王麗，汪佩，李巖鵬，袁雅冬

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17β-雌二醇和2-甲氧基雌二醇對慢性低氧性肺動脈高壓大鼠體內內皮素-1/一氧化氮體系的影響

王麗，汪佩，李巖鵬，袁雅冬

摘要

目的：探討17β-雌二醇（E2）及2-甲氧基雌二醇（2ME）對慢性低氧性肺動脈高壓大鼠體內內皮素-1（ET-1）/一氧化氮（NO）體系的影響。

方法：雌性SD大鼠48只，按隨機數(shù)字表法平均分為6組（各組n=8）：假手術組、去勢組、低氧組、去勢+低氧組、去勢+低氧+E2組、去勢+低氧+2ME組。去勢組行卵巢切除術；非去勢組打開腹腔找到卵巢后不做處理直接還納縫合。術后去勢+低氧+E2組皮下注射E2［20 μg/（kg·d）］，去勢+低氧+2ME組皮下注射2ME［240 μg/（kg·d）］，其他組皮下注射生理鹽水（0.1 ml/d）。低氧組大鼠置于低氧箱內飼養(yǎng)，非低氧組大鼠呼吸正?？諝?。連續(xù)飼養(yǎng)8周以建立低氧性肺動脈高壓模型。分別測定血清ET-1、NO水平、內皮型一氧化氮合酶（eNOS）活性及肺組織內皮素A受體（ETAR）、內皮素B受體（ETBR）、eNOS 表達變化。

結果：低氧組、去勢+低氧組大鼠肺小動脈管壁增厚，管腔變窄明顯，平均肺動脈壓（mPAP）顯著高于假手術組（P均＜0.01）；E2和2ME干預組大鼠上述形態(tài)學及mPAP改變相對較輕。與假手術組相比，去勢組和低氧組血清ET-1和肺組織ETAR mRNA及蛋白水平均明顯升高，ETBR mRNA及蛋白水平明顯下降（P均＜0.01）；去勢+低氧組以上指標變化更顯著；E2和2ME干預后血清ET-1和肺組織ETAR表達明顯下降，但仍高于假手術組，同時ETBR 表達明顯上升，但仍低于假手術組（P均＜0.01）；且去勢+低氧+2ME組血清ET-1水平低于去勢+低氧+E2組（P＜0.05）。與假手術組相比，去勢組肺組織eNOS蛋白水平明顯下降（P＜0.01）；低氧組血清NO水平及肺組織eNOS蛋白水平明顯下降（P＜0.05或P＜0.01）；去勢+低氧組血清NO水平、eNOS活性及肺組織eNOS mRNA和蛋白水平均明顯下降（P均＜0.01）；去勢+低氧+E2組和去勢+低氧+2ME組上述指標較去勢+低氧組均明顯上升（P＜0.05或P＜0.01），但仍低于假手術組（P均＜0.05）。

結論：E2及2ME均能顯著降低血清ET-1水平，減少肺組織ETAR表達，增加ETBR的表達，升高血清NO水平、eNOS活性及肺組織eNOS表達，通過改善ET-1/NO體系平衡部分逆轉肺動脈高壓。

關鍵詞高血壓，肺性；一氧化氮；17β-雌二醇；2-甲氧基雌二醇；內皮素-1

作者單位：050000河北省石家莊市，河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科

（Chinese Circulation Journal，2016，31：489.）

低氧性肺動脈高壓（HPH）是臨床多種心肺疾病發(fā)生發(fā)展過程中重要的病理生理環(huán)節(jié)，其形成機制尚不完全清楚。急性缺氧可導致肺動脈平滑肌細胞可逆性的收縮，是一種保護性的生理反應。而慢性缺氧會使肺血管發(fā)生不可逆性的重塑，是形成和加重肺動脈高壓的重要原因。HPH的病理生理基礎包括肺血管收縮、結構重建、微血栓形成，其發(fā)生發(fā)展涉及多種血管活性物質，其中內皮功能障礙起關鍵性作用，缺氧致血管內皮受損、功能失調，引起血管活性物質和細胞因子產生及釋放異常，血管舒縮因子平衡失調，包括內皮素-1（ET-1）、一氧化氮（NO）等，最終導致肺動脈高壓發(fā)生［1］。

近年來，關于雌激素及其代謝產物對肺血管起保護作用的研究日益增多，因其可減弱多種刺激引起的肺血管內皮細胞和平滑肌細胞功能損傷，有利于改善血管重構和舒張血管，但具體機制目前尚未完全了解。本研究旨在通過建立HPH動物模型探討HPH時ET-1/NO體系的變化情況和二者之間的相互關系以及17β-雌二醇（E2）、2-甲氧基雌二醇（2ME）是否通過影響ET-1/NO體系平衡而在肺動脈高壓中起保護作用。

1 材料與方法

主要儀器與試劑：常壓低氧環(huán)境動物實驗箱（長沙長錦科技有限公司）；RM3000四導聯(lián)生理記錄儀（日本光電公司）；Eclipse 55i光學顯微鏡及照相系統(tǒng)（日本尼康）；高速冷凍離心機1-15K （美國Sigma公司）；離心機（上海安亭）；756MC型紫外-可見分光光度計（上海精密科學儀器有限公司）；E2、2ME（進口分析純度，美國Sigma公司）；125I-ET放射免疫分析試劑盒（北京北方生物研究所）；NO試劑盒、NOS試劑盒（南京建成生物工程研究所）；PCR Reagents、總RNA提取試劑（大連TaKaRa公司）；大鼠抗肺組織內皮素A受體（ETAR）單克隆抗體、大鼠抗內皮素B受體（ETBR）單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的二抗（美國 Santa Cruz公司）。

實驗動物及分組：6～8周齡健康雌性SD大鼠 48只，體重（180±10）g，由河北醫(yī)科大學實驗動物中心提供。按隨機數(shù)字表法將大鼠平分為6組：假手術組、去勢組、低氧組、去勢+低氧組、去勢+低氧+E2組、去勢+低氧+2ME組（各組n=8）。去勢組大鼠打開腹腔，沿輸卵管找到卵巢并結扎切除；非去勢組找到卵巢后不做處理直接還納縫合。術后假手術組、去勢組、低氧組、去勢+低氧組皮下注射生理鹽水（0.1 ml/d），去勢+低氧+E2組皮下注射E2［20μg/（kg·d）］，去勢+低氧+2ME組皮下注射2ME［240μg/（kg·d）］。待傷口愈合后，低氧組大鼠置于低氧箱內，保持氧濃度為（10.0±0.5）%，以鈉石灰和無水氯化鈣吸收多余的二氧化碳（CO2）和水蒸氣，控制CO2濃度低于0.5%，每天持續(xù)低氧24 h，連續(xù)8周。非低氧組大鼠置于同一室內飼養(yǎng)，除吸入空氣外，其它條件與低氧組相同。

肺動脈壓力測定及肺小動脈形態(tài)學分析：大鼠經(jīng)1%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉后，鈍性分離右側頸外靜脈，自右頸外靜脈插入微導管，將壓力傳感器接上生理記錄儀進行連續(xù)測壓，記錄肺動脈壓力波形，計算平均肺動脈壓（mPAP）。

肺動脈壓力檢測后，留取血標本2 ml，3000 rpm離心10 min，取上清液迅速放入-80℃冰箱保存，待測ET-1、NO含量和內皮型一氧化氮合酶（eNOS）活性。處死大鼠，快速打開胸腔取出全肺，以生理鹽水沖洗肺外表，取左肺上葉制成石蠟標本，行蘇木素-伊紅（HE）染色，鏡下觀察肺動脈形態(tài)；余肺葉待測ETAR、ETBR及eNOS mRNA和蛋白水平。

血清ET-1、NO水平及eNOS活性測定：應用放射免疫法測定血清ET-1濃度［2］，按125I-ET放射免疫分析試劑盒檢測；采用硝酸還原酶法測定血清NO濃度［2］，按NO試劑盒說明書進行檢測。應用化學法測定血清eNOS活性［3］，按NOS試劑盒說明書進行檢測。

肺組織ETAR、ETBR及eNOS mRNA的測定：逆轉錄多聚酶鏈反應（RT-PCR）法檢測肺組織ETAR、ETBR 及eNOS mRNA表達：用Trizol法提取組織總RNA，取2 μg總RNA逆轉錄成cDNA。引物分別為：ETAR 退火溫度為 55℃，上游引物5'-CGTCCTGGGAAGTTTCCTCC-3 '，下游引物 5'-ATTGCTAGGCAGGGCCAAAT-3'，產物長度為371bp；ETBR 退火溫度為56℃，上游引物5'-CTAAGGCAGTTGAGGACCTGG-3'，下游引物 5'-GTCTTAGTGGGTGGCGTCAT-3'，產物長度為282 bp；eNOS 退火溫度為56℃，上游引物 5'-CGAACAGCAGGAGCTAGAGG-3'、下游引物 5'-GAGGTGGATCTCTCCTGGGT-3 '，產物長度為211 bp；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）上游引物 5'-CACCTTTGATGCTGGGGCTG-3 '，下游引物 5'-TGGTATTCGAGAGAAGGGAGGG-3 '，產物長度為306 bp。反應體系含Taq DNA聚合酶，dNTPs，上樣染料，穩(wěn)定劑，優(yōu)化劑，反應緩沖液，逆轉錄反應產物，上下游引物等。反應程序為94 ℃預變性4 min，然后進入PCR循環(huán)，94 ℃變性30 s，各自退火溫度30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)35次后再延伸7 min。PCR產物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳后，應用復日FR-980A生物凝膠電泳圖像分析系統(tǒng)對PCR產物的電泳帶進行紫外光密度掃描成像，應用圖像分析軟件對目的條帶進行分析，以內參條帶作為參照，結果以兩者的吸光度比值表示。

肺組織ETAR、ETBR 及eNOS 蛋白的測定：蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測肺組織ETAR、ETBR 及eNOS蛋白表達：肺組織總蛋白的提取采用RIPA裂解液，蛋白含量按改良Lowry法測定［4］。取總蛋白60 μg經(jīng)15%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，轉移至聚偏二氟乙烯膜（PVDF）上。轉膜完畢，取出 PVDF膜，置于含 5 % 脫脂奶粉的 TTBS（ 10 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，150 mmol/L NaCl，0.05 % Tween-20）封閉液中，室溫2 h。將封閉后的膜置入TTBS適當稀釋的一抗溶液中，4℃過夜。洗膜后將膜置入適量以TTBS 1：10000 稀釋的辣根過氧化物酶標記的二抗溶液中，室溫反應 2.5～3 h。用TTBS洗膜3次。最后掃描成像并用 Vilber Lourmat公司ID 數(shù)碼成像分析軟件對Western blot顯色區(qū)帶的信號強度進行相對定量分析，掃描灰度值用積分光密度值表示。

統(tǒng)計學方法：采用 SPSS13.0 統(tǒng)計軟件進行處理，正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)以±s表示，多個樣本均數(shù)兩兩之間比較用方差分析中的LSD和SNK-q 檢驗，以 P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 成功建立肺動脈高壓模型（圖1、2）

假手術組及去勢組大鼠反應敏捷，體毛光澤，飲食正常；低氧條件下的各組大鼠隨著低氧時間的延長，反應遲鈍變得虛弱，毛色晦暗，呼吸急促，食水量和活動減少，最終以靜臥為主。

圖1　各組大鼠肺組織形態(tài)學變化（蘇木素伊紅，×100）

光鏡下，假手術組及去勢組肺動脈內膜完整平滑，管壁菲薄，肌層無增厚；低氧 8周后，可見肺動脈管壁和平滑肌層明顯增厚，管腔狹窄，表現(xiàn)出肺動脈重構的體征，mPAP明顯升高，去勢+低氧組上述形態(tài)學及mPAP改變最顯著，E2和2ME干預組上述改變相對較輕。

2.2 血清ET-1水平及肺組織ETAR、ETBR mRNA和蛋白表達的變化（圖3～5）

圖2　各組大鼠平均肺動脈壓（mPAP）變化（±s，各組n=8）

圖3A-3C　各組大鼠血清ET-1和NO水平及eNOS活性的比較（±s，各組n=8）

圖4　各組大鼠肺組織中ETAR、ETBR、eNOS mRNA表達的逆轉錄多聚酶鏈反應電泳圖及其水平的比較（±s，各組n=8）

圖5　各組大鼠肺組織中ETAR、ETBR、eNOS 的蛋白免疫印跡分析的印跡圖及其蛋白水平比較 （±s，各組n=8）

與假手術組相比，去勢組和低氧組血清ET-1水平和肺組織ETAR mRNA及蛋白表達水平均明顯升高，同時肺組織ETBR mRNA和蛋白表達水平明顯下降（P均＜0.01）；去勢+低氧組上述指標變化更顯著；E2和2ME干預后血清ET-1和肺組織ETAR表達明顯下降，但仍高于假手術組水平，ETBR 表達明顯升高，但仍低于假手術組水平（P均＜0.01），且去勢+低氧+2ME組血清ET-1水平低于去勢+低氧+E2組（P＜0.05）。

2.3 血清NO水平、eNOS活性及肺組織eNOS mRNA和蛋白表達的變化（圖3～5）

與假手術組相比，去勢組肺組織eNOS蛋白水平明顯下降（P＜0.01）；低氧組血清NO水平及肺組織eNOS蛋白水平均明顯下降（P＜0.05或P＜0.01）；去勢+低氧組血清NO水平、eNOS活性及肺組織eNOS mRNA和蛋白表達水平均顯著下降（P均＜0.01）。去勢+低氧+E2組和去勢+低氧+2ME組上述指標較去勢+低氧組均明顯上升（P＜0.05或P＜0.01），但仍低于假手術組（P均＜0.05）。

3 討論

HPH是由低氧引起血管內皮細胞損傷，血管內皮合成和分泌的各種血管舒縮因子平衡失調，導致早期的肺血管收縮以及后期的肺血管重建［5］。在本實驗中以雌性大鼠作為研究對象，低氧8周后mPAP明顯上升，肺小動脈管壁增厚，成功地建立肺動脈高壓模型。在低氧誘導的肺動脈高壓模型中，大鼠血清ET-1水平、肺組織ETAR 表達明顯增加，ETBR 表達明顯減少；血清NO水平、eNOS活性及肺組織eNOS表達均明顯下降。

ET-1/NO體系平衡失調在肺動脈高壓發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用，但二者之間具體始動關系尚不明確。ET-1是迄今己知的作用最強大的內源性縮血管肽，主要通過ETAR、ETBR兩種受體發(fā)揮作用。低氧條件下，ETAR激活后使Ca2+內流增加，同時激活磷酯酶A2和C、蛋白激酶C，并能增強c-myc、c-fos、c-jun等一系列與細胞增殖密切相關的原癌基因的表達［6，7］，最終引起肺血管收縮和結構重塑。而血管內皮細胞ETBR增加可以促進NO及前列環(huán)素（PGI2）釋放［8］，減少內皮素轉化酶的表達［9］，同時滅活ET-1［10］，從而引起肺血管舒張，對抗肺血管重塑進展。NO作為體內廣泛分布的血管內皮舒張因子，通過激活血管平滑肌細胞（VSMC）中的鳥苷酸環(huán)化酶，使細胞內環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）大量產生并堆積，從而導致血管舒張。另外，NO還能夠通過抑制ET的合成、釋放，調節(jié)活性因子兒茶酚胺等所致的血管收縮這一途徑調節(jié)血管舒縮平衡，在一定程度上能夠逆轉低氧性肺血管收縮。通常認為肺動脈高壓的病理改變同NO生物活性降低和（或）NO合成減少有關［11］。eNOS 是血管內皮細胞生成NO的限速酶［12］，它在調節(jié)肺血管張力中起著非常重要的作用［13］。本研究再次證實了ET-1/NO體系失衡參與了HPH的發(fā)生和發(fā)展過程。并且ET-1體系變化較NO體系變化更顯著，說明ET-1體系可能起始動作用，其作用增強，抑制NO體系表達，引起NO體系下調，ET-1/NO比值上調，導致肺動脈壓力升高，肺動脈平滑肌增生，血管重構。

雌激素在肺血管系統(tǒng)起保護作用的研究日趨增多，但具體機制仍不是很明確。有研究報道，在慢性HPH大鼠模型中，去卵巢大鼠發(fā)生肺動脈重構和右心室肥大的程度更加明顯［14，15］。補充雌激素治療后可降低肺動脈高壓嚴重程度［16，17］，但并未完全抑制和逆轉，這可能與常壓明顯缺氧時引起內皮細胞的損傷較嚴重有關。Yuan等［18］認為E2與雌激素受體β結合激活磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）通路來降低ET-1的表達從而改善肺動脈高壓。Earley等［19］認為E2主要通過干擾低氧誘導因子活性以及雌激素受體與低氧誘導因子通路競爭限制cAMP反應元件結合蛋白結合蛋白（CBP）/p300轉錄共激活因子的數(shù)量從而抑制ET-1的表達。另外，有研究認為E2與雌激素受體結合通過轉錄調控激活eNOS基因的表達，使eNOS活性或蛋白表達增加［20］，進而促進NO釋放。也有研究報道，E2可與雌激素膜受體結合增加細胞內Ca2+濃度，進而使eNOS活性增加，從而產生更多的NO［21］。本研究發(fā)現(xiàn)E2干預后大鼠血清ET-1水平、肺組織ETAR表達均明顯減少，而ETBR表達增加；并且肺組織eNOS表達、血清eNOS活性及NO水平均升高。這說明E2可有效對抗低氧引起的ET-1/NO體系失衡從而抑制HPH發(fā)生。分析其原因可能為，E2抑制肺血管內皮細胞合成和分泌ET-1，并減少肺動脈平滑肌細胞上ETAR的表達，減弱了ET-1與ETAR的作用及其介導的NO及NOS表達的下降［22，23］，同時增強了血管內皮細胞上的ETBR清除ET-1并介導釋放舒血管因子（如NO和PGI2）［24］的作用，抑制了ET-1引起的肺血管收縮和重構，并增強了血管的舒張功能?？傊?，E2抑制HPH，可能是通過抑制ET-1途徑，增加 eNOS的活性和NO 的含量，促進ET-1/NO 穩(wěn)態(tài)的恢復來實現(xiàn)的。

2ME為E2的主要非雌激素性代謝產物，與雌激素受體的親和力極低，有很少或無雌激素活性。2ME具有抗腫瘤及抗VSMC增殖作用，且能夠不依賴雌激素受體而獨立發(fā)揮作用［25］，由于其不良反應小，極具研究價值。有研究表明，2ME能通過細胞應激反應引起線粒體細胞色素C釋放、促進活性氧生成、P53表達以及活化蛋白激酶（JNK）和Bcl-2家族的活性［26］，導致細胞調亡。也有研究發(fā)現(xiàn)，2ME可誘導細胞周期停滯在G0/G1期和G2/M期，還可抑制細胞外信號調節(jié)激酶（ERK）1/2和Akt信號通路，從而抑制人大動脈平滑肌細胞增殖［27］。本研究發(fā)現(xiàn)2ME可降低血清ET-1水平，抑制肺組織ETAR表達，增強ETBR表達，同時提高血清NO水平、eNOS活性及肺組織eNOS表達，改善ET-1/NO體系平衡，緩解肺動脈壓力以及肺血管重塑改變；且與Dubey等［28］研究結果一致，2ME抑制ET-1的能力明顯高于E2。提示，2ME抑制HPH的發(fā)生發(fā)展也與其改善ET-1/NO體系平衡作用有關，且可能具有不同于E2的作用途徑，而與其誘導細胞凋亡以及抑制細胞有絲分裂是否有關，尚需進一步研究。

總之，E2及2ME均能夠抑制血清ET-1水平、肺組織ETAR表達，促進ETBR表達，提高eNOS表達及活性，增加血清NO水平，使ET-1和NO體系之間的失衡狀態(tài)得到改善，從而改善內皮功能，抑制肺血管收縮及結構重塑，降低肺動脈壓力。

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（編輯：梅平）

Effects of 17 β-estradiol and 2-methoxyestradiol on Endothelin-1/Nitric Oxide Cascade in Experimental Rats With Hypoxic Pulmonary Hypertension

WANG Li，WANG Pei，LI Yan-peng，YUAN Ya-dong.
Department of Respiratory and Critical Care Medicine，Second Hospital，Hebei Medical University，Shijiazhuang （050000），Hebei，China

Abstract

Objective：To explore the effects of 17 β-estradiol （E2） and 2-methoxyestradiol （2ME） on endothelium-1/nitric oxide （ET-1/NO） cascade in experimental rats with hypoxic pulmonary hypertension.

Methods：A total of 48 female SD rats were randomly divided into 6 groups：①Sham operation group，②Ovariectomy （OVX） group，③Hypoxia group，④OVX+hypoxia group，⑤OVX+hypoxia+E2 group，the rats received subcutaneous E2 at 20μg/（kg?d） and ⑥OVX+hypoxia+2ME group，the rats received subcutaneous 2ME at 240μg/（kg?d）.n=8 in each group.Blood levels of ET-1，NO，eNOS activity and the expressions of pulmonary tissue endothelium A receptor （ETAR），ETBR and eNOS were compared among different groups.

Results：Compared with Sham operation group，Hypoxia and OVX+hypoxia groups showed small pulmonary arterythickening with lumen narrowing，increased mean pulmonary arterial pressure （mPAP），all P＜0.01； the above morphological and mPAP changes were reduced by E2 and 2ME intervention.Compared with Sham operation group，OVX and Hypoxia groups had increased blood ET-1 and pulmonary mRNA，protein expressions of ETAR，decreased pulmonary ETBR，all P＜0.01； the above changes were more obvious in OVX+hypoxia group； E2 and 2ME intervention reduced blood ET-1 and pulmonary ETAR expression，but they were still higher than Sham operation group，meanwhile，ETBR expression was elevated，but it was still lower than Sham operation group，all P＜0.01； blood ET-1 was lower in OVX+hypoxia+2ME group than OVX+hypoxia+E2 group，P＜0.05.Compared with Sham operation group，OVX group had decreased pulmonary eNOS protein expression，P＜0.01； Hypoxia group had decreased blood NO and pulmonary eNOS protein expression，P＜0.05 or P＜0.01； OVX+hypoxia group had decreased blood NO，eNOS activity and decreased pulmonary mRNA and protein expressions of eNOS，all P＜0.01； E2 and 2ME intervention elevated the above indexes，P＜0.05 or P＜0.01，but they were still lower than Sham operation group，all P＜0.05.

Conclusion：E2 and 2ME could decrease blood ET-1 and pulmonary ETAR expression，increase pulmonary ETBR expression； elevate blood NO，eNOS activity and pulmonary eNOS expression.E2 and 2ME may partially reverse pulmonary hypertension via improving ET-1/NO cascade in experimental rats.

Key wordsHypertension，pulmonary； Nitric oxide； 17 Beta-estradiol； 2-methoxyestradiol； Endothelin-1

基金項目：河北省自然科學基金（H2013206403）

作者簡介：王麗碩士研究生主要從事呼吸系統(tǒng)疾病研究Email：wangliarrive@163.com通訊作者：袁雅冬Email：yyd1108@126.com

中圖分類號：R541

文獻標識碼：A

文章編號：1000-3614（2016）05-0489-06

doi：10.3969/j.issn.1000-3614.2016.05.017

Corresponding Author：YUAN Ya-dong，Email：yyd1108@126.com

收稿日期：（2015-07-04）