顧麗萍，劉曉慧，宋曄，侯順玉，戴建榮

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胎盤膽鹽輸出泵蛋白的表達及其與妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥的關(guān)系

顧麗萍，劉曉慧，宋曄，侯順玉，戴建榮

【摘要】目的：探討胎盤組織中膽鹽輸出泵（bile salt export pump，BSEP）的表達水平及其與妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥（intrahepatic cholestasis of pregnancy，ICP）的關(guān)系。方法：選取2012年2月—2013年8月在蘇州市立醫(yī)院本部產(chǎn)科住院分娩的ICP孕婦30例作為研究組（ICP組），同期分娩的健康妊娠晚期孕婦30例作為對照組，采用免疫組化（SP）法和蛋白質(zhì)印跡（western blotting）法測定2組孕婦胎盤組織中BSEP蛋白的表達。結(jié)果：BSEP蛋白表達于胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。ICP患者胎盤組織BSEP的表達低于正常胎盤組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義[（0.197 7±0.111 8）vs.（0.616 0±0.384 9），P＜0.001]。結(jié)論：BSEP蛋白在胎盤組織中表達的降低可能與ICP有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】膽汁淤積，肝內(nèi)；妊娠；胎盤；膽汁酸類和鹽類

作者單位：215002江蘇省蘇州市立醫(yī)院本部婦產(chǎn)科

（J Int Obstet Gynecol，2016,43：42-44）

妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥（intrahepatic cholestasis of pregnancy，ICP）是妊娠期所特有的一種疾病，對圍生兒威脅極大，可導(dǎo)致胎兒窘迫、早產(chǎn)、胎兒猝死[1]，患病圍生兒病死率為1%～11%[2]。目前ICP的病因仍不十分明確，其發(fā)生與膽汁酸形成、轉(zhuǎn)運和調(diào)節(jié)的生理機制密切相關(guān)，其中任一環(huán)節(jié)出現(xiàn)異常，均會發(fā)生肝內(nèi)膽汁淤積。筆者臨床發(fā)現(xiàn)，雙卵雙胎ICP孕婦一胎兒胎死宮內(nèi)，剖宮產(chǎn)術(shù)中發(fā)現(xiàn)死胎的羊水污染，另一活胎的羊水性狀正常，同為ICP的母體環(huán)境，但兩胎兒的結(jié)局不同，故引發(fā)從胎盤角度探討ICP的發(fā)病機制。人體內(nèi)膽汁酸主要在肝細(xì)胞內(nèi)由膽固醇轉(zhuǎn)化而來，肝臟組織存在參與膽汁酸轉(zhuǎn)運的多種載體，其中膽鹽輸出泵（bile salt export pump，BSEP）負(fù)責(zé)80%的膽鹽由肝臟分泌入膽管。目前關(guān)于胎盤中是否存在與肝臟類似的膽鹽轉(zhuǎn)運載體的研究不多。本研究通過檢測ICP患者胎盤中BSEP蛋白的表達，旨在探討B(tài)SEP蛋白與ICP的關(guān)系。

1　對象與方法

1.1研究對象選取2012年2月—2013年8月在蘇州市立醫(yī)院本部產(chǎn)科住院分娩的ICP孕婦30例作為研究組（ICP組），同期分娩的健康妊娠晚期孕婦30例作為對照組。2組孕婦均無妊娠期高血壓疾病、糖尿病、甲狀腺疾病、腎臟病等妊娠合并癥及并發(fā)癥。2組孕婦年齡、孕周比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而ICP組血清總膽汁酸值（total bile acid，TBA）、產(chǎn)時羊水污染率均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。見表1。

表1　2組患者的年齡、孕周、母血TBA值和產(chǎn)時羊水胎糞污染情況的比較

1.2診斷和排除標(biāo)準(zhǔn)參照謝幸主編的婦產(chǎn)科學(xué)第8版[3]，ICP診斷標(biāo)準(zhǔn)為：①妊娠中晚期出現(xiàn)皮膚瘙癢，或伴黃疸；②母體血清TBA水平升高（＞10 μmol/L），或伴有肝功能障礙[天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）]障礙輕度至中度升高；③分娩后瘙癢癥狀消失，肝功能恢復(fù)正常。排除標(biāo)準(zhǔn)為：病毒性肝炎、肝膽石癥、急性脂肪肝和HELLP綜合征等。

1.3研究方法

1.3.1標(biāo)本采集各種孕婦在胎盤娩出后15 min內(nèi)避開出血、鈣化灶，在直視下剪取胎盤母體面組織2塊，每塊大小約1 cm×1 cm×1 cm，用無菌生理鹽水漂洗去除血液，其中一份放入凍存管中-80℃保存，一份置入4%多聚甲醛固定24 h后，常規(guī)脫水，石蠟包埋，連續(xù)切成4 μm厚的石蠟切片待用。

1.3.2主要試劑一抗為兔抗人BSEP單克隆抗體（美國Santa Cruz公司，貨號SC-17292）；二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗人IgG（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號A0201）；鏈霉素親和素-生物素-酶復(fù)合物（SABC）、Bradford蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）。

1.3.3免疫組化SP法石蠟切片經(jīng)過常規(guī)脫蠟、水化、封閉后，加入一抗（工作濃度為1∶100），4℃孵育過夜，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗3次，5 min/次，加入二抗37℃孵育15～30 min，加入SABC 37℃孵育30 min，PBS洗3次，5 min/次，DAB顯色5～10 min，PBS洗3次，5 min/次，蘇木素復(fù)染2 min，自來水沖洗10～15 min，脫水吹干后樹膠封片，200倍顯微鏡鏡檢觀察染色結(jié)果。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色或黃褐色顆粒者為BSEP蛋白陽性。

1.3.4蛋白質(zhì)印跡（Western blotting）提取胎盤組織總蛋白，Bradford法進行定量，每泳道40 μg上樣量經(jīng)十二烷基磺酸鈉-丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），再轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，TBST封閉液室溫下封閉1 h，加一抗（工作濃度為1∶1 000）4℃孵育過夜，用TBST在室溫下脫色搖床上洗滌5 min×3次，加入二抗室溫孵育30 min，用TBST在室溫下脫色搖床上洗滌5 min×3次，ECL顯影，將膠片進行掃描存檔，用Alpha軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的灰度值，將BSEP蛋白的條帶灰度值與內(nèi)參β肌動蛋白（β-actin）條帶灰度值的比值作為BSEP蛋白的相對表達量。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS13.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。定量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗。定性資料用百分率表示，組間比較采用卡方檢驗。所有檢驗均以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1胎盤組織中BSEP蛋白的表達部位免疫組化SP法檢測顯示，正常胎盤組織的細(xì)胞質(zhì)中可見明顯的棕褐色染色，BSEP蛋白呈陽性表達，見圖1（見后插一）；而在ICP的胎盤組織中未見明顯棕黃色或棕褐色染色，BSEP蛋白呈陰性表達，見圖2（見后插一）。

2.22組胎盤組織中BSEP蛋白表達水平Western blotting法檢測結(jié)果顯示，ICP組胎盤組織中BSEP/ β-actin灰度值為0.197 7±0.111 8，而正常胎盤組織中BSEP/β-actin灰度值為0.616 0±0.384 9，ICP組胎盤組織中BSEP的表達水平低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=5.717，P＜0.001），見圖3。

圖3　Western blotting法檢測ICP組及對照組中BSEP蛋白的表達

3　討論

3.1妊娠期膽汁酸的代謝膽汁酸主要在肝細(xì)胞內(nèi)由膽固醇轉(zhuǎn)化而來，肝臟組織存在參與膽汁酸轉(zhuǎn)運的多種載體，包括鈉-硫磺膽酸同向轉(zhuǎn)運多肽（NTCP）、有機陰離子轉(zhuǎn)運多肽超家族（OATPs）、BSEP、磷脂輸出泵[由多藥耐藥蛋白3（multidrug resistance 3 protein，MDR3）介導(dǎo)]、氨基磷脂轉(zhuǎn)運體（FIC1）、多藥耐藥相關(guān)蛋白（MRP）等，其中BSEP負(fù)責(zé)80%的膽鹽由肝臟分泌入膽管[4]。

妊娠后胎兒和胎盤的存在使膽汁酸的代謝過程變得更復(fù)雜。胎兒肝臟在妊娠12周后就能生成膽汁酸，但因胎兒腸道功能尚不成熟，不能進行有效的肝腸循環(huán)，為防止膽汁酸在胎兒體內(nèi)淤積，需通過胎盤將膽汁酸轉(zhuǎn)入母體血液循環(huán)進行代謝排泄[4]。

3.2BSEP基因多態(tài)性可能與ICP的發(fā)病有關(guān)

BSEP基因也稱為ABCB11基因，位于染色體2q24，編碼的BSEP蛋白是膽鹽主要的轉(zhuǎn)運器[5]，屬于ATP結(jié)合盒（ATP binding cassette）轉(zhuǎn)運蛋白家族。Eloranta等[6]首次比較了57例ICP患者和115例健康孕婦的ABCB11基因，發(fā)現(xiàn)該基因的單核苷酸多態(tài)性與ICP發(fā)生相關(guān)。此后越來越多的研究表明，膽汁淤積性疾病的發(fā)生與BSEP基因變異有關(guān)[7-8]。

由于多數(shù)ICP患者的癥狀在分娩后緩解或消失，ICP相關(guān)的基因突變可能受其他因素的影響，對于胎盤組織中是否存在與肝臟類似的各種膽鹽載體目前國內(nèi)外研究甚少。

3.3胎盤BSEP蛋白的表達與ICP的相關(guān)性本研究發(fā)現(xiàn)，BSEP蛋白表達于滋養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，而ICP患者胎盤上BSEP的表達明顯降低。BSEP表達的下降可能導(dǎo)致胎兒膽汁酸向母體的轉(zhuǎn)運減少，導(dǎo)致胎兒體內(nèi)膽汁淤積。研究發(fā)現(xiàn)，ICP患者的胎兒血漿膽汁酸水平較正常妊娠母親的胎兒升高[9]。近年的一項大樣本前瞻性研究表明ICP患者膽汁酸水平增高與圍生兒結(jié)局密切相關(guān)，膽汁酸水平越高胎兒缺氧越嚴(yán)重，提示胎兒的不良結(jié)局可能與胎兒體內(nèi)膽汁酸水平增高有關(guān)[10-11]。賀晶等[12]對16例ICP導(dǎo)致死胎的臨床分析也支持上述觀點。研究發(fā)現(xiàn)，高濃度膽汁酸有濃度依賴性血管收縮作用，可使胎盤血管收縮，血灌注減少，氧合血流量驟然下降，導(dǎo)致胎兒急性缺氧，潴留的膽汁酸還可通過細(xì)胞毒作用影響胎兒，導(dǎo)致缺氧、窒息，甚至死亡[4]。此外，膽汁酸還可引起心律失常[13]。

總之，目前ICP的病因及發(fā)病機制仍不十分清楚，其發(fā)生與膽汁酸形成、轉(zhuǎn)運和調(diào)節(jié)的生理機制密切相關(guān)，BSEP是膽鹽轉(zhuǎn)運的最主要的蛋白之一，其在胎盤組織中表達的降低，可能引起ICP胎盤對膽汁酸的轉(zhuǎn)運障礙、胎兒體內(nèi)膽汁淤積，導(dǎo)致胎兒窘迫。進一步研究胎盤膽鹽載體的種類和功能，可能有助于闡明ICP胎兒體內(nèi)膽汁淤積以及圍生兒不良結(jié)局的發(fā)生機制。

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[本文編輯王昕]

Study on the Placental Expression of BSEP in Intrahepatic Cholestasis of Pregnancy

GU Li-ping，LIU Xiao-hui，SONG Ye，HOU Shun-yu，DAI Jian-rong.Department of Obstetrics and Gynecology，Suzhou Municipal Hospital，Suzhou 215002，Jiangsu Province，China
Corresponding author：DAI Jian-rong，E-mail：daijianrong3013@sina.com

【Abstract】Objective：To explore the expression of bile salt export pump（BSEP）in placenta tissue and its relationship with intrahepatic cholestasis of pregnancy（ICP）.Methods：The expression of BSEP in the placenta was detected by immunohistochemistry and western blotting respectively in 30 women with ICP（ICP group）and 30 normal gravidas（control group）from February 2012 to August 2013 in Department of Obstetrics of Suzhou Municipal Hospital.Results：BSEP was located at the cytoplasm in the placental trophoblastic cells.The expression of BSEP in ICP group was significantly lower than control group[（0.197 7±0.111 8）vs.（0.616 0±0.384 9），P＜0.001].Conclusions：Decreased expression of BSEP in placenta may be associated with ICP.

【Keywords】Cholestasis，intrahepatic；Pregnancy；Placenta；Bile acids and salts

基金項目：蘇州市科教興衛(wèi)青年科技項目（KJXW2011023）

通信作者：戴建榮，E-mail：daijianrong3013@sina.com

收稿日期：（2015-07-05）