宋　容，肖　覺，劉　佳，李光新，林一民

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提高免疫組織化學(xué)反應(yīng)的抗原修復(fù)技術(shù)

宋容1，肖覺1，劉佳1，李光新1，林一民2△

[摘要]目的探討不同抗原修復(fù)方法對免疫組織化學(xué)反應(yīng)結(jié)果的影響，以提高免疫組織化學(xué)染色陽性率。方法分別采用3種不同抗原修復(fù)方法作預(yù)處理后，進(jìn)行Envision免疫組織化學(xué)二步法檢測10種常用抗體的免疫組織化學(xué)染色效果。結(jié)果石蠟組織切片，免疫組織化學(xué)反應(yīng)的抗原修復(fù)方法預(yù)處理，采用高溫高壓抗原修復(fù)法，與微波抗原修復(fù)法及煮沸抗原修復(fù)法染色強(qiáng)度有明顯差異，高溫高壓抗原修復(fù)法明顯優(yōu)于微波法及煮沸法。結(jié)論預(yù)處理采用高溫高壓抗原修復(fù)法，既可提高免疫組織化學(xué)反應(yīng)陽性表達(dá)率，又能提高制片質(zhì)量，可以一次性用于大量組織切片，是一種理想的免疫組織化學(xué)反應(yīng)的抗原修復(fù)預(yù)處理方法。

[關(guān)鍵詞]抗原修復(fù)法；組織預(yù)處理；免疫組織化學(xué)

免疫組織化學(xué)技術(shù)已成為病理科實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)工作及科研工作中不可缺少的重要手段，廣泛應(yīng)用于臨床病理診斷[1]，幫助評價(jià)腫瘤的增生程度和分期，對患者預(yù)后、治療等方面起到了指導(dǎo)作用。但在日常工作中病理標(biāo)本都用10%中性福爾馬林液固定，經(jīng)過10%中性福爾馬林液固定的石蠟組織，會產(chǎn)生蛋白交聯(lián)反應(yīng)遮蔽了組織內(nèi)某些蛋白抗原，阻礙了抗原與抗體的結(jié)合。為了打開蛋白間的交聯(lián)，使被封閉的抗原充分暴露[2]，抗原修復(fù)技術(shù)在免疫組織化學(xué)染色過程中成為一個(gè)極其重要的環(huán)節(jié)[3]。不同抗原修復(fù)方法直接影響免疫組織化學(xué)反應(yīng)結(jié)果的表達(dá)，正確應(yīng)用抗原修復(fù)技術(shù)在免疫組織化學(xué)反應(yīng)實(shí)驗(yàn)中有著重要作用，常用的抗原修復(fù)技術(shù)有高溫高壓抗原修復(fù)法、微波抗原修復(fù)法、煮沸抗原修復(fù)法3種方法[4]，作者將3種方法進(jìn)行比較，探討高溫高壓抗原修復(fù)法對提高免疫組織化學(xué)反應(yīng)結(jié)果的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1資料與方法

1.1一般資料收集本研究所病理科2013～2014年25份腫瘤組織標(biāo)本(其中乳腺癌5份；胃癌5份；淋巴結(jié)5份；直腸癌5份；血管瘤5份)，用10%中性福爾馬林液固定，石蠟包埋，連續(xù)切片，3 μm厚，一式3份裱于經(jīng)防脫處理的載玻片上(高溫高壓組、微波爐組、煮沸組)。

1.2方法

1.2.1儀器與試劑(1)儀器：家用美的不銹鋼電壓力鍋1個(gè)，內(nèi)徑24 cm,型號為PCA405；美的SNC家用微波爐1臺，型號為KS2163；家用美的電磁爐1臺，型號為RK2102，煮鍋1個(gè)，內(nèi)徑24 cm。(2)試劑：實(shí)驗(yàn)選用Envision 2步染色法。一抗二抗、DAB試劑盒、0.01 mol/L檸檬酸緩沖溶液pH值6.0都購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。磷酸鹽緩沖液(PBS，0.01 mol/L pH值7.2～7.4)，自己配制。

1.2.2組織切片處理將石蠟組織切片裱于防脫玻片上，放在65 ℃烤片箱內(nèi)過夜烤片，常規(guī)組織切片放入二甲苯中脫蠟，梯度乙醇水化后，用蒸餾水沖洗3次，然后放入3%H2O2(過氧化氫溶液)中浸泡10 min，滅活內(nèi)源性的過氧化物酶的活性,蒸餾水沖洗3次，PBS液洗3×3 min，進(jìn)行3種抗原預(yù)處理。

表1　10種抗體采用3種抗原修復(fù)法免疫組織化學(xué)標(biāo)記陽性的表達(dá)情況(n=25)

/：此項(xiàng)無表達(dá)。

1.2.3高溫高壓抗原修復(fù)法將組織切片脫蠟入水后，抗原修復(fù)液0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖溶液(pH值6.0)1 000～1 500 mL倒入電壓力鍋內(nèi)，組織切片置于耐高溫塑料切片架上，輕輕放入電壓力鍋內(nèi)，組織切片必須位于液面下，蓋緊鍋壓閥，插上電源，將定時(shí)器調(diào)到6小格上，每小格30 s，當(dāng)電壓力鍋噴氣后維持2 min，這時(shí)電壓力鍋的紅燈變成綠燈，關(guān)閉電源，將噴氣閥門打開，放氣完后，打開電壓力鍋的蓋子自然冷卻至室溫。用蒸餾水沖洗3次，PBS液洗3×3 min，加入1∶100稀釋的一抗，37 ℃孵育2 h，PBS液洗3×3 min，加入二抗，37 ℃孵育30 min，PBS液洗3×3 min，加入DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，樹膠封片，觀察。

1.2.4微波抗原修復(fù)法將組織切片脫蠟入水后，抗原修復(fù)液0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖溶液(pH值6.0)100～150 mL倒入微波盒中，將組織切片置于耐高溫塑料切片架上，放入微波盒中，蓋緊蓋子，放入微波爐內(nèi)，先高火處理5 min，中火繼續(xù)處理10 min，使容器內(nèi)液體溫度保持在98 ℃左右。停火取出容器，冷卻至室溫。余下步驟與1.2.3相同。

1.2.5煮沸抗原修復(fù)法將組織切片脫蠟入水后，抗原修復(fù)液0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖溶液(pH值6.0)1 000～1 500 mL倒入煮鍋中，將組織切片置于耐高溫塑料切片架上，輕輕放入煮鍋內(nèi)，組織切片必須位于液面下，沸騰后計(jì)時(shí)30 min,熄火，冷卻至室溫。余下步驟與1.2.3相同。

1.2.6免疫組織化學(xué)染色檢測步驟參照試劑盒操作說明。PBS代替一抗體作為陰性對照。每一抗體均采用相同濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。采用雙盲法由2位主治以上病理醫(yī)生進(jìn)行評分，陽性表達(dá)判斷標(biāo)準(zhǔn)：抗原抗體結(jié)合物在細(xì)胞膜/細(xì)胞質(zhì)/細(xì)胞核出現(xiàn)均勻棕色細(xì)顆粒。免疫組織化學(xué)染色呈深棕色者定位強(qiáng)陽性(+++)，陽性細(xì)胞數(shù)占50%～80%；淺棕黃色定為弱陽性(+)，陽性細(xì)胞數(shù)占10%～<20%；介于二者之間的定為陽性(++)，陽性細(xì)胞數(shù)占20%～<50%；每張切片觀察10個(gè)高倍視野，數(shù)100個(gè)腫瘤細(xì)胞。結(jié)果以“染色強(qiáng)度/陽性細(xì)胞數(shù)比例”表示。

2結(jié)果

選取本病理科室最常用10種抗體分別進(jìn)行3種抗原修復(fù)法免疫組織化學(xué)標(biāo)記，其中9種抗體試劑盒操作說明推薦方法都是相同的熱修復(fù)方法，1種抗體試劑盒操作說明推薦方法是不需要熱修復(fù)，而熱修復(fù)包括高溫高壓抗原修復(fù)法、微波抗原修復(fù)法、煮沸抗原修復(fù)法3種方法。采用熱修復(fù)方法不同，實(shí)驗(yàn)結(jié)果也不同。作者通過臨床研究發(fā)現(xiàn)，有3種抗體(如CD34、HER_2、CEA)分別采用3種抗原修復(fù)方法預(yù)處理后，染色結(jié)果一致，均為陽性；另外4種抗體(如LCA、CD45RO、CD79a、CK)，分別采用3種抗原修復(fù)方法預(yù)處理后，染色結(jié)果不一致，高溫高壓抗原修復(fù)法比其他兩種抗原修復(fù)法染色結(jié)果強(qiáng)；抗原表達(dá)在細(xì)胞核的3種抗體(如ER、PR、P53)，分別采用3種抗原修復(fù)方法預(yù)處理后，染色結(jié)果不一致，高溫高壓抗原修復(fù)法比其他兩種抗原修復(fù)法染色結(jié)果更強(qiáng)，有3種抗體采用3種抗原修復(fù)法處理結(jié)果一致，而高溫高壓抗原修復(fù)法比其他兩種抗原修復(fù)法提高陽性表達(dá)的有7種，而且核內(nèi)表達(dá)者更加明顯。10種抗體3種抗原修復(fù)法免疫組化標(biāo)記陽性的表達(dá)結(jié)果，見表1。

3討論

免疫組織化學(xué)染色過程中抗原修復(fù)是一個(gè)重要環(huán)節(jié)，不恰當(dāng)?shù)目乖迯?fù)可以導(dǎo)致假陽性或假陰性的結(jié)果。病理標(biāo)本大部分都采用10%中性福爾馬林液固定，組織固定過程中，組織中的蛋白質(zhì)分子交聯(lián)增加，抗原決定簇被封閉，在很大程度上影響免疫組織化學(xué)反應(yīng)結(jié)果充分表達(dá)[5]。要提高免疫組織化學(xué)反應(yīng)陽性表達(dá)率及制片質(zhì)量，就必須有一種較好的抗原修復(fù)方法。

加熱抗原修復(fù)(heat-induced-antigen retrieval,AR)技術(shù)是免疫組織化學(xué)發(fā)展史上重要里程碑[6]，3種抗原修復(fù)的原理大致相同，通過高頻電磁波或高溫高壓作用，將組織中因用交聯(lián)性固定劑甲醛處理而形成的醛鏈打開，使抗原充分暴露，達(dá)到修復(fù)的目的[7-8]。本實(shí)驗(yàn)通過對比3種不同抗原修復(fù)方法預(yù)處理進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)使用高溫高壓抗原修復(fù)方法預(yù)處理，明顯優(yōu)于微波修復(fù)。因?yàn)楦邷馗邏耗芸朔⒉t使用中出現(xiàn)的批次差異和“冷熱斑”的現(xiàn)象[9]，認(rèn)為高溫高壓比其他加熱方法更均一。電壓力鍋在15 Psi全壓時(shí)，溫度可達(dá)120 ℃ 左右。這樣溫度對一些核抗原的去遮蔽作用顯示出明顯優(yōu)越。使更多的抗原得以暴露，使一些假陰性，弱陽性的標(biāo)本得到陽性表達(dá)，組織陽性定位清晰，背景著色淺，非特異性著色弱，可以提高抗原抗體陽性檢測率，操作簡單，消耗時(shí)間短，陽性表達(dá)率較微波抗原修復(fù)法強(qiáng)；而微波法抗原修復(fù)時(shí)，因微波爐加熱范圍狹小，使組織切片接受微波的輻射不均勻而且量小，導(dǎo)致不同區(qū)域組織切片的處理強(qiáng)度也不一致，有明顯的邊緣效應(yīng)，從而出現(xiàn)不同區(qū)域染色深淺不一的顯色現(xiàn)象。同時(shí)微波爐熱修復(fù)容易發(fā)生緩沖液干凅導(dǎo)致干片的現(xiàn)象，以及修復(fù)時(shí)間較長，組織易脫片[10]等多種弊端；而煮沸抗原修復(fù)時(shí)，抗原修復(fù)時(shí)間長，溫度不易控制，也易使切片受熱不均可導(dǎo)致組織的抗原活性恢復(fù)較差，從而影響免疫組化反應(yīng)結(jié)果。高溫高壓抗原修復(fù)法明顯優(yōu)于微波抗原修復(fù)法與煮沸抗原修復(fù)法[11]。

從目前關(guān)于免疫組織化學(xué)反應(yīng)的抗原技術(shù)的研究中發(fā)現(xiàn)，高溫高壓抗原修復(fù)靈敏度高，特異性強(qiáng)，結(jié)果穩(wěn)定，重復(fù)性好，一次可以修復(fù)大量組織切片，而且修復(fù)液可以反復(fù)使用。節(jié)約時(shí)間，提高工作效率[12]，本研究也證明了這一點(diǎn)。本文列舉了常用的10種抗體，是否符合免疫組織化學(xué)檢測的所有抗體，還有待今后的繼續(xù)研究證明，總之，高溫高壓抗原修復(fù)法是一種可提高免疫組織化學(xué)反應(yīng)的較理想的預(yù)處理方法，值得推廣應(yīng)用。

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(重慶市腫瘤研究所：1.病理科；2.檢驗(yàn)科，重慶 400030)

作者簡介：宋容 (1964-)，副主任技師，大學(xué)?？疲饕獜氖虏±砬衅|(zhì)量管理工作。△通訊作者，Tel:13677608556；E-mail:2602214857@qq.com。

doi:·經(jīng)驗(yàn)交流·10.3969/j.issn.1671-8348.2016.04.038

[中圖分類號]R446.8

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]B

[文章編號]1671-8348(2016)04-0540-03

(收稿日期：2015-06-08修回日期：2015-10-21)