多功能分子，不僅具有細(xì)胞生長(zhǎng)因子樣作用，還有促進(jìn)成纖維細(xì)胞增生及膠原合成使ECM沉積并抑制其降解，調(diào)控ECM代謝和抑制血管的生成等作用。而細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子和激素則通過(guò)復(fù)雜的途徑調(diào)節(jié)MMPs及其相應(yīng)的TIMPs的表達(dá)。有研究發(fā)現(xiàn)MMP-3可激活白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）活性的調(diào)節(jié)，反之這些酶也能使細(xì)胞因子失活［9］，因此，MMP-3可能參與慢性炎癥中IL-1β活性調(diào)節(jié)進(jìn)而影響創(chuàng)傷愈合延遲或纖維化等。本研究證實(shí)，相比血管炎性潰瘍，靜脈曲張性潰瘍、壓力性潰瘍和壞疽性膿皮病TIMP-1表達(dá)均顯著降低（P＜0.05），提示血管炎性潰瘍創(chuàng)面修復(fù)過(guò)程中ECM的積聚、沉積得到抑制，可能是其難以愈合的因素之一。

盡管MMP-3和TIMP-1在慢性皮膚潰瘍中相互關(guān)系已有諸多研究報(bào)道，但是本研究對(duì)不同類型慢性皮膚潰瘍進(jìn)行分類，觀測(cè)其表達(dá)差異，從而為進(jìn)一步臨床干預(yù)和治療提供理論依據(jù)，指導(dǎo)臨床治療提供科學(xué)依據(jù)。本研究證實(shí)了MMP-3與TIMP-1在不同類型慢性皮膚潰瘍創(chuàng)面組織中存在差異：靜脈曲張性潰瘍和壓力性潰瘍創(chuàng)面組織中，MMP-3上調(diào)，TIMP-1表達(dá)下調(diào)；而在血管炎性潰瘍創(chuàng)面組織中TIMP-1表達(dá)上調(diào)，與Cook等［10］體外研究的急性潰瘍創(chuàng)面的表達(dá)一致，王一飛等［11］在進(jìn)一步研究中醫(yī)藥?kù)铕錾》▽?duì)糖尿病大鼠皮膚潰瘍模型的調(diào)控機(jī)制研究中，亦證實(shí)了使用不同比例的祛瘀生肌中藥組方能夠調(diào)控MMP-3和T1MP-1的之間的平衡。綜上所述，研究MMP-3及其組織抑制劑TIMP-1的平衡調(diào)節(jié)機(jī)制，將有助于進(jìn)一步臨床治療干預(yù)，提高創(chuàng)面修復(fù)質(zhì)量。

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·論著·

資助項(xiàng)目：1.國(guó)家中醫(yī)藥管理局資助“十二五”中醫(yī)藥重點(diǎn)學(xué)科—中醫(yī)皮膚病學(xué)；2.國(guó)家中醫(yī)藥管理局資助“十二五”重點(diǎn)專科—皮膚科；3.上海市科學(xué)技術(shù)委員會(huì)項(xiàng)目，NO.12401903500，16QA1403800；4.上海市衛(wèi)計(jì)委中醫(yī)藥事業(yè)發(fā)展三年行動(dòng)計(jì)劃ZY3-CCCX-1-1008，ZYSNXD-CC-ZDYJ018；5.國(guó)家自然基金項(xiàng)目（81373648）；6.上海市松江區(qū)公共衛(wèi)生合作科研項(xiàng)目2014-11

Expression of MMP-3 and TIMP-1 in Skin Lesions of Chronic Cutaneous Ulcers

Qiang Yan1，Xiao Qingqing2，Ze Kan2，Li Fulun2，Ma Tian2，Li Xin2，Li Bin2
1.Central Hospital of Songjiang District，Shanghai 201600，China；2.Yueyang Hospital of Integrative Traditional Chinese and Western Medicine Affiliated to Shanghai TCM University，Shanghai 200437，China

Abstract：Objective In order to compare the expression and distribution patterns of matrix meta11oproteinases-3（MMP-3）and tissue inhibitor of meta11oproteinases-1（TIMP-1），and to investigate the patho1ogica1 mechanism in different subtypes of chronic cutaneous u1cers. Methods Using immunohistochemistry to detect the expression and distribution patterns of MMP-3 and TIMP-1 in skin 1esions of varicose u1cer，vascu1itic u1cer，pressure u1cer，pyoderma gangrenosum and hea1th contro1. Results Immunohistochemistry tests showed MMP-3 and TIMP-1 expressed in nuc1ei. The expression of MMP-3 in varicose u1cer，vascu1itic u1cer and pressure u1cer were significant1y higher than that in hea1th contro1s（P＜0.05）. The expression of TIMP-1 in varicose u1cer，pressure u1cer，pyoderma gangrenosum and hea1th contro1 were significant1y 1ower than that in vascu1itic u1cer（P＜0.05）. Conclusion MMP-3 and TIMP-1 expression are different between skin 1esions of different chronic cutaneous u1cers. In varicose u1cer and pressure u1cer，the expression of MMP-3 are increased，the expression of TIMP-1 are decreased；in vascu1itic u1cer，the expression of TIMP-1 is increased.

Key words：Cutaneous u1cers；Wound repair；Matrix meta11oproteinases-3；Tissue inhibitor of meta11oproteinases-1

收稿日期：（2016-01-03）

通信作者：李欣，E-mail：13661956326@163.com

中圖分類號(hào)：R751.05

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1672-0709（2016）02-0074-05