張彥亮， 吳會玲， 岳巧艷， 宋 爽， 宋 希， 陶 臻

南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院感染科(南京市第一醫(yī)院)，江蘇 南京 210006

論著·肝臟相關(guān)疾病

小干擾RNA沉默IKK/NF-κB信號通路對HSC-T6細(xì)胞凋亡的影響

張彥亮， 吳會玲， 岳巧艷， 宋 爽， 宋 希， 陶 臻

南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院感染科(南京市第一醫(yī)院)，江蘇 南京 210006

目的 研究小干擾RNA(siRNA)沉默IKK/NF-κB信號通路對于肝星狀細(xì)胞株HSC-T6凋亡的影響。方法 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫IKKβ的cDNA序列,設(shè)計構(gòu)建合成IKKβsiRNA，采用陽性脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，設(shè)立空白對照組、陰性對照組及siRNA實驗組，采用TUNEL法和流式細(xì)胞儀Annexin-V/PI雙染法測定IKKβsiRNA轉(zhuǎn)染后24 h、48 h和72 h細(xì)胞凋亡率，同時采用Western blotting檢測NF-κB P65、Bcl-2、Bax和Caspase3的蛋白表達(dá)情況。結(jié)果 與空白對照組和陰性對照組相比，實驗組24 h、48 h和72 h HSC-T6細(xì)胞凋亡率均顯著增加(P<0.05)，且具有時間依賴性；實驗組的NF-κB P65及Bcl-2蛋白的表達(dá)均明顯升高，而Caspase3和Bax則顯著增加，與空白對照和陰性對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 SiRNA沉默IKK/NF-κB信號通路能夠下調(diào)NF-κB P65的表達(dá)，同時提高Bax和Caspase3的表達(dá)，促進(jìn)HSC-T6凋亡，這種肝星狀細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)具有潛在的逆轉(zhuǎn)肝纖維化的治療作用。

小干擾RNA；肝纖維化；肝星狀細(xì)胞；IKK/NF-κB信號通路；凋亡

肝纖維化是各種病因引起的肝臟慢性進(jìn)行性的病理過程，肝纖維化的效應(yīng)細(xì)胞肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell, HSC)的激活、增殖并產(chǎn)生分泌大量ECM是肝纖維化形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，已有多個研究顯示通過誘導(dǎo)活化的HSC發(fā)生凋亡能夠逆轉(zhuǎn)肝纖維化過程。因此筆者利用體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，采用小干擾RNA(siRNA)抑制肝星狀細(xì)胞株HSC-T6中IKKβ基因的表達(dá)，沉默IKK/NF-κB(nucler factor-kappaB, 核因子κB)信號通路，研究其對HSC-T6細(xì)胞凋亡的影響，為臨床肝纖維化逆轉(zhuǎn)治療探索新的靶點和方法。

1 材料與方法

1.1 材料 大鼠肝星狀細(xì)胞株HSC-T6購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；脂質(zhì)體Lipofectamine 2000、TRIzol購自美國 Invitrogen公司；RPMI-164購自美國 GIBCO公司；DMSO(溶解Formazan結(jié)晶)購自中國上海久億化學(xué)試劑有限公司，cDNA第一鏈合成試劑盒及Taq DNA Polymerase均購自美國 Thermo Fisher公司；Agarose購自西班牙Biowest 公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組：HSC-T6細(xì)胞含10%胎牛血清及100 U/ml青霉素的DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行傳代培養(yǎng)。實驗時分為空白對照組、陰性對照組、IKKβsiRNA轉(zhuǎn)染實驗組。

1.2.2 設(shè)計構(gòu)建合成IKKβsiRNA：通過NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫搜索IKKβ的cDNA序列, 按照siRNA設(shè)計原則設(shè)計合成IKKβsiRNA，采用RT-PCR檢測siRNA表達(dá)對IKKβ基因表達(dá)的影響，選取抑制效率最佳的IKKβsiRNA用于實驗(RNA合成由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，引物合成由南京金斯瑞科技有限公司)。SiRNA-1014：S：5′-CCCUCGAUGACAUCUUGAAUU-3′；AS：3′-UUGGGAGCUACUGUAGAACUU-5′。

1.2.3 轉(zhuǎn)染IKKβsiRNA：轉(zhuǎn)染接種適當(dāng)數(shù)量的細(xì)胞至細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔中加入不含抗生素的培養(yǎng)基，使轉(zhuǎn)染時的細(xì)胞密度能夠達(dá)到50%～60%；用250 μl不含血清培養(yǎng)基Opti-MEM稀釋20 μmol/L的貯存液輕輕混勻，室溫孵育5 min；用250 μl不含血清培養(yǎng)基Opti-MEM稀釋5 μl lipo2000，輕輕混勻并室溫孵育5 min；將兩者輕輕混勻，室溫孵育20 min；將siRNA-lipo2000混合液加入含有細(xì)胞的500 μl培養(yǎng)基的培養(yǎng)孔中，輕輕混勻培養(yǎng)4～6 h 后，將孔中含siRNA-lipo2000混合液的培養(yǎng)基移去，更換新鮮培養(yǎng)基置于37 ℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.4 Annexin-V/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡：將對數(shù)生長期的細(xì)胞消化接種到60 mm培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后，根據(jù)組別設(shè)置加入相應(yīng)的含藥培養(yǎng)基，同時設(shè)立陰性對照組。作用24 h、48 h、72 h后，用0.25%胰酶(不含EDTA)消化收集細(xì)胞洗滌離心收集5×105個細(xì)胞； 加入500 μl的Binding Buffer懸浮細(xì)胞；加入5 μl Annexin V-FITC混勻后，再加入5 μl Propidium Iodide，混勻反應(yīng)5～15 min后用流式細(xì)胞儀檢測(Ex=488 nm; Em=530 nm)細(xì)胞凋亡的情況。再次收集5×105個細(xì)胞的單細(xì)胞懸液用體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇固定2 h(或過夜)，4 ℃保存后洗滌；加100 μl RNase A 37 ℃水浴30 min，再加入400 μl PI染色混勻，4 ℃避光30 min后上機(jī)檢測，記錄激發(fā)波長488 nm處紅色熒光。

1.2.5 TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡：預(yù)處理細(xì)胞后加1%的Triton-100使之通透，經(jīng)過PBS浸泡洗滌3次后加3% H2O2甲醇溶液對酶進(jìn)行滅活，重復(fù)洗滌。在每個樣本中滴加100 μl TdT酶反應(yīng)液，避光濕潤37 ℃反應(yīng)1 h后洗滌。滴加100 μl Streptavadin-HRP，避光濕潤37 ℃反應(yīng)30 min。DAB法顯色，終止顯色后復(fù)染并封片，使用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察，選取10個高倍視野，每個視野計數(shù)300個細(xì)胞，計算3 000個細(xì)胞中陽性細(xì)胞所占的比例，即凋亡率。

1.2.6 Western blotting檢測凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)：提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，經(jīng)12%聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后轉(zhuǎn)移至NC膜上，5%脫脂奶粉封閉1.5～2 h 后，分別用一抗和二抗進(jìn)行反應(yīng)后與免疫印跡化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)反應(yīng)。X線片曝光、顯影、定影后分析表達(dá)情況，計算凋亡指數(shù)(AI)：細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)=凋亡細(xì)胞數(shù)÷細(xì)胞總數(shù)×100%。

2 結(jié)果

2.1 Annexin-V/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡 空白對照組24 h、48 h、72 h的凋亡率分別為(2.38±0.25)%、(3.86±0.37)%、(4.62±0.35)%；陰性對照組分別為(3.65±0.41)%、(3.95±0.81)%、(5.53±0.85)%；實驗組分別為(9.24±2.32)%、(19.35±4.15)%、(27.33±7.37)%，實驗組與其他兩組3個時間點比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=14.21,P<0.05;F=25.32,P<0.05，見圖1)。

2.2 TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡 空白對照組24 h、48 h、72 h的凋亡率分別為(5.29±0.72)%、(7.29±0.98)%、(10.76±1.53)%；陰性對照組分別為(6.25±1.38)%、(7.96±1.56)%、(9.6±2.15)%；實驗組分別為(15.18±3.96)%、(24.48±5.12)%、(31.44±5.25)%，實驗組與其他兩組3個時間點比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=21.79,P<0.05;F=41.21,P<0.01，見圖2)。

2.3 Western blotting檢測凋亡相關(guān)蛋白表達(dá) IKKβsiRNA干預(yù)后實驗組的NF-κB P65及Bcl-2蛋白表達(dá)明顯減少， 而Caspase3和Bax蛋白表達(dá)則有顯著增加，且這種效應(yīng)具有時間相關(guān)性，與空白對照組和陰性對照組比較4種凋亡相關(guān)蛋白差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=31.7,P<0.05)，兩對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),而實驗組在3個時間點與兩對照組比較4種凋亡蛋白表達(dá)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見圖3、4)。

圖1 Annexin V/PI檢測HSC-T6細(xì)胞凋亡 A:空白對照組；B:陰性對照組；C:SiRNA實驗組

Fig 1 Apoptosis rate of HSC-T6 cells detected by AnnexinV/PI double staining A: blank control group; B: negative control group; C: experimental group

圖2 TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡 A:空白對照組; B:陰性對照組; C:siRNA實驗組

Fig 2 Apoptosis rate detected by TUNEL staining A: blank control group; B: negative control group; C: experimental group

注：與空白對照組比較, *P<0.05；與陰性對照組比較, △P<0.05。

圖3 IKKβsiRNA對HSC-T6相關(guān)凋亡蛋白表達(dá)的影響

Fig 3 Effect of IKKβsiRNA on the expression of HSC-T6 related apoptosis protein

注：A:空白對照組；B:陰性對照組；C:SiRNA實驗組；1：24 h; 2:48 h; 3:72 h。

圖4 IKKβsiRNA對HSC-T6相關(guān)凋亡蛋白表達(dá)的影響

Fig 4 Effect of IKKβ siRNA on the expression of HSC-T6 related apoptosis protein

3 討論

在肝纖維化的病理機(jī)制中,大量激活的HSC起主導(dǎo)作用,目前認(rèn)為激活的HSC有4種去向：(1)由激活型轉(zhuǎn)變回靜止型；(2)發(fā)生細(xì)胞凋亡；(3)免疫清除；(4)衰老[1]。其中凋亡途徑不但可以減少激活增殖HSC 數(shù)量,也不引起溶酶體等細(xì)胞器的破壞,且凋亡的細(xì)胞可在數(shù)小時內(nèi)被周圍的內(nèi)皮細(xì)胞或枯否細(xì)胞吞噬, 因而很少引起微環(huán)境的炎癥損傷,是一種理想的清除HSC 的方式，多個研究顯示如能誘導(dǎo)HSC凋亡則能夠逆轉(zhuǎn)肝纖維化的病理過程[2-3]。

多個研究表明NF-κB具有抗凋亡作用，在靜息狀態(tài)下其與抑制蛋白IκB結(jié)合呈無活性狀態(tài)，當(dāng)受內(nèi)毒素、TNF等外界信號刺激后, IκB在蛋白激酶IKK的作用下發(fā)生磷酸化降解, NF-κB由胞質(zhì)迅速移位至胞核, 與特異性κB序列結(jié)合, 誘導(dǎo)抗凋亡相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮抗凋亡效應(yīng)[4-5]。而IKK復(fù)合體(IκB 激酶)是NF-κB 信號通路的主要調(diào)節(jié)物，它由3個亞基組成，其中IKKβ尤為重要，將鼠的IKKβ基因敲除后, NF-κB活化受到嚴(yán)重抑制，鼠胚胎時期即會死亡, 并會由于肝臟細(xì)胞發(fā)生凋亡而表現(xiàn)出肝臟退化病變。已有實驗研究證明，將NF-κB基因敲除能顯著促進(jìn)HSC的凋亡并減少細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生[6-7]。研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素和丹皮酚等中藥單體均能夠顯著抑制肝星狀細(xì)胞的NF-κB的活化，從而使活化的肝星狀細(xì)胞凋亡增加，發(fā)揮其抗纖維化效應(yīng)[6-7]。學(xué)者Oakley等[8]采用選擇性的NF-κB抑制劑柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine，SASP)進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SASP在體內(nèi)和體外實驗均能誘導(dǎo)HSC凋亡，減少細(xì)胞基質(zhì)的合成。

本研究通過構(gòu)建siRNAIKKβ沉默HSC-T6 IKK/NF-κB信號通路，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NF-κB P65蛋白表達(dá)水平明顯降低，同時流式細(xì)胞儀Annexin V/PI雙染法和Tunel法檢測均顯示實驗組HSC-T6細(xì)胞凋亡率顯著增加，與空白對照組及陰性對照組比較有顯著性差異，由此可見抑制NF-κB的活化能顯著增加肝星狀細(xì)胞的凋亡，這與在腫瘤、腎臟病領(lǐng)域的研究相類似[7-8]。同時Western blotting結(jié)果顯示實驗組凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2的表達(dá)明顯下降，而Caspase3和Bax蛋白表達(dá)則顯著增加，與對照組相比均有顯著性差異(P<0.05)，且這種效應(yīng)具有時間相關(guān)性，由此可見IKK/NF-κB信號通路對細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用系通過調(diào)節(jié)相關(guān)凋亡、抗凋亡蛋白的表達(dá)來實現(xiàn)，阻斷其通路能誘導(dǎo)促凋亡蛋白Bax和Caspase3表達(dá)的增加，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

由此可見肝纖維化過程中，IKK/NF-κB信號通路扮演著重要的角色，其能抑制HSC的凋亡，使得活化的HSC數(shù)量維持在高水平狀態(tài)，最終導(dǎo)致肝臟內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)的異常沉積發(fā)展成為肝纖維化甚至肝硬化，沉默其信號通路則能夠顯著抑制NF-κB活性，從而促進(jìn)HSC的凋亡，將有可能成為逆轉(zhuǎn)肝纖維化，以IKK/NF-κB信號通路為靶點的治療策略具有非常好的臨床應(yīng)用前景。

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(責(zé)任編輯：王全楚)

Effects of small interfering RNA silencing IKK/NF-κB on the apoptosis of HSC-T6

ZHANG Yanliang, WU Huiling, YUE Qiaoyan, SONG Shuang, SONG Xi, TAO Zhen

Department of Infectious Disease, Nanjing First Hospital, Nanjing Medical University, Nanjing 210006, China

Objective To investigate the effects of small interfering RNA (siRNA) silencing IKK/NF-κB on the apoptosis of hepate stellate cell line T6 (HSC-T6). Methods Chemically synthesized siRNA directed against IKKβ was transfected into HSC-T6 by cationic liposome Lipofectamine. The cells were divided into blank control group, negative control group and experimental group. TUNEL staining and AnnexinV/PI double staining with Flow cytometry (FCM) were used to detect the apoptosis rate of the cells at 24 hours,48 hours, 72 hours. The protein levels of NF-κB P65, Bcl-2, Bax and Caspase3 were analyzed by Western blotting. Results Compared with the negative control group and blank control group, the apoptosis rate in experimental group was increased significantly with time (P<0.05). In the experimental group, the expressions of NF-κB P65 and Bcl-2 were decreased significantly, while the expressions of Caspase and Bax were increased compared with the negative control group and blank control group (P<0.05). Conclusion SiRNA silencing IKK/NF-κB can down-regulate the expression of NF-κB P65, while can increase the expressions of Bax and Caspase3, by which can promote apoptosis of HSC-T6. This may be a potential strategy for the reverse effect of hepatic fibrosis.

SiRNA; Liver fibrosis; Hepatic stellate cell; IKK/NF-κB signal pathway; Aptoptosis

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.11.013

南京市衛(wèi)生科技發(fā)展項目 (QYK11173)

張彥亮，副主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，研究方向：復(fù)雜疑難重癥感染性疾病。E-mail: swinburn@163.com

陶臻，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，研究方向：呼吸系統(tǒng)感染性疾病。E-mail: tz1010@126.com

R575

A

1006-5709(2016)11-1258-04

2016-02-15