葉樂(lè)馳，鄭春曉，金約朋，白永愉，李強(qiáng)，周蒙滔

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，浙江 溫州 325000，1.腫瘤外科；2.肝膽外科）

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區(qū)域動(dòng)脈灌注5-FU誘導(dǎo)大鼠急性胰腺炎腺泡細(xì)胞凋亡及Caspase-3表達(dá)

葉樂(lè)馳1，鄭春曉2，金約朋2，白永愉2，李強(qiáng)2，周蒙滔2

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，浙江 溫州 325000，1.腫瘤外科；2.肝膽外科）

［摘 要］目的 探討區(qū)域動(dòng)脈灌注（regional arterial infusion，RAI）5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）對(duì)大鼠急性胰腺炎（acute pancreatitis，AP）胰腺腺泡細(xì)胞凋亡的影響及其對(duì)急性胰腺炎的治療作用。方法 18只健康成年SD大鼠隨機(jī)分成3組：對(duì)照組（C組）、急性胰腺炎組（AP組）和5-FU治療組（5-FU組）。各組均行胃左動(dòng)脈置管，AP組和5-FU組以大劑量雨蛙素（每小時(shí)腹腔注射50 μg/kg，連續(xù)6 h）誘導(dǎo)建立大鼠急性胰腺炎模型，對(duì)照組注射同等劑量的生理鹽水。5-FU組在第一次腹腔注射雨蛙素1 h后立即區(qū)域動(dòng)脈灌注5-FU（40 mg/kg）治療，C組和AP組區(qū)域動(dòng)脈灌注等量的生理鹽水。建模成功后3 h取標(biāo)本并處死大鼠，檢測(cè)血淀粉酶濃度，RT-PCR法檢測(cè)胰腺組織內(nèi)TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表達(dá)水平，胰腺標(biāo)本送病理學(xué)檢查，Western blotting法檢測(cè)胰腺組cleaved Caspase-3的蛋白表達(dá)，同時(shí)TUNEL法檢測(cè)大鼠胰腺腺泡細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果 與AP組比較，5-FU組血淀粉酶濃度明顯降低（P＜0.05）；胰腺組織內(nèi)TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表達(dá)水平下降（P＜0.05）；胰腺組織病理學(xué)改變減輕；胰腺組織cleaved Caspase-3的蛋白表達(dá)增加；胰腺腺泡細(xì)胞凋亡增加（P＜0.05）。結(jié)論 區(qū)域動(dòng)脈灌注5-FU對(duì)大鼠急性胰腺炎有改善作用，其作用機(jī)制可能與誘導(dǎo)胰腺腺泡細(xì)胞凋亡有關(guān)。

［關(guān)鍵詞］急性胰腺炎；凋亡；5-氟尿嘧啶；區(qū)域動(dòng)脈灌注；雨蛙素；大鼠

盡管近年來(lái)針對(duì)急性胰腺炎（AP）的治療有所改進(jìn)，但病死率高、并發(fā)癥多、治療費(fèi)用高昂的治療現(xiàn)狀仍未見(jiàn)明顯改觀［1］。5-FU治療AP取得了肯定的療效［2-6］，但是缺乏深入的機(jī)制研究。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立雨蛙素誘導(dǎo)的大鼠AP模型，從胰腺腺泡細(xì)胞凋亡的角度去探討5-FU對(duì)AP的治療機(jī)制。

1　材料和方法

1.1材料和試劑

清潔級(jí)健康成年雄性SD大鼠，體重250～300 g，購(gòu)于溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。5-FU注射液（天津金耀氨基酸有限公司）；雨蛙素（美國(guó)Sigma公司）；亞甲蘭染色液、HE染色劑（北京索萊寶科技有限公司）；戊巴比妥鈉（上海試劑總公司）；PE10導(dǎo)管（寧波安萊軟件與器械有限公司），大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6引物序列（上海生工合成）。

1.2動(dòng)物分組與建模

雄性SD大鼠18只，術(shù)前禁食12 h，不禁水。常規(guī)1.5%戊巴比妥鈉針（1 mg/kg）腹部皮下注射麻醉。三組均麻醉后開(kāi)腹，行胃左動(dòng)脈置管［7］后引出體外固定，術(shù)后5 h清醒后誘導(dǎo)胰腺炎模型。（1）對(duì)照組（C組）：給予腹腔內(nèi)注射等量的生理鹽水；（2）急性胰腺炎組（AP組）：依照Bhatia等［8］方法建立大鼠AP模型，大劑量雨蛙素（caerulein）50 μg/kg，每隔1 h腹腔注射，連續(xù)6 h，總計(jì)6次，誘導(dǎo)建立大鼠急性胰腺炎模型；（3）5-FU治療組（5-FU組）：同上雨蛙素制模，第1次雨蛙素皮下注射后1 h，行5-FU胃左動(dòng)脈區(qū)域動(dòng)脈灌注。5-FU動(dòng)脈灌注劑量40 mg/kg，灌注速度6.0 mL/h。C組和AP組相同的時(shí)間給予胃左動(dòng)脈灌注等量的生理鹽水。大鼠清醒后自由飲水，禁食。

1.3標(biāo)本采集及指標(biāo)檢測(cè)

各組建模完成后3 h，分別再次麻醉大鼠，抽血、取標(biāo)本，檢測(cè)如下指標(biāo)：（1）血清淀粉酶，采用日本Beckman Coulter全自動(dòng)生化儀檢測(cè)；（2）RT-PCR法檢測(cè)胰腺組織內(nèi)TNF-α，IL-1β，IL-6 mRNA表達(dá)水平。TNF-α上游引物序列5′-ACTGAACTTCGGGGTGATTGG-3′，下游引物序列5′-GCTTGGTGGTTTGCTACGAC-3′；IL-1β

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2　結(jié)果

2.1胰腺組織光鏡觀察

光鏡下，C組大鼠胰腺結(jié)構(gòu)基本正常。AP組胰腺腺體結(jié)構(gòu)紊亂，胰腺間質(zhì)水腫，部分腺泡細(xì)胞空泡化，伴有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。5-FU組較AP組胰腺間質(zhì)水腫、腺泡細(xì)胞空泡化、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)均明顯減輕，圖1。

2.2胰腺組織病理學(xué)評(píng)分

AP組胰腺病理學(xué)評(píng)分最高，提示胰腺的損傷最嚴(yán)重。區(qū)域動(dòng)脈灌注5-FU后，胰腺病理?yè)p傷程度減輕，病理學(xué)評(píng)分減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。5-FU組血清淀粉酶濃度較AP組有明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。具體見(jiàn)表1。

2.3胰腺組織TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表達(dá)水平

采用RT-PCR法檢測(cè)胰腺組織TNF-α，IL-1β，IL-6 mRNA表達(dá)水平。與C組比較，AP組和5-FU組胰腺組織內(nèi)TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表達(dá)水平均明顯的升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。5-FU組胰腺組上游引物序列5′-CACCTTCTTTTCCTTCATCTTTG-3′，下游引物序列5′-GTCGTTGCTTGTCTCTCCTTGTA-3′；IL-6上游引物序列5′-TGATGGATGCTTCCAAACTGGA-3′，下游引物序列5′-GAGCATTGGAAGTTGGGGTA-3′；內(nèi)參為大鼠GAPDH。（3）取部分胰腺置于4%多聚甲醛溶液中固定用于HE染色。HE染色法觀察胰腺組織改變；（4）采用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)dUTP缺口末端標(biāo)記（TUNEL）法檢測(cè)細(xì)胞凋亡。凋亡指數(shù)（apoptotic index，AI）計(jì)算方法：取4個(gè)高倍鏡視野，每個(gè)視野中計(jì)算250個(gè)腺泡中凋亡細(xì)胞數(shù)，AI=（凋亡細(xì)胞總數(shù)/1 000）×100%；（5）Western blotting法檢測(cè)胰腺組織cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平；（6）按照Schmidt標(biāo)準(zhǔn)［9］對(duì)胰腺進(jìn)行病理評(píng)分，由有經(jīng)驗(yàn)的病理科醫(yī)師雙盲進(jìn)行評(píng)分，根據(jù)胰腺間質(zhì)水腫、腺泡細(xì)胞壞死、出血和脂肪壞死、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)進(jìn)行評(píng)分，每項(xiàng)按照嚴(yán)重程度分別評(píng)分為0～4分?？桾NF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表達(dá)水平較AP組明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

圖1　大鼠胰腺組織光鏡觀察（HE，×200）

表1　各組胰腺病理學(xué)評(píng)分和血淀粉酶濃度

表2　各組胰腺組織TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA的表達(dá)水平

2.4胰腺腺泡細(xì)胞凋亡的改變

TUNEL法檢測(cè)胰腺腺泡細(xì)胞的凋亡，細(xì)胞核中深褐色的胰腺腺泡細(xì)胞為凋亡的細(xì)胞。各組的胰腺腺泡細(xì)胞凋亡指數(shù)（%）分別如下：C組（0.37±0.082）較少發(fā)生凋亡，凋亡指數(shù)低；AP組（1.12±0.26）凋亡指數(shù)較C組明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）；5-FU組（2.5±0.39）胰腺腺泡細(xì)胞凋亡較AP組明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖2。

2.5胰腺組織Caspase-3蛋白表達(dá)的變化

采用Western blotting法檢測(cè)胰腺組織cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)，結(jié)果如圖3所示。AP組中Caspase-3水平明顯高于C組，而5-FU組中Caspase-3水平較AP組明顯升高。該結(jié)果提示胃左動(dòng)脈區(qū)域動(dòng)脈灌注5-FU后Caspase-3表達(dá)增加。

圖2　大鼠胰腺TUNEL法顯示胰腺腺泡細(xì)胞的凋亡（TUNEL，×100）

圖3　胰腺組織Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)情況

3　討論

胰腺腺泡細(xì)胞病理?yè)p害的結(jié)果主要有凋亡和壞死兩種［10］。發(fā)生AP后，若胰腺腺泡壞死，細(xì)胞內(nèi)多種胰酶成分被釋放，可導(dǎo)致胰腺局部強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)進(jìn)而激活全身炎癥系統(tǒng)，從而誘發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征（systemic inflammatory reaction syndrome，SIRS）。若胰腺腺泡細(xì)胞凋亡，由于細(xì)胞膜的完整性，使得腺泡細(xì)胞內(nèi)的胰酶成分不外泄，則不伴有或僅有輕微的炎癥反應(yīng)，引起的胰腺炎病變亦較輕，也不致發(fā)生SIRS。胰腺腺泡的損害方式（凋亡或壞死）決定了炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的程度。壞死可促進(jìn)炎癥細(xì)胞的聚集和激活，釋放炎癥介質(zhì)，誘發(fā)“瀑布樣”的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，加重胰腺炎；凋亡有利于限制炎癥的過(guò)度激活［10］。因此，如果我們能夠誘導(dǎo)胰腺腺泡細(xì)胞發(fā)生凋亡，減少壞死，則有可能抑制炎癥反應(yīng)的的啟動(dòng)及其引發(fā)的SIRS。

自上世紀(jì)70年代5-FU就被用于治療AP［11-12］，療效肯定［2-6，13］。研究發(fā)現(xiàn)，5-FU以線粒體依賴和非依賴途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡均伴隨Caspase-3活化［14］，進(jìn)而激活下游的酶和蛋白，引起細(xì)胞凋亡。與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果與此相一致，區(qū)域動(dòng)脈灌注5-FU伴隨胰腺腺泡細(xì)胞Caspase-3的激活和胰腺腺泡的凋亡。

我們采用區(qū)域動(dòng)脈灌注5-FU的方法作為誘導(dǎo)胰腺局部腺泡細(xì)胞凋亡的手段，除上述5-FU能誘導(dǎo)凋亡的原因之外，主要考慮區(qū)域動(dòng)脈灌注途徑能大幅提高胰腺組織局部藥物濃度而不相應(yīng)增加其全身毒副作用的優(yōu)點(diǎn)［3］。Cao Y等［14］證實(shí)誘導(dǎo)胰腺腺泡細(xì)胞凋亡有利于減輕AP的嚴(yán)重程度。Orabi等［15］在大鼠胰腺炎模型中發(fā)現(xiàn)：腺泡細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)胰腺炎相對(duì)較輕，認(rèn)為凋亡可使胰腺腺泡細(xì)胞免除壞死，減低AP的嚴(yán)重性。由此看來(lái)，胰腺腺泡細(xì)胞的凋亡對(duì)AP病程進(jìn)展是一種有益的反應(yīng)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，區(qū)域動(dòng)脈灌注5-FU可降低AP大鼠血淀粉酶濃度和胰腺組織TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表達(dá)水平，減輕胰腺病理?yè)p傷，說(shuō)明通過(guò)區(qū)域動(dòng)脈灌注5-FU對(duì)雨蛙素誘導(dǎo)的AP起到治療作用。區(qū)域動(dòng)脈灌注5-FU使得胰腺腺泡細(xì)胞Caspase-3表達(dá)增加。區(qū)域動(dòng)脈灌注5-FU使得胰腺腺泡細(xì)胞的凋亡增加。凋亡是細(xì)胞主動(dòng)的死亡，是有基因控制的細(xì)胞程序性死亡。Caspase家族成員在凋亡的過(guò)程中起到了關(guān)鍵作用，其中Caspase-3是細(xì)胞凋亡過(guò)程中最主要的終末剪切酶，它在凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的許多途徑中發(fā)揮功能［16-17］。結(jié)合我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，推測(cè)5-FU可能通過(guò)增加Caspase-3表達(dá)，誘導(dǎo)胰腺腺泡細(xì)胞凋亡增加，進(jìn)而對(duì)AP起到治療作用。

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（本文編輯：張和，魯翠濤）

·論著 基礎(chǔ)研究·

Effect of 5-fluorouracil administered with regional arterial infusion on pancreatic acinar cell apoptosis and expression of Caspase-3 in rats with acute pancreatitis

YE Le-chi1， ZHENG Chunxiao2， JIN Yue-peng2， BAI Yong-yu2， LI qiang2， ZHOU Meng-tao2.1Department of Oncological Surgery；2Department of Hepatobiliary Surgery， The First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University， Wenzhou， Zhejiang 325000， China

AbstractObjective To assess the effects of 5-fluorouracil （5-FU） administered with regional arterial infusion （RAI） on pancreatic acinar cell apoptosis of acute pancreatitis （AP） and its effect on AP in rats. Methods Eighteen male Sprague-Dawley （SD） rats were randomly divided into 3 groups: control group （C group）， acute pancreatitis group （AP group）， and the 5-FU treatment group （5-FU group）. A catheter was inserted through the left gastric artery in all the three groups. AP model was induced by hourly intraperitoneal injections of saline containing a supramaximally stimulating dose of caerulein （50 μg/kg） for 6 h. 5-FU （40 mg/kg） was administered with RAI to the 5-FU group following 1 h after the first intraperitoneal injection of caerulein. Saline was administered with the same doses to the other two groups. Serum amylase activity and mRNA levels of TNF-α， IL-1β，IL-6 in pancreatic tissues were measured with RT-PCR at 3 h following the induction of AP. The pathological changes in the pancreas tissues were observed and scored. Protein expression of cleaved Caspase-3 in pancreatic tissues was measured with Western blotting analysis. Apoptosis was quantified by TUNEL assay. Results Compared with the AP group， the serum amylase activity， the mRNA levels of TNF-α， IL-1β， IL-6 in pancreatic tissues and the pathological scores of pancreas in the 5-FU group decreased significantly （P＜0.05）. Expression of cleaved Caspase-3 in pancreatic tissues and pancreatic acinar cell apoptosis in the 5-FU group increased sig-book=206,ebook=35nificantly than that in the AP group （P＜0.05）. Conclusion RAI with 5-FU has beneficial effects on AP rats， the underlying mechanism is possibly related to indue pancreatic acinar cell apoptosis.

Key wordsacute pancreatitis； apoptosis； 5-fluorouracil； regional arterial infusion； caerulein； rats

［通訊作者簡(jiǎn)介］周蒙滔，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，E-mail：zmt0417@hotmail.com。

［第一作者簡(jiǎn)介］葉樂(lè)馳（1979-），男，浙江溫州人，主治醫(yī)師，博士。

［基金項(xiàng)目］浙江省自然科學(xué)基金（LY12H03007）；國(guó)家自然科學(xué)基金（81370563）；浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生重大科技計(jì)劃（WKJ2012-2-033）；浙江省科技廳公益性應(yīng)用項(xiàng)目（2012C23108））；溫州市科技局項(xiàng)目（H20110016）。

［收稿日期］2015-12-24

［中圖分類號(hào)］R576

［文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼］A

DOI：10.11952/j.issn.1007-1954.2016.03.008