陳慧軍許 寧陳少豪 陳錦添 李曉東 蔡 海 薛學義 魏 勇鄭清水福建醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院泌尿外科 （福州　350005）

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不同前列腺癌細胞株Talin-1表達情況和侵襲能力關系研究*

陳慧軍△許 寧△陳少豪 陳錦添 李曉東 蔡 海 薛學義 魏 勇**鄭清水
福建醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院泌尿外科 （福州350005）

摘要目的 探討踝蛋白1（Talin-1）在不同前列腺癌細胞株中的表達情況和侵襲能力的關系。方法體外培養(yǎng)不同人前列腺癌細胞株（DU-145、PC-3、LNCaP）及人正常前列腺上皮細胞株（RWPE-1）。傳代培養(yǎng)后利用MTT法檢測各細胞株增殖能力。細胞劃痕實驗，Transwell小室侵襲和遷移實驗檢測各細胞株侵襲及遷移能力。RT-PCR技術檢測各細胞株中Talin-1的mRNA表達水平。Western-blot技術檢測各細胞株中Talin-1的蛋白表達水平。結(jié)果 與RWPE-1細胞株相比，LNCaP細胞株、PC-3細胞株、DU145細胞株的增殖、侵襲和遷移能力明顯增高（P＜0.05），其中LNCaP、PC-3、DU-145細胞株的增殖、遷移以及侵襲能力依次遞增（P＜0.05）。前列腺癌LNCaP細胞株、PC-3細胞株、DU145細胞株中的Talin-1 mRNA及蛋白表達水平顯著高于RWPE-1細胞株（P＜0.05）；其中LNCaP、PC-3、DU-145細胞株中的Talin-1 mRNA以及蛋白表達水平依次遞增（P＜0.05）。結(jié)論Talin-1與前列腺癌的增殖、侵襲和遷移能力相關；低表達Talin-1的前列腺癌的增殖、侵襲和遷移能力低，惡性度低；高表達Talin-1的前列腺癌的增殖、侵襲和遷移能力強，惡性度高。Talin-1可作為前列腺癌惡性度的預測指標之一。

關鍵詞前列腺腫瘤； 細胞支架蛋白質(zhì)類；腫瘤侵潤

△共同第一作者

前列腺癌（Prostate cancer， PCa）是西方國家男性最常見的惡性腫瘤之一，近年我國特別是沿海地區(qū)前列腺癌的發(fā)病率也逐年上升［1， 2］。前列腺癌如果發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，5年生存率將降到28%左右［3］。目前認為腫瘤轉(zhuǎn)移同腫瘤細胞自身基因表達的改變以及腫瘤周圍微環(huán)境的變化有關［4］。前列腺癌轉(zhuǎn)移是一個復雜多步驟的過程，主要包括腫瘤細胞脫離，細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）退化、細胞遷移、獨立錨增長、細胞凋亡、新血管形成、侵入周圍組織，細胞黏附、移動并嫁接到身體遠處部位等［5］。

踝蛋白1（Talin-1）是一種高分子量的細胞骨架蛋白，主要位于細胞和細胞外基質(zhì)間的黏性復合物上，起到調(diào)節(jié)整合素（integrin）和黏著斑信號（focal adhesion signaling）的作用［6］，并與黏附激酶（Focal Adhesion Kinase，F(xiàn)AK）和肌動蛋白相結(jié)合，誘發(fā)細胞骨架重構(gòu)，導致細胞黏附和遷移［7］。研究發(fā)現(xiàn)Talin-1的表達促進腫瘤細胞的黏附、遷移、侵襲以及抗凋亡。Jin等［8］發(fā)現(xiàn)Talin-1磷酸化通過激活β1-整合素蛋白促進前列腺癌骨轉(zhuǎn)移。

本研究探討Talin-1在不同前列腺癌細胞株中的表達差異及與前列腺癌細胞生物學特性關系。

材料和方法

一、材料

人前列腺癌細胞株（D U - 1 4 5、P C - 3、LNCaP）、人正常前列腺上皮細胞株（RWPE-1）和羊抗小鼠IGG-HRP均購自福州鼎國生物科技有限公司。DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清均購自美國Hyclone公司；胰蛋白酶和DMSO均購自美國GIBCO公司；DAPT購自美國Sigma公司；Talin-1抗體購自abcom公司；RNA 提取試劑盒Trizol Reagent購自Invitrogen公司。其余有關分子生物學試劑均由福建醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院中心實驗室提供。

二、方法

（一）MTT增殖實驗

根據(jù)混入油品在氣測上的響應特征，可進一步區(qū)分真假油氣顯示?，F(xiàn)以國內(nèi)某油田一水平井為例，分析如何識別混油情況下的油氣層特征。

取對數(shù)期細胞，調(diào)整細胞懸液濃度，孵育至細胞單層鋪滿孔底（5%CO2，37℃），加入對應濃度藥物。孵育16～48h，倒置顯微鏡觀察。若藥物與MTT能夠反應，可先離心后棄去培養(yǎng)液，用PBS沖2～3遍后，再加入含MTT培養(yǎng)液。終止培養(yǎng)吸去孔內(nèi)液。每孔加入二甲基亞砜150μL，搖床低速振蕩10min，溶解結(jié)晶物。酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上490nm波長測定各孔光密度值（OD）并記錄結(jié)果。

（二）細胞劃痕實驗

取對數(shù)期細胞，稀釋調(diào)整細胞密度，制備單層細胞。用移液槍槍頭在單層細胞上呈“一”字劃痕，孵育24h。吸去培養(yǎng)液，用PBS清洗3次后，在倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

（三）Transwell小室

取對數(shù)期細胞，細胞饑餓1 2 h，接種于Transwell小室，于37℃、5%CO2飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng)。24h后取出Transwell小室，PBS沖洗2次后倒置小室，自然風干。甲醛固定，結(jié)晶紫染色，高倍鏡下分別選擇上下左右及中間5個視野，統(tǒng)計視野中細胞數(shù)，以穿膜細胞數(shù)表示各組細胞的侵襲和遷移能力。

（四）RT-PCR檢測前列腺細胞中mRNA的表達

T a l i n - 1 m R N A引物：上游引物5’-TCGTCCCAAAATGCCAAGAAC-3’，下游引物5’-TGGCTATTGGGGTCAGAGAC-3’，擴增片斷長度為276bp。內(nèi)對照β-actin引物：上游引物5‘-AGCGAGCATCCCCCAAAGTF-3’，下游引物5’-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3’，擴增片斷長度為285bp。取對數(shù)期細胞，按照Trizol試劑盒說明提取總RNA，每份細胞總RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA模板鏈后，取2μL cDNA模板配置25μL PCR反應體系，震蕩混勻后短暫離心，置于PCR擴增儀中擴增。用微量移液器將sybr green熒光染料1μL、擴增后DNA樣品5μL和DNAMaker 5μL混勻后再緩慢加到電泳槽內(nèi)，接通電源，當樣品各條帶已跑到預期位置，切斷電源。紫外照相并進行分析掃描。mRNA表達相對值=目的片段光密度值/β-actin光密度值。

（五）蛋白印跡（Western blot）分析蛋白的表達

取對數(shù)期細胞，裂解離心得到總蛋白，采用bradford比色法測定蛋白含量。SDS PAGE電泳分離40μL樣本，利用電轉(zhuǎn)印法使蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，4℃封閉過夜后加入一抗孵育2h，TBST洗滌3次后加入辣根過氧化物酶標記的二抗進行孵育（37℃，1h），孵育結(jié)束后TBST再次洗滌3次，最后曝光顯影。

三、統(tǒng)計學方法

應用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)以（x±s）的形式表示，單因素方差分析（One-way ANOVA）對不同組間數(shù)據(jù)差異進行比較，SNK法（Student-Newman-Keuls）數(shù)據(jù)之間差異進行兩兩比較。檢驗水準 α=0.05，以P＜0.05 為有統(tǒng)計學意義。

結(jié)　果

一、不同前列腺細胞株的增殖情況比較

與RWPE-1細胞株相比，前列腺癌LNCaP細胞株、前列腺癌PC-3細胞株、前列腺癌DU145細胞株的細胞增殖能力明顯增高（P＜0.05），其中LNCaP、PC-3、DU-145細胞株中的增殖能力依次遞增，組間兩兩比較均有統(tǒng)計學差異（P＜0.05），見表1。

二、不同前列腺細胞株的遷移情況分析

與RWPE-1細胞株相比，前列腺癌LNCaP細胞株、PC-3細胞株、DU145細胞株的遷移距離明顯增高（P＜0.05），其中LNCaP、PC-3、DU-145細胞株中的侵襲和遷移能力依次遞增，組間兩兩比較均有統(tǒng)計學差異（P＜0.05），見表2、圖1。

表11　不同前列腺細胞株的增殖情況

表22　不同種前列腺細胞株2244hh遷移距離

圖11　不同前列腺細胞株遷移能力（×200）A：DU-145細胞株；B：PC-3細胞株；C：LNCaP細胞株；D：RWPE-1細胞株

三、不同前列腺細胞株的侵襲能力

與RWPE-1細胞株相比，在Transwell小室侵襲和遷移實驗中，前列腺癌LNCaP細胞株、前列腺癌PC-3細胞株、前列腺癌DU145細胞株的侵襲和遷移能力明顯增高（P＜0.05），其中LNCaP、PC-3、DU-145細胞株中的侵襲和遷移能力依次遞增，組間兩兩比較有統(tǒng)計學差異（P＜0.05），見表3、圖2。

表33　比較不同前列腺細胞株的侵襲能力（xx±ss）

圖22　不同前列腺細胞株的侵襲能力（×200）A：DU-145細胞株；B：PC-3細胞株；C：LNCaP細胞株；D：RWPE-1細胞株

四、Talin-1 mmRRNNAA在不同前列腺細胞株中的表達水平

與RWPE-1細胞株相比，前列腺癌LNCaP細胞株、PC-3細胞株、DU145細胞株中的Talin-1 mRNA表達水平有差異（P＜0.05）；其中LNCaP、PC-3、DU-145細胞株中的Talin-1 mRNA表達水平依次遞增，組間兩兩比較有統(tǒng)計學差異（P＜0.05），見表4、圖3。

表44　不同前列腺細胞株中Talin-1 mmRRNNAA表達水平（xx±ss）

圖33　不同前列腺細胞株中Talin-1 mmRRNNAA擴增和溶解曲線

五、Talliinn--11在不同前列腺細胞株中的表達水平

與RWPE-1細胞株相比，在前列腺癌LNCaP細胞株、前列腺癌PC-3細胞株、前列腺癌DU145細胞株中的Talin-1蛋白表達水平有差異（P＜0.05）；其中LNCaP、PC-3、DU-145細胞株中的Talin-1蛋白表達水平依次遞增，組間兩兩比較有統(tǒng)計學差異（P＜0.05），見表5、圖4。

表55　不同前列腺細胞株中Talliinn--11的蛋白表達水平（xx±ss）

圖44　不同前列腺細胞株中Talliinn--11蛋白印跡圖

討　論

Talin-1廣泛存在于哺乳動物細胞中，可與多種黏附分子和肌動蛋白相結(jié)合，誘發(fā)細胞骨架重構(gòu)，導致細胞黏附和遷移。Talin-1與β-整合素結(jié)合后招募整合素連接激酶（Integrin-linked-kinase，ILK）和FAK并激活下游信號，促進腫瘤細胞增殖、侵襲和血管生成［9］。

研究表明Talin-1在腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。Fang等［10］認為Talin-1與人肝細胞癌轉(zhuǎn)移和侵襲能力顯著相關，可作為肝細胞癌診斷和治療重要分子靶標。Bostanci 等［11］發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌患者術前血清樣本Talin-1水平比正常人顯著增高，并且與結(jié)腸癌分級、分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況密切相關。Lai等［12］發(fā)現(xiàn)Talin-1高表達是口腔鱗狀細胞癌不良預后的主要因素，敲除tain-1相關基因后可減弱口腔鱗癌細胞株增殖和侵襲能力。Xing等［13］發(fā)現(xiàn)Talin-1抗體或反義RNA可抑制Talin-1與β-整合素間相互作用，并破壞子宮頸癌細胞（Hela細胞）及成纖維素細胞應力纖維，導致細胞黏附、伸展以及遷移能力降低。Zhang等［9］發(fā)現(xiàn)Talin-1在前列腺癌細胞株中高表達，并且與侵襲力成正相關，靶向抑制Talin-1表達后，前列腺癌細胞遷移、侵襲能力下降。Sakamoto等［14］同樣發(fā)現(xiàn)Talin-1在前列腺癌細胞中過度表達，通過激活生存信號和產(chǎn)生抗失巢凋亡來增強前列腺癌細胞黏附，遷移和侵襲。

本研究通過體外培養(yǎng)不同人前列腺癌細胞株（DU-145、PC-3、LNCaP細胞株）及人正常前列腺上皮細胞株（RWPE-1）發(fā)現(xiàn)：前列腺癌細胞增殖、侵襲和遷移能力明顯高于人正常前列腺上皮細胞，并且在前列腺癌三組不同細胞株中，隨著腫瘤惡性度增高，其增殖、侵襲和遷移能力也逐漸升高。通過分析不同前列腺細胞株中Talin-1 mRNA和Talin-1蛋白表達水平發(fā)現(xiàn)， RWPE-1、LNCaP、PC-3及DU-145細胞株中，Talin-1 mRNA和Talin-1蛋白表達水平依次遞增，由此推測Talin-1與前列腺癌的增殖、侵襲和遷移能力可能相關，低表達Talin-1的前列腺癌增殖、侵襲和遷移能力低，惡性度低；高表達Talin-1的前列腺癌侵襲和遷移能力高，惡性度高。本研究是初步研究，Talin-1影響細胞遷移和侵襲的具體作用機制和調(diào)控尚未明確，有待進一步探討。

參 考 文 獻

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（2016-02-18收稿）

doi：10.3969/j.issn.1008-0848.2016.03.004

中圖分類號R 737.25

*基金項目資助：福建省自然科學基金資助項目（2015J01393）；福建省創(chuàng)新基金資助項目（2014-CX-20）**通訊作者，E-mail：urologyfujian@163.com

The expression of Talin-1 is correlated with increased invasion and migration in different prostate cancer cells*

Chen Huijun△， Xu Ning△， Chen Shaohao， Chen Jintian，Li Xiaodong， Cai Hai， Xue Xueyi ， Wei Yong**， Zheng Qingshui
Departments of Urology， The First Affi liated Hospital to Fujian Medical University， Fuzhou 350005， China Corresponding author： Wei Yong， E-mail： urologyfujian@163.com

AbstractObjective To investigate the different expressions of Talin-1 in different prostate cancer cells and its signifi cance in invasive and migration. Methods：Human prostate cancer cells （DU-145， PC-3， LNCaP） and normal human prostate epithelial cell RWPE-1 were cultured， and their proliferation， migration and invasion ability were measured by MTT， would healing assay and boyden chamber assay， respectively. The mRNA and protein expressions of Talin-1 were detected by real-time PCR and western blot， respectively. RessuullttssCompared with those of RWPE-1 cells， proliferation，invasion and migration of three prostate cancer cells were all signifi cantly enhanced （P＜0.05）. The proliferation， invasion and migration abilities of LNCaP， PC-3 and DU-145 cells were gradually increased in turn （P＜0.05）. The mRNA and protein expressions of Talin-1 in prostate cancer cells were obviously higher than that in normal human prostate epithelial cells （P＜0.05）. The mRNA and protein expressions of Talin-1 in LNCaP， PC-3 and DU-145 cells were elevated gradually in turn （P＜0.05）. ConcluussiioonnExpression level of Talin-1 may be associated with the proliferation， invasion and migration of prostate cancer cells. Talin-1 could serve as a predictor of malignant degree of prostate cancer．

Key wordsprostatic neoplasms；cytoskeletal proteins；neoplasm invasiveness