李元迎（河北省農(nóng)林科學(xué)院獸藥新產(chǎn)品研發(fā)中心，河北石家莊050071）

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綠汁發(fā)酵液在飼草青貯中的應(yīng)用研究

李元迎
（河北省農(nóng)林科學(xué)院獸藥新產(chǎn)品研發(fā)中心，河北石家莊050071）

摘要：綠汁發(fā)酵液作為一種天然、無(wú)毒的青貯添加劑加工簡(jiǎn)單，經(jīng)濟(jì)環(huán)保。本文根據(jù)近幾年的研究，對(duì)綠汁發(fā)酵液的制作方法、作用機(jī)理以及應(yīng)用進(jìn)展等進(jìn)行了綜述。

關(guān)鍵詞：綠汁發(fā)酵液；青貯；發(fā)酵

飼料青貯是指將切碎到一定長(zhǎng)度的青綠飼料在缺氧的條件下發(fā)酵而使飼草保持多汁狀態(tài)的一種調(diào)制技術(shù)，經(jīng)過(guò)青貯的飼料具有適口性好、可長(zhǎng)期保存、寄生蟲(chóng)危害減少等優(yōu)點(diǎn)。飼料青貯在反芻動(dòng)物養(yǎng)殖中占有重要地位并被廣泛應(yīng)用。為了更好地獲得優(yōu)質(zhì)青貯飼料，人們?cè)谇噘A時(shí)往往會(huì)添加一些發(fā)酵添加劑，比如乳酸菌制劑、有機(jī)酸、綠汁發(fā)酵液（PFJ）等，其中PFJ作為一種天然、無(wú)毒的青貯添加劑得到了廣泛推廣。

1　什么是PFJ

綠汁發(fā)酵液（PFJ）是將植物勻漿后，利用植物自身附著的乳酸菌在厭氧環(huán)境中將植物綠汁進(jìn)行發(fā)酵而制成的一種青貯添加劑，具有經(jīng)濟(jì)環(huán)保、制作工藝流程簡(jiǎn)單、生產(chǎn)成本低等特點(diǎn)，且比專(zhuān)門(mén)的乳酸菌制劑穩(wěn)定，不受牧草生長(zhǎng)季節(jié)、含水率及發(fā)酵溫度的影響［1］。廣義的綠汁發(fā)酵液是指將原料的新鮮葉片、莖桿全株切碎或勻漿在適宜的溫度下經(jīng)過(guò)一段時(shí)間厭氧發(fā)酵調(diào)制而成；狹義的綠汁發(fā)酵液特指由苜蓿鮮草汁發(fā)酵而成［2］。

2　PFJ制作方法

各種植物的PFJ制作方法基本相同，但是根據(jù)不同的青貯對(duì)象，研究者提供了具有細(xì)微差別的制作方法，以下是文獻(xiàn)報(bào)道的幾種制作方法：

2.1扁穗牛鞭草PFJ的制作方法［3］選取刈割拔節(jié)期的扁穗牛鞭草，將其切成2～3cm長(zhǎng)的碎段，取20g加入40mL蒸餾水中，用搗碎機(jī)攪拌1min。然后用2～4層紗布將榨汁液過(guò)濾，濾液放入?yún)捬醢l(fā)酵罐內(nèi)，加入2%的葡萄糖（濃度為20～40g/L）后密封，30℃厭氧培養(yǎng)48h。

2.2藏蒿草PFJ的制作方法［4］將藏蒿草50g分別切碎至1cm，加250mL水浸泡30min，在搗碎機(jī)中磨碎攪拌，用兩層紗布過(guò)濾，得藏蒿草綠汁液。以2%濃度加入蔗糖，用食用白米醋，調(diào)節(jié)發(fā)酵原液的pH值至4.2，放入1 L棕色玻璃瓶?jī)?nèi)，密封，30℃避光發(fā)酵2d，除去沉淀物，收集上面的棕色液體即得綠汁發(fā)酵液（PFJ）。

2.3其他制作方法艾比布拉·伊馬木等［4］報(bào)道，制作青貯前兩天，分別刈割無(wú)倒伏、干凈的苜蓿和蘇丹草頂端部分，用剪刀切成2～5 cm，混勻，稱(chēng)取200 g，加等量蒸餾水，用家用打漿機(jī)制漿，然后用兩層紗布過(guò)濾榨汁，再加2%砂糖，倒入棕色瓶子在暗處厭氧發(fā)酵2 d即可制成。陸銀等［2］報(bào)道，將苜蓿草樣200g和水600mL攪拌混勻后，雙層紗布過(guò)濾，取濾液500mL加入葡萄糖20g，在30℃下厭氧發(fā)酵2d即可制成苜蓿PFJ。

另?yè)?jù)許慶方等［5］報(bào)道，在制作PFJ時(shí)不必先加入白醋調(diào)整pH值。唐維新［6］報(bào)道，葡萄糖添加量在0.5～5g/100mL范圍內(nèi)用量越高促發(fā)酵效果越明顯，綜合評(píng)定認(rèn)為取葡萄糖中等水平添加組（2g/100mL）作苜蓿青貯添加劑是較為合適的。黃興軍［7］報(bào)道，2g/100mL蔗糖添加量的發(fā)酵環(huán)境是乳酸菌生長(zhǎng)的理想環(huán)境，所以制作綠汁發(fā)酵液的最佳組合是：每100mL綠汁發(fā)酵液添加2g蔗糖和2倍水，發(fā)酵48h。

3　PFJ的作用機(jī)理

青飼料在青貯過(guò)程中經(jīng)過(guò)壓實(shí)密封，與外部環(huán)境中的氧氣隔絕。在這種環(huán)境下，尚未死亡的植物細(xì)胞繼續(xù)呼吸，消耗青貯環(huán)境中的氧氣，釋放二氧化碳和水，同時(shí)附著在青貯牧草表面的霉菌、酵母菌、腸道桿菌等需氧微生物利用殘存的氧氣進(jìn)行活動(dòng)，產(chǎn)生乳酸和二氧化碳，二氧化碳進(jìn)一步加速環(huán)境缺氧。當(dāng)厭氧環(huán)境形成后，乳酸菌開(kāi)始大量繁殖，產(chǎn)生大量的乳酸，使飼料內(nèi)環(huán)境呈弱酸性（pH值3.5～4.2），有效地抑制其他微生物生長(zhǎng)。最后乳酸菌的活動(dòng)也被自身產(chǎn)生的乳酸抑制，發(fā)酵過(guò)程停止，青貯飼料進(jìn)入酸性厭氧環(huán)境而利于儲(chǔ)藏。上述是正常青貯的過(guò)程。

由于自然條件下一般牧草及作物附著的乳酸菌數(shù)量不足，故發(fā)酵過(guò)程緩慢。當(dāng)把青貯原料粉碎制成PFJ后，乳酸菌數(shù)量急劇增加，與原料相比可增加3～4個(gè)數(shù)量級(jí)，pH值下降到4.0以下［2］，當(dāng)添加PFJ后青貯，就會(huì)大大增加青貯發(fā)酵初期的乳酸菌數(shù)目，從而確保乳酸菌迅速生長(zhǎng)繁殖，使青貯中乳酸發(fā)酵占主導(dǎo)地位，并以絕對(duì)的強(qiáng)勢(shì)壓倒或抑制其他有害微生物的生長(zhǎng)繁殖［8］。所以，在青貯時(shí)加入PFJ可有效提高乳酸菌的濃度，加快青貯的制備過(guò)程。

4　PFJ的應(yīng)用

陳國(guó)富等［8］報(bào)道，以2 mL/kg濃度添加PFJ能改善靈芝菌糟發(fā)酵飼料的發(fā)酵品質(zhì)，提高化學(xué)成分。李富國(guó)等［10］報(bào)道以2 L/t濃度添加PFJ能夠降低青貯pH值以及氨態(tài)氮占總氮的比例，提高乳酸含量，降低乙酸、丁酸含量，并認(rèn)為添加綠汁發(fā)酵液和脫氫乙酸鈉可進(jìn)一步改善水稻秸青貯的青貯品質(zhì)，提高其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。朱小清等［11］在稻草青貯中的PFJ用量為2 mL/kg；葉杭等［12-13］在香蕉莖和香蕉葉青貯中的PFJ用量也是2mL/kg。

PFJ的使用劑量也有其他不同的報(bào)道，如莊益芬等［14］在玉米秸稈青貯中的用量為2%；林仕欣等［15］在飼用甜高粱青貯中的用量為5mL/kg；舒思敏等［3］在扁穗牛鞭草青貯中的用量為5mL/kg。

綠汁發(fā)酵液作為一種純天然生物添加劑，在飼草青貯中具有效果好、經(jīng)濟(jì)、環(huán)保、無(wú)殘留等優(yōu)點(diǎn)，隨著對(duì)青貯飼料的研究深入，PFJ的應(yīng)用將越來(lái)越廣泛。

參考文獻(xiàn)：

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3.4無(wú)菌檢驗(yàn)按照現(xiàn)行《中華人民共和國(guó)獸藥典》附錄進(jìn)行檢驗(yàn)，接種后10d之內(nèi)應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。

3.5Eg85含量檢驗(yàn)按照羊棘球蚴（包蟲(chóng)）病基因工程亞單位疫苗質(zhì)量檢驗(yàn)操作方法中“SDS-PAGE膠的制備和電泳方法”及“用密度分析法定量測(cè)定抗原含量”進(jìn)行，保護(hù)性抗原Eg85占總蛋白的百分含量應(yīng)≥15%，每頭份疫苗保護(hù)性抗原Eg85的含量應(yīng)≥50μg。

3.6成品安全與效力檢驗(yàn)每批次疫苗生產(chǎn)后，都要進(jìn)行安全評(píng)價(jià)與效力評(píng)價(jià)。

3.6.1安全評(píng)價(jià)方法將4周齡的羔羊分成4組，每組5只，每只羊皮下注射2mL（2頭份）疫苗液，陰性對(duì)照組注射2mL無(wú)菌生理鹽水。持續(xù)觀測(cè)體溫0～86h，并觀測(cè)注射部位是否形成腫塊。安全評(píng)價(jià)結(jié)果如圖1所示。試驗(yàn)羊在注射2頭份疫苗后，體溫在24～48h內(nèi)有不同程度升高，在72h時(shí)恢復(fù)正常。免疫后試驗(yàn)羊所形成的腫塊也呈現(xiàn)了同樣的趨勢(shì)，腫塊在72h徹底消失。注射后21d，試驗(yàn)羊沒(méi)有發(fā)生異常，平均體重也與對(duì)照組處于同一水平。

3.6.2效力評(píng)價(jià)方法為評(píng)價(jià)每一批次疫苗的免疫效果，采用ELISA方法對(duì)免疫后試驗(yàn)羊的抗體水平進(jìn)行檢測(cè)，從而對(duì)疫苗的效力進(jìn)行評(píng)價(jià)。表1所示為澳龍公司2014年中期的疫苗成品質(zhì)量評(píng)價(jià)記錄。該次質(zhì)量評(píng)價(jià)共選取3個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)共370頭羊進(jìn)行了疫苗接種，接種方式為頸部皮下注射1頭份，其中2個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)在首次免疫后1個(gè)月進(jìn)行了二次免疫，二次免疫后連續(xù)觀測(cè)3個(gè)月的抗體水平。抗體檢測(cè)結(jié)果顯示：一免后第28d（一免后1個(gè)月），只進(jìn)行一次免疫的Fu組的抗體效價(jià)迅速升高至0.75，與免疫前相比差異顯著；當(dāng)一免后56d（一免后2個(gè)月）、84d（一免后3個(gè)月），動(dòng)物血清中的抗體效價(jià)呈下降趨勢(shì)，但平均抗體效價(jià)仍高于0.6，可判為陽(yáng)性。Fang組及Jiang組為兩次免疫組，28d（一免后1個(gè)月）、56d（二免后1個(gè)月）時(shí)的抗體水平明顯增高，84d（二免2個(gè)月）時(shí)的抗體水平又出現(xiàn)下降；二免2個(gè)月后抗體水平雖然都出現(xiàn)明顯下降，但抗體效價(jià)平均值仍大于1.0，且高于二免前抗體效價(jià)。說(shuō)明在二免后2個(gè)月的抗體效價(jià)仍然比較理想。

圖1　產(chǎn)品安全評(píng)價(jià)結(jié)果

表1　2014年疫苗成品質(zhì)量評(píng)價(jià)記錄

將一次免疫與兩次免疫結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，分析疫苗免疫一次與免疫兩次的抗體差異。結(jié)果表明第28d（一免后1個(gè)月）時(shí)，3個(gè)試驗(yàn)組的抗體水平都出現(xiàn)增長(zhǎng)，通過(guò)方差分析，3組數(shù)據(jù)之間不存在差異。第28d時(shí)對(duì)Fang組與Jiang組再進(jìn)行第二次免疫，F(xiàn)u組不進(jìn)行免疫，結(jié)果表明第56d（一免后2個(gè)月、二免后1個(gè)月）時(shí)，F(xiàn)ang組與Jiang組的抗體效價(jià)又出現(xiàn)了明顯增長(zhǎng)，且2組數(shù)據(jù)與Fu組數(shù)據(jù)呈現(xiàn)顯著差異；第84d后，免疫兩次的Fang組與Jiang組的抗體水平出現(xiàn)下降，但最高值仍達(dá)到1.2，遠(yuǎn)高于只免疫一次的Fu組；包括Fu組在內(nèi)，所有試驗(yàn)組在第84d的抗體效價(jià)仍為陽(yáng)性。

4　討論

在包蟲(chóng)病的傳播途徑中，人、牛及綿羊等多種哺乳動(dòng)物為中間宿主，通過(guò)感染細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)的幼蟲(chóng)而引起發(fā)病，犬、狼和狐貍等犬科動(dòng)物為終末宿主，通過(guò)攝食牛、羊的內(nèi)臟器官，感染細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)的成蟲(chóng)而引起發(fā)病［2］。包蟲(chóng)病防控的方法之一是對(duì)犬驅(qū)蟲(chóng)，但大量的流浪犬、野犬致使控制終末宿主——犬的難度很大，而終末宿主80%的感染來(lái)自于羊，因此，用羊棘球蚴（包蟲(chóng)）病基因工程亞單位疫苗免疫中間宿主——羊，可保護(hù)羊群免受細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)的幼蟲(chóng)感染，從而阻斷細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)的生活史循環(huán)，達(dá)到徹底防控包蟲(chóng)病的目的。

［1］范才良，廖天學(xué)，李慧，等.羊棘球蚴（包蟲(chóng)）基因工程亞單位疫苗免疫母羊后羔羊母源抗體消長(zhǎng)規(guī)律研究［J］.中國(guó)草食動(dòng)物科學(xué)，2015（5）：20.

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Study on the Application of Previously Fermented Juice in the Forage Silage

LI Yuanying
（Animal Medicine Research and Development Center，Agriculture and Forestry Sciences Academy of Hebei Province，Hebei Shijiazhuang 050071，China）

Abstract：This paper is about the previously fermented juice（PFJ）which has many advantages such as uncomplicated handing，economy and environmental protection as a natural and poisonless additive. According to recent studies，this paper summarized the manufacturing methods，mechanism and application progress of PFJ.

Key words：Previously fermented juice（PFJ）；Silage；Fermentation

中圖分類(lèi)號(hào)：S816.3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1001-8864（2016）05-0026-02

收稿日期：2016-03-23

作者簡(jiǎn)介：李元迎（1871-），男，河北邢臺(tái)人，大學(xué)本科，高級(jí)獸醫(yī)師，現(xiàn)參加河北省渤海糧倉(cāng)科技示范工程項(xiàng)目，研究方向：臨床獸醫(yī)。