顏秋霞陳潤(rùn)強(qiáng)周秀琴陳彩蓉郭曉燕趙曉英蔡志明唐愛(ài)發(fā)馬 義

1. 廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第六醫(yī)院，清遠(yuǎn)市人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心（清遠(yuǎn) 511518）；

2. 暨南大學(xué)生物醫(yī)藥研究院/細(xì)胞生物學(xué)系，廣東省生物工程藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；

3. 深圳市第二人民醫(yī)院暨深圳大學(xué)第一附屬醫(yī)院科教科

·研究簡(jiǎn)報(bào)·

睪丸體積、卵泡刺激素和精漿中性α-糖苷酶在無(wú)精子癥分型診斷中的應(yīng)用*

顏秋霞1,2陳潤(rùn)強(qiáng)1周秀琴1陳彩蓉1郭曉燕1趙曉英1蔡志明3唐愛(ài)發(fā)3馬 義2**

1. 廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第六醫(yī)院，清遠(yuǎn)市人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心（清遠(yuǎn) 511518）；

2. 暨南大學(xué)生物醫(yī)藥研究院/細(xì)胞生物學(xué)系，廣東省生物工程藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；

3. 深圳市第二人民醫(yī)院暨深圳大學(xué)第一附屬醫(yī)院科教科

世界范圍內(nèi)不孕不育人口約占育齡夫婦的15%，無(wú)精子癥是男性不育癥中較為嚴(yán)重的一種類型，占男性不育的10%~ 20%[1]。無(wú)精子癥分為梗阻性無(wú)精子癥（obstructive azoospermia，OA）和非梗阻性無(wú)精子癥（non-obstructive azoospermia，NOA）[2]兩種。以往鑒別無(wú)精子癥類型主要通過(guò)睪丸活檢、陰囊探查和輸精管造影等有創(chuàng)方法，其臨床應(yīng)用受到制約。因此，尋找無(wú)創(chuàng)、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的無(wú)精子癥分型的診斷方法實(shí)屬必要。睪丸體積[3]、血清生殖激素[4,5]和精漿生化[6,7]檢測(cè)，因其方便快捷、經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的特點(diǎn)，近年來(lái)在男性不育臨床治療中逐漸被重視。本研究采用睪丸體積測(cè)量、血清卵泡刺激素（FSH）和精漿中性α-糖苷酶（NAG）3項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合對(duì)無(wú)精子癥患者做OA和NOA的分型診斷，探討無(wú)創(chuàng)技術(shù)在無(wú)精子癥鑒別診斷中的應(yīng)用價(jià)值。

材料與方法

一、材料

選擇2013年1月至2015年12月在我院生殖中心就診的47例無(wú)精子癥患者，年齡18~44歲，平均（32.00±6.01）歲。常規(guī)詢問(wèn)病史、生殖系統(tǒng)體檢，排除患有生殖系統(tǒng)感染、隱睪、精索靜脈曲張、染色體異常等疾病者。按照第五版世界衛(wèi)生組織（WHO5）標(biāo)準(zhǔn)[8]，標(biāo)本經(jīng)過(guò)3次以上精液常規(guī)檢查，3 000×g，離心15min后沉淀物在顯微鏡下未發(fā)現(xiàn)精子，確定為無(wú)精子癥。除此以外，所有47例無(wú)精子癥患者均經(jīng)過(guò)睪丸活檢臨床確診為26例梗阻性無(wú)精子癥和21例非梗阻性無(wú)精子癥。同時(shí)選擇30例正常對(duì)照組，年齡22~ 42歲，平均（31.47±5.28）歲，按照WHO5精液分析標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)，精液各項(xiàng)參數(shù)均為正常的已生育至少一個(gè)健康子女的健康男性。

二、方法

（一）睪丸體積測(cè)量

嚴(yán)格按照《WHO男性不育標(biāo)準(zhǔn)化診療手冊(cè)》[2]的要求和方法，室溫下，患者取站立位，采用弗安企業(yè)生產(chǎn)的睪丸體積測(cè)量器進(jìn)行雙側(cè)睪丸體積測(cè)量，睪丸體積在2個(gè)實(shí)木丸之間者采用小的實(shí)木丸的體積計(jì)算。均未行內(nèi)分泌治療。

（二）睪丸活檢

常規(guī)消毒，鋪洞巾，2%利多卡因精索阻滯，左手無(wú)名指和中指固定于活檢對(duì)側(cè)，使活檢側(cè)陰囊皮膚處于緊張狀態(tài)；左手拇指和食指緊拈于睪丸中部，對(duì)沖活檢壓力，右手持輸精管分離鉗在精索阻滯時(shí)的針眼處緩慢分離皮膚及皮下組織達(dá)睪丸白膜，繼續(xù)鈍性摩擦白膜，使白膜漸薄，有突破感時(shí)，輸精管分離鉗已進(jìn)入睪丸，鉗夾少許睪丸組織送實(shí)驗(yàn)室鏡檢。術(shù)畢，輕壓片刻止血。

（三）精漿NAG檢測(cè)

禁欲2~7d后手淫取精于專用的一次性取精容器內(nèi)，放置在37℃恒溫平板上液化，然后以3 000×g，離心15min，留取上層精漿，分裝后-20℃保存，避免標(biāo)本反復(fù)凍融。采用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)精漿NAG含量，試劑為深圳華康生物醫(yī)學(xué)工程有限公司產(chǎn)品，檢測(cè)儀器為Rayto公司RT-6000酶標(biāo)分析儀，實(shí)驗(yàn)操作依照試劑盒說(shuō)明書；精漿中性α-葡萄糖苷酶正常參考值為≥20mU/一次射精[7]。

（四）血清FSH、LH和T檢測(cè)

檢測(cè)前3個(gè)月內(nèi)未服用激素類藥物，上午8~ 10時(shí)抽取受檢者肘靜脈血5mL，分離血清，采用貝克曼DXI800全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀檢測(cè)，試劑盒為羅氏公司試劑。我院男性生殖激素的正常參考范圍為：卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH）1.5~12.4 IU/L，黃體生成素（luteinising hormone，LH）1.7~8.6 IU/L，睪酮（testosterone，T）8.64~29.0 nmol /L。

（五） 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、年齡、睪丸體積和NAG在3組患者中的比較

3組患者的年齡差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。OA患者與正常對(duì)照組的睪丸體積比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而NOA組患者的睪丸體積明顯比OA組和正常對(duì)照組小，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。OA和NOA組NAG含量均低于正常對(duì)照組（P＜0.01），且OA組較NOA組更低（P＜0.01）見(jiàn)表1。

表1 3組患者的年齡、睪丸體積、精漿NAG的比較（±s）

表1 3組患者的年齡、睪丸體積、精漿NAG的比較（±s）

注：與NOA組比較，*為P＜0.01；與N組比較，▲為P＜0.01

年齡(歲)組別 例數(shù)(n)睪丸體積(mL) NAG (mU/一次射精) N組 30 31.47±5.28 16.17±3.21*74.58±17.57 OA組 26 32.77±5.65 16.15±3.23*7.91±5.58▲*NOA組 21 31.05±6.45 7.86±1.82 43.14±17.36▲

二、血清生殖激素檢測(cè)結(jié)果

OA和NOA組FSH和LH含量均高于正常對(duì)照組（P＜0.01），且NOA組較OA組血清FSH和LH水平明顯增高（P＜0.01）。NOA組的T明顯低于OA組和正常對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）見(jiàn)表2。

表2 3組患者血清中FSH、LH和T的比較（±s）

表2 3組患者血清中FSH、LH和T的比較（±s）

注：與N組比較，*為P＜0.01；與NOA組比較，▲為P＜0.01

組別 例數(shù)(n) FSH(IU/L) LH(IU/L) T( nmol/L) N組 30 4.57±1.51 4.52±1.37 15.54±6.15▲OA組 26 15.69±7.52*▲6.68±1.29*▲14.08±5.05▲NOA組 21 30.55±8.13*9.87±2.13*11.37±5.98

三、利用ROC曲線優(yōu)選睪丸體積和FSH水平的切點(diǎn)值

假設(shè)以睪丸活檢結(jié)果作為“金標(biāo)準(zhǔn)”，優(yōu)選睪丸體積和FSH水平作為鑒別OA與NOA的切點(diǎn)值。以睪丸活檢為狀態(tài)變量、分別以睪丸體積和FSH水平為檢驗(yàn)變量建立ROC曲線，見(jiàn)圖1和圖2。利用ROC曲線分析各切點(diǎn)的敏感度和特異性。當(dāng)睪丸體積切點(diǎn)值為13.5mL時(shí)，其敏感度和特異性分別是84.6%和95.2%；當(dāng)FSH的切點(diǎn)值為15.85 IU/L，其敏感度和特異性分別是80.8%和90.5%。睪丸體積的ROC曲線下的面積（AUC）為0.971，表明其診斷準(zhǔn)確性較高；FSH水平ROC曲線的AUC為0.872，表明其診斷準(zhǔn)確性中等；另外，NAG、LH、T等的AUC為均小于0.7，表明其診斷準(zhǔn)確性較低。本研究結(jié)果提示睪丸體積比FSH 水平的診斷準(zhǔn)確性更高，預(yù)測(cè)價(jià)值更大。

圖1 睪丸體積診斷OA與NOA時(shí)的ROC曲線

圖2 血清

FSH 診斷OA與NOA時(shí)的ROC曲線

討 論

精液由精漿與精子構(gòu)成，精漿由精囊、前列腺、附睪和尿道球腺產(chǎn)生的分泌物組成。精液中任何附屬性腺分泌物的總量反映該腺體的整體分泌功能。精漿生化標(biāo)志物在輸送過(guò)程中可被其組織水平以下的病變（附性腺及輸送管道的缺如、阻塞等）所阻斷，其含量變化可作為鑒別無(wú)精子癥和輸精管道梗阻部位的依據(jù)。精漿生化檢測(cè)已成為OA定位診斷的重要輔助手段。精漿生化檢測(cè)指標(biāo)中，中性α-葡糖苷酶被認(rèn)為是附睪的特異性酶。人體精液中有6種葡糖苷酶，其中中性α-葡糖苷酶絕大部分來(lái)自于附睪，被認(rèn)為是附睪的特異性酶[9]。中性α-葡糖苷酶在附睪的頭、體、尾部均有分泌，其活性最高的部分位于睪丸輸出小管至附睪的移行區(qū)域[10]。很多研究發(fā)現(xiàn)雙側(cè)輸精管及雙側(cè)附睪尾部梗阻患者的精漿中性α-葡糖苷酶水平均明顯下降[9,10]。袁謙等[11]研究認(rèn)為精漿NAG與附睪梗阻部位具有顯著相關(guān)性，可用于判斷附睪的梗阻部位、手術(shù)愈后和縮短探查手術(shù)時(shí)間，具有較大的臨床指導(dǎo)意義。本研究結(jié)果表明，OA和NOA組NAG含量均低于正常對(duì)照組（P＜0.01），且OA組較NOA組更低，說(shuō)明附睪特異性NAG下降與無(wú)精子癥的類型有關(guān)系。

下丘腦-垂體-睪丸軸在精子的發(fā)生與調(diào)控中起到重要作用，其相互作用維持著正常的男性生殖內(nèi)分泌及睪丸功能，任何因素引起生殖激素改變都會(huì)影響男性的生育能力。下丘腦分泌的促性腺激素釋放激素（GnRH）作用于腦垂體, 使其合成和分泌FSH、LH。FSH的作用主要是促進(jìn)精母細(xì)胞發(fā)育成精子細(xì)胞和成熟精子。睪丸的生精功能發(fā)生障礙時(shí)，生精細(xì)胞因?yàn)榘l(fā)育阻滯而停留在精子發(fā)生的某一發(fā)育階段，F(xiàn)SH值會(huì)有所改變[12]。FSH受睪丸支持細(xì)胞分泌的抑制素（inhibin）的負(fù)反饋調(diào)節(jié)，當(dāng)睪丸上皮細(xì)胞正常時(shí)，支持細(xì)胞分泌的inhibin抑制FSH的分泌，使FSH維持在正常水平；無(wú)精子癥患者存在睪丸發(fā)育不良、生精細(xì)胞發(fā)育不良和纖維組織化等病理改變，生精小管上皮受損和支持細(xì)胞被破壞，使得inhibin分泌減少，導(dǎo)致FSH水平升高，從而引起NOA[13]。血液FSH水平能反映睪丸的生精情況，F(xiàn)SH 水平超過(guò)正常水平2倍以上的大部分患者存在睪丸生精障礙[14]。LH 的主要作用是促進(jìn)睪丸間質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)，促其合成和分泌睪酮（T），促進(jìn)T擴(kuò)散入生精小管，供精子生成所需。T由間質(zhì)細(xì)胞合成分泌，是生精過(guò)程中的主要調(diào)節(jié)激素，約占人體雄激素的95%。T通過(guò)反饋調(diào)節(jié)抑制垂體和下丘腦, 使LH分泌減少[15]。因此, 檢測(cè)生殖激素可反映下丘腦-垂體-睪丸軸的生精功能。

無(wú)精子癥按照病因分為OA和NOA。前者是睪丸有正常的生精功能，但因精子通路阻塞導(dǎo)致精子無(wú)法正常排出；后者通常指睪丸生精功能障礙，不能產(chǎn)生或只能產(chǎn)生極少量精子，導(dǎo)致精液中無(wú)精子。由于睪丸生精功能異常導(dǎo)致無(wú)精子癥伴有血清生殖激素水平的紊亂，通過(guò)對(duì)無(wú)精子癥血清生殖激素水平的分析，判斷其睪丸功能是否受到損傷及其程度。張雅君等[16]認(rèn)為當(dāng) FSH＞17.63U/L也可以作為臨床睪丸穿刺處理的一個(gè)預(yù)測(cè)指標(biāo)；馮科等[17]發(fā)現(xiàn)在各個(gè)參數(shù)中FSH 對(duì)預(yù)測(cè)NOA患者睪丸內(nèi)是否存在精子價(jià)值最大，通過(guò)ROC曲線分析其切點(diǎn)值為13.31 IU/L，大于此值即認(rèn)為睪丸內(nèi)無(wú)可利用精子，小于此值認(rèn)為睪丸內(nèi)能發(fā)現(xiàn)可利用精子，其敏感度為74.1%，特異性為96. 2%。本研究顯示，梗阻性和非梗阻性無(wú)精子癥組FSH和LH含量均高于正常對(duì)照組, 且非梗阻性無(wú)精子癥組較梗阻性無(wú)精子癥組血清FSH和LH水平明顯增高，T含量明顯降低，提示血清生殖激素可作為反映睪丸生精功能損傷程度的指標(biāo)，其中FSH區(qū)分OA和NOA更為明確。本文采用ROC曲線分析，當(dāng)FSH的切點(diǎn)值為15.85 IU/L，診斷為梗阻性無(wú)精子癥的靈敏度和特異度分別是80.8%和90.5%。

睪丸體積測(cè)定在鑒別OA和NOA中同樣起著重要的作用。睪丸是男性性腺，是產(chǎn)生精子和雄性激素的場(chǎng)所，睪丸大小是睪丸發(fā)育是否正常的重要標(biāo)志。一般認(rèn)為測(cè)量睪丸容積可大約估計(jì)睪丸生精小管的發(fā)育情況，初步判斷其生精功能。有研究指出睪丸體積和血清FSH結(jié)合對(duì)于預(yù)測(cè)非梗阻性無(wú)精和睪丸穿刺取精結(jié)果有重要意義，并且睪丸體積診斷準(zhǔn)確性明顯優(yōu)于FSH[18]；桂文武等[19]報(bào)道， 經(jīng)皮附睪穿刺取精術(shù)（ Percutaneous epididymal sperm aspiration，PESA ）和睪丸細(xì)針穿刺抽吸術(shù)（ Testicular sperm aspiration，TESA ）聯(lián)合睪丸體積、血清FSH水平，對(duì)無(wú)精子癥進(jìn)行診斷符合率為91.3%，是診斷無(wú)精子癥的可靠方法。唐文豪等[20]研究顯示，睪丸體積、FSH 水平與TESA 結(jié)果分別呈顯著的正相關(guān)和負(fù)相關(guān)（P均＜0.001）。因此，臨床工作中確實(shí)可以使用睪丸體積、FSH水平判斷睪丸生精功能狀況。本研究結(jié)果顯示，正常對(duì)照組和OA患者的睪丸體積正常，而NOA患者的睪丸明顯偏小且質(zhì)地軟，表明睪丸組織生精功能狀態(tài)損害的嚴(yán)重程度與睪丸體積有關(guān)。當(dāng)睪丸體積切點(diǎn)值為13.5mL時(shí)，其靈敏度和特異度分別是84.6%和95.2%，睪丸體積的ROC曲線下的面積（AUC）為0.971，表明其診斷準(zhǔn)確性較高，而FSH水平ROC曲線的AUC為0.872，表明其診斷準(zhǔn)確性中等。綜上所述，本研究的結(jié)論與其他多數(shù)研究是一致的，即睪丸體積、FSH 水平和NAG水平對(duì)于鑒別OA與NOA有重要的參考價(jià)值，并且睪丸體積診斷準(zhǔn)確性明顯優(yōu)于FSH和NAG，參考價(jià)值更大。目前報(bào)道較多的無(wú)創(chuàng)性診斷指標(biāo)有睪丸體積、FSH及抑制素B等，但預(yù)測(cè)的效果并不理想，且存在較大爭(zhēng)議（可能與不同研究納入標(biāo)準(zhǔn)不同或樣本量較小有關(guān)），聯(lián)合指標(biāo)預(yù)測(cè)可能成為今后研究的方向。

總之，聯(lián)合應(yīng)用睪丸體積、FSH和精漿NAG等無(wú)創(chuàng)技術(shù)，為無(wú)精子癥鑒別診斷提供了一種經(jīng)濟(jì)、快速、無(wú)創(chuàng)的有效指標(biāo)，對(duì)于區(qū)分OA與NOA以及OA中梗阻部位的判定具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。

無(wú)精子癥; 睪丸體積; 卵泡刺激素; α葡糖苷酶類

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（2016-11-05收稿）

10.3969/j.issn.1008-0848.2016.12.011

R698.2

資助： 清遠(yuǎn)市科技計(jì)劃項(xiàng)目資助（2014B012）；廣東省醫(yī)學(xué)科研基金資助（B2014426）；國(guó)家自然科學(xué)基金資助（81270740）；深圳市戰(zhàn)略新興產(chǎn)業(yè)發(fā)展專項(xiàng)基金（JSGG20160301162913683）；深圳市知識(shí)創(chuàng)新計(jì)劃基礎(chǔ)研究項(xiàng)目（JCYJ20140416180323426）**

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