馬英初，孫成林

（1.沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院 放射科，遼寧 沈陽(yáng)110024；2.普外一科）

自體靜脈移植被廣泛應(yīng)用于治療動(dòng)脈閉塞性疾病，但由于術(shù)后再狹窄嚴(yán)重影響了遠(yuǎn)期療效。血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)的異常增殖是靜脈移植術(shù)后再狹窄的主要病理基礎(chǔ)[1,2]，在血管內(nèi)膜增生及血管重塑中起重要作用。血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)是腎素血管緊張素系統(tǒng)的關(guān)鍵效應(yīng)分子，可刺激VSMC肥大和增殖，導(dǎo)致血管壁增厚、管腔縮小進(jìn)而導(dǎo)致血管狹窄，在血管重構(gòu)中占重要地位[3]。在人、犬血管組織中AngⅡ的生成主要是由糜酶介導(dǎo)的[4]。曲尼司特作為一種能穩(wěn)定肥大細(xì)胞膜的抗過(guò)敏藥，對(duì)糜酶的釋放及其介導(dǎo)的AngⅡ的生成起一定的抑制作用，本研究通過(guò)建立犬自體靜脈移植模型觀察曲尼司特對(duì)其術(shù)后再狹窄的影響。

1　材料與方法

1.1　試劑和器材

曲尼司特 (中國(guó)藥科大學(xué)制藥有限公司)，PCNA抗體及SP免疫組化染色試劑盒（武漢Boster公司），Trizol試劑盒購(gòu)自BBI公司等；圖像分析采用電子計(jì)算機(jī)圖像分析儀(Luzex-F NIRECO)。

1.2　動(dòng)物分組及模型的建立

成年健康犬12只，雌雄不限，體重約為10 kg。隨機(jī)分為兩組各6只：實(shí)驗(yàn)組每日給予曲尼司特50 mg/kg，對(duì)照組給予等量生理鹽水。喂藥采用強(qiáng)制灌胃法，喂藥一周后行靜脈移植術(shù)。術(shù)后繼續(xù)用藥兩周（劑量同前）。

3%戊巴比妥鈉（35 mg/kg）麻醉后，取頸部豎切口，游離出左側(cè)頸靜脈和頸總動(dòng)脈，取頸靜脈的分支長(zhǎng)約2 cm，將頸靜脈間置移植于頸總動(dòng)脈，吻合通暢后縫合切口。術(shù)后2周處死取材，取材血管分成兩部分，用于形態(tài)學(xué)觀察的部分常規(guī)福爾馬林固定，用于測(cè)定糜酶mRNA的部分經(jīng)0.9%氯化鈉溶液沖洗干凈后放入液氮保存。對(duì)照組未手術(shù)側(cè)正常頸靜脈分支作為空白對(duì)照組。

1.3　形態(tài)學(xué)觀察

靜脈血管常規(guī)福爾馬林固定、包埋，HE及彈力纖維染色，電子計(jì)算機(jī)圖象分析儀觀察內(nèi)膜厚度變化（血管橫截面內(nèi)膜，每60度測(cè)量1次該處內(nèi)膜厚度，共6處，計(jì)算平均厚度）。

1.4　增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）的觀察

標(biāo)本用PCNA抗體，SP法染色，定位于細(xì)胞核內(nèi)，陽(yáng)性結(jié)果為細(xì)胞核呈棕褐、棕黃、淺黃色。非移植頸靜脈作為空白對(duì)照，計(jì)數(shù)每個(gè)視野PCNA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，以陽(yáng)性細(xì)胞為分子計(jì)算PCNA表達(dá)指數(shù)并用百分比表示。

1.5　局部血管糜酶mRNA表達(dá)的測(cè)定

采用RT-PCR檢測(cè)糜酶mRNA的表達(dá)，樣品總RNA提取采用Trizol試劑盒，操作按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。chymase 上游引物：5’-gag gca gaa gct gag gag atc at-3’；下游引物：5’-gag cct gat cca ttg act tat ct-3’；產(chǎn)物長(zhǎng)度：431 bp。擴(kuò)增產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)掃描，軟件分析并計(jì)算chymase/β-actin吸光度(A)的比值。

1.6　統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 10.0進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以（±s）表示，行單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1　靜脈內(nèi)膜厚度(mm)及PCNA指數(shù)(%，±s)

表1　靜脈內(nèi)膜厚度(mm)及PCNA指數(shù)(%，±s)

注:*與空白對(duì)照組比較，P＜0.05；△與對(duì)照組比較，P＜0.05

組別　空白對(duì)照組　對(duì)照組　實(shí)驗(yàn)組內(nèi)膜厚度　0.34±0.19　1.87±0.74*　1.17±0.39*△PCNA 指數(shù)　0.21±0.13　32.14±3.87*17.62±2.81*△

圖1　各組糜酶mRNA的表達(dá)結(jié)果

2　結(jié)果

2.1　形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

靜脈移植術(shù)后對(duì)照組可見(jiàn)移植靜脈內(nèi)膜比正常非移植靜脈內(nèi)膜增生明顯(P＜0.05)，應(yīng)用曲尼司特后，與正常非移植靜脈相比移植靜脈內(nèi)膜有所增生(P＜0.05)，但與對(duì)照組相比移植靜脈內(nèi)膜增生受到抑制，內(nèi)膜的平均厚度均減少(P＜0.05)（表1）。

2.2　PCNA免疫組織化學(xué)結(jié)果

正常靜脈平滑肌細(xì)胞僅極少呈PCNA染色陽(yáng)性，對(duì)照組術(shù)后內(nèi)膜與中膜SMC的PCNA陽(yáng)性細(xì)胞明顯增多，而實(shí)驗(yàn)組PCNA指數(shù)均低于對(duì)照組，兩者之間差異有顯著性(P＜0.05)（表1）。

2.3　糜酶mRNA的表達(dá)結(jié)果

對(duì)照組血管糜酶表達(dá)較空白對(duì)照組明顯增加(P＜0.05)；曲尼司特組較對(duì)照組明顯下降 (P＜0.05)，接近空白對(duì)照組,與之比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)(圖 1)。

3　討論

近年研究證實(shí)，靜脈移植術(shù)后再狹窄的重要原因?yàn)檠芷交〖?xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞增生，而AngⅡ被認(rèn)為在此過(guò)程中起重要作用。人體局部組織（包括血管、腦、心等）存在著腎素-血管緊張素系統(tǒng)，能分泌血管緊張素，在調(diào)節(jié)肌性內(nèi)膜對(duì)血管損傷所發(fā)生的增生反應(yīng)方面起重要作用[3]。很多動(dòng)、靜脈壁均有血管緊張素轉(zhuǎn)換酶及其特異的AngⅡ受體[5]，當(dāng)AngⅡ與AngⅡ受體結(jié)合作用于VSMC，可刺激c-fos和c-myc原癌基因的表達(dá)，由于這些基因產(chǎn)物的介導(dǎo)作用，使VSMC表型轉(zhuǎn)換，由收縮型轉(zhuǎn)變成分泌型，并產(chǎn)生彈性蛋白、糖氨多糖及膠原等(形成再狹窄病變的主要成分)，導(dǎo)致靜脈VSMC增生[6]、血管狹窄。

人類心血管系統(tǒng)存在多種非血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)依賴的血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)生成途徑，其中又以糜酶(chymase)途徑最為重要。糜酶在正常血管組織中以非活性形式貯存于肥大細(xì)胞內(nèi)，免疫組化及原位雜交等實(shí)驗(yàn)方法都表明肥大細(xì)胞的分泌顆粒是合成和貯存糜酶的場(chǎng)所，當(dāng)肥大細(xì)胞受到如血管移植、導(dǎo)管損傷等強(qiáng)烈刺激時(shí)隨即被激活，并馬上將糜酶釋放到細(xì)胞外基質(zhì)，與底物AngⅠ結(jié)合生成AngⅡ，使AngⅡ濃度迅速升高，這表明糜酶主要在病變血管生成AngⅡ起重要作用[7,8]。本研究亦發(fā)現(xiàn)靜脈移植術(shù)后局部血管糜酶的mRNA表達(dá)顯著增加，而曲尼司特能明顯抑制其表達(dá)。

在犬頸動(dòng)脈球囊損傷模型中，Takai等[9]發(fā)現(xiàn)損傷后的頸動(dòng)脈局部?jī)?nèi)膜增生同時(shí)糜酶活性增大，而ACE活性無(wú)變化。給予糜酶抑制劑NK 3201后，局部頸動(dòng)脈血管的糜酶活性被明顯抑制，與對(duì)照組比較血管內(nèi)膜增生面積明顯減小，而血漿腎素和ACE活性無(wú)變化。提示NK3201通過(guò)抑制糜酶起到預(yù)防球囊損傷動(dòng)脈的內(nèi)膜增生的作用。說(shuō)明糜酶主要調(diào)節(jié)損傷的血管局部AngⅡ水平，而在正常血管組織和整體中對(duì)AngⅡ生成影響基本不起作用。

在本研究中發(fā)現(xiàn)正常靜脈PCNA陽(yáng)性細(xì)胞很少，提示細(xì)胞大多處于增殖靜止期，而在移植血管中陽(yáng)性細(xì)胞很多，說(shuō)明細(xì)胞增殖活性明顯增大，PCNA在血管細(xì)胞中陽(yáng)性率與血管內(nèi)膜增生程度呈正相關(guān)。研究還觀察到，移植術(shù)后血管內(nèi)膜的平均厚度和PCNA表達(dá)在實(shí)驗(yàn)組均降低，表明曲尼司特對(duì)移植靜脈增生內(nèi)膜的PCNA表達(dá)有抑制作用。靜脈移植術(shù)可導(dǎo)致糜酶的mRNA表達(dá)增加伴有細(xì)胞增殖和內(nèi)膜增厚的現(xiàn)象，而曲尼司特通過(guò)抑制糜酶mRNA的表達(dá)減輕細(xì)胞增殖和內(nèi)膜增厚的程度。曲尼司特作為一種能穩(wěn)定肥大細(xì)胞膜的抗過(guò)敏藥，可對(duì)糜酶的釋放及其介導(dǎo)的AngⅡ的生成起一定的抑制作用，進(jìn)而起到降低靜脈移植術(shù)后再狹窄的效應(yīng)。

總之，本研究通過(guò)建立犬靜脈移植模型觀察到曲尼司特對(duì)糜酶介導(dǎo)的血管組織增殖有抑制作用，證實(shí)了糜酶途徑在AngⅡ增高所致的VSMC增殖相關(guān)性疾病中起著重要作用，通過(guò)藥物阻斷糜酶途徑進(jìn)而抑制VSMC增殖，為臨床治療VSMC增殖相關(guān)性疾病(如血管移植術(shù)后再狹窄等)提供了一條新途徑。