邱翠婷，鄭海軍，余文軍，李愛琴，李寰，呂安林

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自噬在高磷誘導的大鼠血管平滑肌細胞鈣化過程中的作用研究

邱翠婷，鄭海軍，余文軍，李愛琴，李寰，呂安林*

摘要

目的：探討自噬在高磷誘導的大鼠血管平滑肌細胞（VSMC）鈣化過程中的作用。

方法：采用磷酸鹽（3.2 mmol/L Pi，即高磷狀態(tài)）建立大鼠VSMC鈣化模型。實驗分為三組：對照組、鈣化組（分為3個亞組：3.2 mmol/L Pi 4 d組、3.2 mmol/L Pi 6 d組、3.2 mmol/L Pi 8 d組）；鈣化+3-甲基腺嘌呤（3-MA）組（3.2 mmol/L Pi 8 d+5 mmol/L 3-MA）。分別通過茜素紅S染色法和鄰甲酚肽絡合酮比色法檢測各組細胞鈣結節(jié)形成及鈣含量；蛋白免疫印跡法檢測各組細胞轉錄因子蛋白（Runx2）、α-肌動蛋白（α-SMA）和自噬相關蛋白—膜型微管蛋白1輕鏈3β（LC3Ⅱ）蛋白表達量。透射電子顯微鏡觀察VSMC內自噬小體形成情況。免疫熒光顯微鏡下觀察VSMC中LC3和Runx2定位表達。

結果：與對照組相比，3.2 mmol/L Pi 8 d組鈣結節(jié)、鈣含量、Runx2和LC3Ⅱ蛋白表達量及自噬小體均顯著增高，α-SMA蛋白表達量降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與3.2 mmol/L Pi 8 d組相比，鈣化+3-MA組細胞鈣含量增多，LC3熒光分布量降低，Runx2陽性細胞數(shù)增多，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

結論：自噬在磷酸鹽誘導的VSMC鈣化過程中具有保護作用。

關鍵詞自噬；磷酸鹽類；肌，平滑；鈣質沉著癥

作者單位：454000河南省，焦作市人民醫(yī)院心內科（邱翠婷、鄭海軍、李愛琴）；中國人民解放軍517醫(yī)院內科（余文軍）；中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院心內科（李寰、呂安林）

（Chinese Circulation Journal，2016，31：484.）

線粒體是細胞內活性氧的主要來源，當細胞受到損傷時，線粒體的電子傳遞鏈發(fā)生異常，可能會導致活性氧簇（ROS）的進一步積聚和線粒體的損傷。受損、衰老、功能紊亂的線粒體破壞細胞穩(wěn)態(tài)，可能導致三磷酸腺苷無法水解，產生過量ROS，并釋放死亡相關蛋白［1］。機體存在的線粒體自噬正是清除受損線粒體，維持線粒體質量和數(shù)量平衡的一種溶酶體依賴性的胞內降解途徑［2］。

動脈鈣化是由多種病理因素引起的主動、可調控的“異位成骨樣”過程，與正常骨骼中骨形成過程相似。糖尿病、慢性腎功能不全、高脂血癥以及衰老等可造成體內代謝產物的堆積，如糖基化終末產物、無機磷、氧化低密度脂蛋白等，引起血管壁細胞受到氧化應激損傷（線粒體損傷）［3］，ROS的增加可激活血管平滑肌細胞（VSMC）轉錄因子蛋白（Runx2）成骨信號途徑，使血管平滑肌細胞由收縮表型轉化為具有合成和分泌功能的成骨細胞樣表型［4］。

本研究旨在探討自噬在VSMC鈣化過程中發(fā)揮的作用，是否通過吞噬、降解受損的線粒體，減少ROS的釋放，從而抑制VSMC的鈣化。

1 材料與方法

材料與主要試劑：雄性SD大鼠30只，體重80～100 g，購自第四軍醫(yī)大學實驗動物中心。磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉（Sigma，美國）；DMEM培養(yǎng)基（Hyclone，中國北京）；胎牛血清（FBS，Hyclone，美國）；茜素紅S（Sigma，美國）；鈣測定試劑盒（鄰甲酚肽絡合酮比色法，北京中生北控生物公司）；兔來源多克隆抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體（Proteintech，中國上海）；兔來源單克隆抗α-肌動蛋白抗體（α-SMA）（Sigma，美國）；兔來源單克隆抗Runx2抗體（Cell Signaling Technology，美國）；兔來源單克隆抗膜型微管蛋白1輕鏈3β （LC-3Ⅱ）抗體（Cell Signaling Technology，美國）。

大鼠VSMC培養(yǎng)：無菌條件下分離大鼠胸主動脈，4℃預冷的無菌磷酸鹽緩沖液（PBS，pH =7.4）清洗分離的胸主動脈3次，完整剝去外膜，將血管剪成2 mm長的動脈環(huán)接種于細胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃含5%二氧化碳孵箱中并用高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)（含45 g/L葡萄糖，100 U/L青霉素及鏈霉素，20%胎牛血清）。經形態(tài)學和免疫組織化學法鑒定為VSMC。實驗取用3～8代的VSMC［5］。

VSMC鈣化模型建立與實驗分組：將細胞以1×104/L 接種于24孔板中或以5×104/L接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，待細胞貼壁后用含磷酸鹽的DMEM培養(yǎng)基誘導VSMC 8 d（終濃度為3.2 mmol/L，NaH2PO4+Na2HPO4，Pi），每2 d更換一次培養(yǎng)基［6］。分別將正常培養(yǎng)的VSMC隨機分組：對照組；鈣化組（3.2 mmol/L Pi 4 d組、3.2 mmol/L Pi 6 d組、3.2 mmol/L Pi 8 d組）；鈣化+3-甲基腺嘌呤（3-MA）組（3.2 mmol/L Pi 8 d+5 mmol/L 3-MA）。

細胞鈣化檢測：（1）茜素紅S染色法：細胞干預8 d后，PBS洗滌3次，4%多聚甲醛固定細胞20 min，加入1%茜素紅S溶液，室溫下孵育20 min后，PBS洗滌細胞3次，普通光學顯微鏡下觀察鈣結節(jié)被染成紅色［7］。（2）細胞鈣沉積含量檢測（鄰甲酚酞絡合酮比色法）：每組設3個復孔，細胞干預8 d后，4℃PBS洗滌3次，每孔加入1 ml鹽酸（0.6 mol/L）進行細胞脫鈣，次日收集鹽酸檢測其鈣含量。將6孔板中的細胞洗滌3次，加入1 M NaOH/0.1% SDS裂解細胞，提取上清液，BCA法檢測細胞蛋白含量。結果以鈣含量/蛋白含量表示［5］。

VSMC內自噬體形成檢測：VSMC經鈣化培養(yǎng)基干預后，用0.25%胰蛋白酶消化，67.08 g離心5 min，迅速傾去部分培養(yǎng)基，重懸細胞并移入500 μl離心管中，67.08 g離心5 min，吸除上清液并迅速加入2%戊二醛固定細胞，4℃固定24 h，經脫水、浸透、包埋、修塊、切片、染色、制半薄切片后在透射電子顯微鏡下觀察自噬小體形成情況。每組3孔，每張片子觀察20個視野。

細胞免疫熒光檢測：細胞以1×104/L接種于激光共聚焦專用培養(yǎng)皿中，待細胞貼壁后鈣化培養(yǎng)基干預VSMC 8 d，4%多聚甲醛固定20 min，3‰的Triton-X100室溫破膜15 min，山羊血清封閉液封閉1 h，Runx2抗體（1：50，PBS稀釋）或LC-3Ⅱ抗體 （1：50，PBS稀釋）覆蓋細胞面，37℃水浴1h后放入4℃冰箱孵育過夜。次日，應用山羊抗兔Cy3或Dylight488熒光二抗室溫孵育1.5 h（PBS稀釋，1：100）。鬼筆環(huán)肽襯染細胞骨架（PBS稀釋，1：150），4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染細胞核（PBS稀釋，1：1），每個操作之后分別用PBS洗滌三次。50%甘油封片。激光共聚焦顯微鏡下分別觀察大鼠VSMC Runx2蛋白呈紅色熒光，LC-3Ⅱ蛋白呈綠色熒光。每張切片隨機攝取20個視野，計數(shù)每個VSMC中的LC3Ⅱ熒光點的個數(shù)，或計數(shù)VSMC細胞核表達Runx2陽性細胞數(shù)，分別計算平均值。

蛋白免疫印跡法檢測Runx2、α-SMA和LC-3Ⅱ蛋白表達水平：VSMC經鈣化培養(yǎng)基干預8 d，4℃PBS洗滌3次，160～180 μl細胞裂解液裂解細胞，收集含有VSMC的細胞裂解混合液并移入EP管中，超聲破碎儀進行超聲破碎，裂解15 min后高速離心并收集上清液。BCA法測定蛋白濃度，計算各組上樣量。配置8% 和12% SDS-PAGE凝膠，經電泳、轉膜、5%牛奶封閉后，分別敷抗Runx2蛋白抗體（1：1000稀釋）、抗α-SMA蛋白抗體（1：1000稀釋）和抗LC-3Ⅱ蛋白抗體（1：1000稀釋），4℃冰箱慢搖封閉一抗過夜。次日，敷抗GAPDH蛋白抗體（1：5000稀釋，Abbinke），室溫條件慢搖封閉1 h。應用UVP紫外激發(fā)光系統(tǒng)對硝酸纖維素膜（NC膜）進行激發(fā)光。用Image J軟件分析照片中蛋白條帶積分吸光度值，以目的蛋白值/內參蛋白值的比值反映目的蛋白相對水平。

2 結果

高磷對大鼠VSMC鈣化及成骨轉化標志物表達水平的影響（圖1）：在鈣化組中，隨著高磷誘導大鼠VSMC時間延長，鈣結節(jié)逐漸增多，鈣含量也逐漸升高，其中3.2 mmol/L Pi 6 d組和3.2 mmol/L Pi 8 d組大鼠的鈣含量顯著升高，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。蛋白免疫印跡結果顯示，在56 kDa（Runx2）和42 kDa（α-SMA）處分別可見特異性條帶。各組目的蛋白灰度值與GAPDH（37 kDa）的灰度值比較計算相對灰度值。與對照組相比，鈣化組3個亞組隨著鈣化培養(yǎng)基干預時間延長，大鼠成骨轉化標志物Runx2蛋白表達水平逐漸升高，VSMC標志蛋白α-SMA表達水平逐漸降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖1　高磷對大鼠血管平滑肌細胞鈣化及成骨轉化標志物表達水平的影響

高磷對大鼠VSMC自噬水平的影響（圖2）：與對照組相比，鈣化組3.2 mmol/L Pi誘導VSMC鈣化過程中大鼠自噬活性明顯升高，具體表現(xiàn)為3.2 mmol/L Pi 6 d組和3.2 mmol/L Pi 8 d組大鼠的LC3Ⅱ蛋白表達水平上調；透射電子顯微鏡觀察3.2 mmol/L Pi 8 d組大鼠VSMC自噬小體數(shù)量明顯增多（14.67±4.50），與對照組（2.03±1.62）相比，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖2　高磷對大鼠血管平滑肌細胞自噬水平的影響

3-MA對大鼠VSMC自噬水平的影響（圖3）：與對照組相比，鈣化組中3.2 mmol/L Pi 8d組大鼠LC3Ⅱ熒光分布明顯上升，平均每個細胞（15.62±3.09）個，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；應用自噬抑制劑3-MA后，鈣化+3-MA組大鼠LC3Ⅱ熒光分布明顯減少，平均每個細胞（4.98±0.84）個，與鈣化組中3.2 mmol/L Pi 8 d組相比差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖3　3-MA對大鼠平滑肌細胞自噬水平的影響

3-MA對大鼠VSMC鈣化與成骨標志物Runx2表達水平的影響（圖4）：與鈣化組相比，鈣化+3-MA組大鼠VSMC鈣含量增加。與對照組相比，鈣化組中3.2 mmol/L Pi 8d組大鼠VSMC中Runx2蛋白表達水平升高，表達Runx2陽性的細胞數(shù)為（35.4±7.16）個，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。鈣化+3-MA組大鼠VSMC Runx2表達陽性細胞數(shù)進一步增多，為（75.85±21.12）個，與鈣化組中3.2 mmol/L Pi 8 d組相比具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖4　激光共聚焦顯微鏡下觀察對照組、鈣化組和鈣化+3-MA組大鼠VSMC內Runx2表達

3 討論

動脈鈣化過去被認為是一種被動的鈣鹽沉積過程，是不可逆轉的退行性改變，這種認識阻礙了人們對治療動脈鈣化的進一步探索。近年來，一系列突破性研究讓人們對動脈鈣化本質認識發(fā)生了深刻轉變。動脈鈣化是由多種病理因素引起的主動、可調控的“異位成骨樣”過程，與正常骨骼中骨形成過程相似［8］。因此，尋找能夠有效控制VSMC成骨樣轉化和細胞外基質礦化的手段，是預防和治療動脈鈣化的關鍵。

自噬是存在于真核生物中一種溶酶體依賴性的自我降解途徑，是細胞自身的一種防御和調控機制。細胞在應對外界刺激時會啟動自噬程序，自噬小體將受損的細胞器吞噬并與溶酶體結合，降解成為氨基酸、核苷和脂肪酸等被細胞重新利用，合成新的分子或參與細胞器的合成，從而維持細胞的正常代謝和生存［9］。自噬分為3種類型：小自噬、大自噬和分子伴侶介導的自噬［10］。自噬也可分為選擇性和非選擇性自噬，其中選擇性自噬包括線粒體自噬、胞質到液泡的靶向運輸途徑、過氧化物酶體自噬等。線粒體自噬是研究相對較多的一種選擇性自噬，在ROS、饑餓狀態(tài)、細胞衰老等外界刺激作用下，細胞內線粒體去極化出現(xiàn)損傷，損傷線粒體被特異性的包裹進自噬體中并與溶酶體融合、降解，從而維持細胞內環(huán)境的穩(wěn)定，是一種保護機制［11］。

人體在衰老或罹患疾病時，細胞內線粒體受損傷，導致ROS大量蓄積，ROS能攻擊蛋白質、脂肪酸和核酸并且啟動氧化應激的連鎖反應，進而促使機體出現(xiàn)血管鈣化［12］。我們在研究中發(fā)現(xiàn)，在建立大鼠VSMC鈣化模型中，隨著磷酸鹽誘導時間延長，VSMC鈣化逐漸加重，成骨轉錄因子Runx2表達水平逐漸升高，同時細胞內自噬水平逐漸升高，主要表現(xiàn)為誘導第8天時LC3蛋白表達升高，自噬小體增多。自噬作為細胞內防御性調控機制，通過吞噬、降解損傷的線粒體從而降低氧化應激對細胞的損傷，從而通過減少ROS的釋放抑制VSMC成骨樣轉化即抑制VSMC鈣化形成。因此，自噬作為細胞水平的自我保護機制有可能成為防治動脈鈣化的新靶點。

Dai等［6］發(fā)現(xiàn)在高磷誘導的血管鈣化中，細胞自噬水平同時升高，而抑制細胞自噬則可導致平滑肌細胞釋放更多基質囊泡，加重了鈣化的進展。然而，利用丙戊酸外源性地誘導細胞自噬則能夠部分抑制VSMC鈣化。此外，Liu等［13］的研究發(fā)現(xiàn)，阿托伐他汀能夠通過抑制β-鏈蛋白信號通路進而外源性地誘導細胞自噬行為，以抑制轉化生長因子-β1誘導的VSMC鈣化。我們在本研究中也發(fā)現(xiàn)，使用自噬抑制劑3-MA抑制細胞內自噬，大鼠VSMC鈣化加重，同時VSMC成骨轉錄因子Runx2表達水平升高，與Dai等的研究結果相一致。上述結果提示，內源性的細胞自噬可能作為一種保護機制抑制動脈鈣化。通過外源性的上調細胞自噬水平和活性是否能抑制血管鈣化，有待于我們進一步深入研究。

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（編輯：朱柳媛）

Effect of Autophagy on Process of Phosphate Induced Vascular Smooth Muscle Cell Calcification in Experimental Rats

QIU Cui-ting，ZHENG Hai-jun，YU Wen-jun，LI Ai-qin，LI Huan，LV An-lin.
Department of Cardiology，Jiaozuo People’s Hospital，Jiaozuo （454000），Henan，China

Co-corresponding Authors：LI Huan，Email：lihuan816@yahoo.com and LV An-lin，Email：lvanlin@fmmu.edu.cn

Abstract

Objective：To explore the effect of autophagy on process of high phosphate salt induced vascular smooth muscle cell （VSMC） calcification in experimental rats.

Methods：Rats’ model of VSMC calcification was induced by phosphate incubation.VSMC were divided into 3 groups：①Control group，②Calcification group which included 3 subgroups as 4-day subgroup，the cells were cultured by 3.2 mmol/L phosphate for 4 days，6-day subgroup and 8-day subgroup，③Calcification+ 3-MA （autophagy inhibitor） group，in which the 8-day cells were cultured with 5mmol/L 3-MA.Calcium nodule formation and calcium deposition in VSMC were measured by Alizarin red staining and o-cresolphthaleincomplexone method，protein expressions of Runx2，α-SMA and LC3 II were examined by Western blot analysis，autophagosome formation in VSMC was measured by transmission electron microscope and the localization and expression of Runx2 and LC3 II in VSMC were observed by immunofluorescent microscope.

Results：Compared with Control group，the cells at 8-day subgroup showed more calcium nodules，higher calcium deposition，increased protein expressions of Runx2，LC3 II，more autophagosome and decreased α-SMA expression，all P＜0.05.Compared with 8-day subgroup，the cells in Calcification+3-MA group presented increased calcium deposition，decreasedfluorescence distribution of LC3 II and more cells with positive Runx2 protein expression，all P＜0.05.

Conclusion：Autophagy has the protective effect on process of phosphate induced VSMC calcification in experimental rats.

Key wordsAutophagy； Phosphate salts； Smooth muscle； Calcinosis

基金項目：國家自然科學基金（81170256）；陜西省科技計劃項目（2009K13-01）

作者簡介：邱翠婷碩士研究生主要從事動脈鈣化研究Email：qiucuiting87410@163.com通訊作者：李寰Email：lihuan816@yahoo.com呂安林Email：lvanlin@fmmu.edu.cn

中圖分類號：R54

文獻標識碼：A

文章編號：1000-3614（2016）05-0484-05

doi：10.3969/j.issn.1000-3614.2016.05.016

收稿日期：（2015-09-09）