徐愛明 張建中 柳長坤 陳 偉　趙 凱華藝博 王海南 奚 偉 劉邊疆王增軍南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科實(shí)驗(yàn)室（南京　210029）

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人類精子VDAC2 基因啟動(dòng)子在小鼠GC-2spd細(xì)胞的克隆和報(bào)告基因載體構(gòu)建*

徐愛明 張建中 柳長坤 陳 偉趙 凱華藝博 王海南 奚 偉 劉邊疆**王增軍**
南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科實(shí)驗(yàn)室（南京210029）

摘要目的線粒體電壓依賴性陰離子通道蛋白2（Voltage-dependent anion channel 2，VDAC2）是VDAC重要的家族成員，參與機(jī)體眾多的生理活動(dòng)和病理疾病的發(fā)生發(fā)展。本次研究目的主要是確定和驗(yàn)證人VDAC2基因啟動(dòng)子的活性，為進(jìn)一步探究它的調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。方法通過從正常人射出的精子中提取基因組DNA。利用軟件預(yù)測啟動(dòng)子區(qū)，我們針對(duì)性設(shè)計(jì)三對(duì)引物并正確的擴(kuò)增出來。將驗(yàn)證正確的啟動(dòng)子序列結(jié)合到質(zhì)粒PDS_ psiCHECK-2中，轉(zhuǎn)染到小鼠GC-2細(xì)胞中去。轉(zhuǎn)染48h后，通過雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測預(yù)測片段的啟動(dòng)子活性。結(jié)果VADC2基因上游-2000～+1000bp具有相對(duì)較高的活性。結(jié)論這是首次對(duì)人類精子中VDAC2基因啟動(dòng)子的確定和活性驗(yàn)證，為后續(xù)研究VDAC2基因在精子的發(fā)生發(fā)展以及弱精子癥方面提供新的研究思路。

關(guān)鍵詞VDAC2基因；雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)；啟動(dòng)區(qū)（遺傳學(xué)）；精子

線粒體電壓依賴性陰離子通道蛋白（Voltagedependent anion channel，VDAC），首次在草履蟲線粒體外膜中以有活性的孔道蛋白發(fā)現(xiàn)［1，2］。自發(fā)現(xiàn)以來， VDAC 蛋白結(jié)構(gòu)研究一直處于瓶頸期，直到2008年三個(gè)來自不同國家的研究小組同時(shí)發(fā)現(xiàn)VDAC蛋白結(jié)構(gòu)信息打破了這一瓶頸［2-5］。2010年，De Pinto等運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR（qPCR）定量赫拉細(xì)胞中VDAC基因表達(dá)，稱表達(dá)量比VDAC1高10倍的為VDAC2，表達(dá)量比VDAC2高100倍的為VDAC3來區(qū)別VDAC的同源體［6］。如今在高等真核生物中，三種同源體分辨編碼三種不同的蛋白，每種蛋白與其他亞型有70%的相似度［7， 8］。VDAC通道有明顯的電壓依賴性和離子選擇性［9］。在膜兩側(cè)電壓比較低的時(shí)候，VDAC通道一直處于有活性的狀態(tài)，允許大分子物質(zhì)如ATP，穿過脂質(zhì)雙分子層；在電壓比較高的時(shí)候，VDAC保持多種活性狀態(tài)從而保證多種離子或蛋白通過［10-12］。

VDAC2是VDAC家族中重要的一員，參與精子發(fā)生能量代謝的調(diào)控。類似于VDAC3，VDAC2存在于睪丸組織和精子中［13， 14］。在2009年，Menzel首次報(bào)道了從牛的精子中分離純化出VDAC2蛋白，并發(fā)現(xiàn)位于膜外側(cè)的VDAC2、VDAC3主要分布于精子鞭毛的外周致密纖維層（ODF， outer dense fibers）。這說明VDAC2蛋白具有能夠維持彈性結(jié)構(gòu)和精子鞭毛的彈性回縮功能，保護(hù)精子不被從附睪中射出來時(shí)產(chǎn)生的剪切力的損傷［14， 15］。

VDAC在男性不育中有重要的作用［16］。在我們前期研究中，我們收集了正常成年男性的精子樣本，首次檢測到VDAC蛋白在人類精子中的表達(dá)，尤其是在精子鞭毛區(qū)［17］。我們進(jìn)一步比較了VDAC各亞型蛋白在正常成年男性和特發(fā)性弱精子癥患者中精子樣本表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)精子活力與VDAC2蛋白有相關(guān)性［16， 18］。然而，正如VDAC3缺乏小鼠患有特發(fā)性弱精子癥一樣，具體機(jī)制仍然不是十分清楚［19］。

眾所周知，單核苷酸多態(tài)性和組蛋白修飾，后者往往是甲基化修飾，調(diào)控基因的表達(dá)。在我們前期的工作中，我們通過對(duì)中國漢族人群分析，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)VDAC2基因的多態(tài)性與特發(fā)性弱精子癥無相關(guān)性。由此，我們進(jìn)一步探討異常的基因甲基化調(diào)節(jié)VDAC2蛋白的表達(dá)從而導(dǎo)致男性特發(fā)性弱精子癥的發(fā)生。

材料和方法

一、材料和試劑

（一）細(xì)胞、菌株、質(zhì)粒

小鼠精原細(xì)胞株GC-2spd由南京醫(yī)科大學(xué)國家重點(diǎn)生殖實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)送。報(bào)告基因載體psi_CHECK-2（內(nèi)接螢光蟲熒光素酶報(bào)告基因firefly luciferase和接海腎熒光素酶報(bào)告基因）購自上海諾百生物化學(xué)有限公司。大腸桿菌DH5α由泌尿外科實(shí)驗(yàn)室保存。

（二）試劑

全基因組提取試劑盒購自日本TaKaRa公司，引物主要由上海英俊公司（Invitrogen合成）合成，Taq DNA聚合酶、dNTP、T4連接酶、DNA Marker購自美國Fermentas公司。轉(zhuǎn)染試劑盒Lipofectamine2000TM購自上海英俊公司。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒購自Promega公司。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司。

二、方法

（一）基因組DNA提取和基因組克隆

我們利用全基因組提取試劑盒，按照操作說明書，從人類正常人精子標(biāo)本中提取全基因組DNA。

（二）引物設(shè)計(jì)及和PCR反應(yīng)產(chǎn)物的回收

根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則，采用Omiga 2.0軟件對(duì)Promoter Scan預(yù)測的-2000 ～ +1000bp的序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)（表1）。分別引入KpnI/ NheI酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基，引物由invitrogen公司合成。以人類精子全基因組DNA為模板，分三段擴(kuò)增長度為3000bp的人VDAC2基因啟動(dòng)子片段（40個(gè)循環(huán)，95℃ 15s，60℃ 1min，退火溫度70℃，1min）。用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴(kuò)增片段，并用膠回收試劑盒純化擴(kuò)增產(chǎn)物。

表11　內(nèi)參及VVDDAACC22啟動(dòng)子各段擴(kuò)增引物

（三）人VDAC2基因啟動(dòng)子報(bào)告基因載體構(gòu)建利用獲得的人VDAC2基因啟動(dòng)子片段構(gòu)建了VDAC2啟動(dòng)子報(bào)告基因。為此限制性內(nèi)切酶KpnI/ NheI分別酶切擴(kuò)增產(chǎn)物和psi_CHECK-2載體質(zhì)粒。挑菌培養(yǎng)，酶切電泳并送測序鑒定。T4連接酶將酶切產(chǎn)物于16℃過夜反應(yīng)連接，轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞DH5α中并擴(kuò)增。得到的產(chǎn)物命名為psi_CHECK-2-VDAC2。設(shè)立陰性對(duì)照質(zhì)粒psi_CHECK-2-NC。

（四）細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

GC-2spd細(xì)胞用10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基，于37.5℃，5% CO2細(xì)胞孵箱內(nèi)培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞擴(kuò)增至80%～90%融合時(shí)用0.25%胰酶消化，以5×105細(xì)胞/mL密度接種于6孔板中。待細(xì)胞長至60%～70%融合時(shí)，提前1h換無雙抗培養(yǎng)基。對(duì)每種細(xì)胞用lipofectamine2000分別轉(zhuǎn)染miRNA和質(zhì)粒組合，另設(shè)1組為轉(zhuǎn)染對(duì)照。各組均設(shè)3個(gè)重復(fù)。轉(zhuǎn)染過夜后換液，并繼續(xù)培養(yǎng)至48h。

（五）雙熒光素酶報(bào)告基因檢測

按照雙熒光素酶檢測試劑盒（Dual Lueiferase Assay System）的操作說明書，吸除轉(zhuǎn)染48h后的6孔板上清液，PBS洗兩遍，加細(xì)胞裂解液300μL，置冰上裂解10min，收集裂解液，12 092×g，離心5min。每個(gè)樣品取100μL裂解液，加100μL firefly檢測試劑，記錄RLU（relative light unit）值；再加100μL檢測工作液，記錄第二個(gè)RLU值分別讀出載體熒光素酶活性劑內(nèi)參質(zhì)粒熒光素酶活性數(shù)值，兩者之比為熒光素酶相對(duì)活性值。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有統(tǒng)計(jì)在SPSS20.0軟件內(nèi)完成。數(shù)據(jù)資料采用Student's-t檢驗(yàn)。P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)　果

一、人精子VVDDAACC22基因啟動(dòng)子片段擴(kuò)增結(jié)果

以正常成年男性精子基因組D N A為模板擴(kuò)增VDAC2基因啟動(dòng)子目的片段3 0 0 0 b p（-2000～+1000），電泳結(jié)果（見圖1）顯示于3000bp處見明亮清晰條帶影，與預(yù)期位置相符。

圖11　人VVDDAACC22啟動(dòng)子片段KpnI/ NNhheeII雙酶切結(jié)果鑒定

M：3000 bp DNA Marker，2-5為psi_CHECK-2-VDAC2，6-9為重復(fù)。其中，2-4、6-8為啟動(dòng)子分三段的產(chǎn)物，5、9為拼接后的產(chǎn)物。由圖可知，我們成功的擴(kuò)增出預(yù)期長短的人VDAC2基因的啟動(dòng)子片段

二、熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒psi_CHECK-2-VVDDAACC22的構(gòu)建及鑒定

我們運(yùn)用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和NHEiⅠ雙酶切擴(kuò)增產(chǎn)物以及psi_CHECK-2-VDAC2載體質(zhì)粒。切下大小約為3000bp，將重組質(zhì)粒送上海英俊生物公司測序鑒定（見圖2），結(jié)果表明重組質(zhì)粒中插入序列為3000bp，并準(zhǔn)確插入質(zhì)粒psi_CHECK-2載體質(zhì)粒多克隆位點(diǎn)KpnI/ NheI之間，證實(shí)成功構(gòu)建了啟動(dòng)子報(bào)告基因載體。

三、小鼠GC--22ssppdd細(xì)胞中人VVDDAACC22基因啟動(dòng)子活性測定結(jié)果

將構(gòu)建好的重組熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒psi_CHECK-2-VDAC2和陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染進(jìn)小鼠GC-2spd精原細(xì)胞中，24h后檢測熒光比值活性。小鼠GC-2spd細(xì)胞中長度為3000bp啟動(dòng)子活性檢測結(jié)果表明，報(bào)告質(zhì)粒的活性高于陰性質(zhì)粒psi_CHECK-2-NC，P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見圖3）。

圖22　人VVDDAACC22重組質(zhì)粒的部分測序圖測序結(jié)果證實(shí)我們成功構(gòu)建了啟動(dòng)子報(bào)告基因載體

討　論

VDAC基因家族的發(fā)現(xiàn)和其在生殖系統(tǒng)中發(fā)揮的作用已經(jīng)不是什么新鮮事了［15， 19， 20］。最近，VDAC2蛋白作為哺乳動(dòng)物精子發(fā)生過程中不可或缺的調(diào)控因素，已經(jīng)受到越來越多的重視。精子活力和存活率可能會(huì)直接受到VDAC蛋白的調(diào)控［15， 16， 21］。不考慮對(duì)Ca2+影響，利用DIDS阻斷VDAC蛋白能夠顯著的減少精子的運(yùn)動(dòng)能力；而對(duì)照組中精子的活力不受影響［16］。因此，VDAC家族蛋白，尤其VDAC2，可能對(duì)精子來說是一種很重要的結(jié)構(gòu)功能復(fù)合體蛋白。在我們前期研究工作中，我們發(fā)現(xiàn)VDAC2基因mRNA在特發(fā)性弱精子癥患者中表達(dá)明顯高于正常男性精子中的表達(dá)量，但是VDAC2影響人類精子活力的具體機(jī)制仍然不十分清楚［16-18， 21］。

為了進(jìn)一步了解VDAC2基因和精子活力之間的關(guān)系，我們利用雙熒光素酶報(bào)告基因，首次成功地構(gòu)建并在小鼠精原細(xì)胞GC-2spd中驗(yàn)證人VDAC2基因啟動(dòng)子活性。我們調(diào)取NCBI基因文庫，設(shè)計(jì)啟動(dòng)區(qū)引物，并提取人類精子基因組DNA，通過PCR技術(shù)擴(kuò)增出人類VDAC2啟動(dòng)子區(qū)。將含有VDAC2基因啟動(dòng)子的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到小鼠GC-2細(xì)胞中24h后，利用雙熒光素酶檢測試劑盒檢測熒光強(qiáng)度，通過熒光強(qiáng)度來反映啟動(dòng)子是否有活性。我們的結(jié)果表明，VDAC2基因-2000～+500具有啟動(dòng)子活性，而核心啟動(dòng)子區(qū)域有待我們進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)篩查討論。

最近Hakan等在一次實(shí)驗(yàn)中意外發(fā)現(xiàn)有活性的芳烴受體（AhR， aryl hydrocarbon receptor）能夠上調(diào)VDAC2的表達(dá)，這是首次發(fā)現(xiàn)外界環(huán)境影響因子調(diào)控VDAC2蛋白表達(dá)。除此而外，后續(xù)的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了活化的AhR受體引起VDAC2蛋白表達(dá)上調(diào)的必要性，并且說明了VDAC2基因的上調(diào)是在轉(zhuǎn)錄水平而非翻譯水平［22， 23］。我們進(jìn)一步猜想所有與VDAC2基因表達(dá)上調(diào)的疾病是否都含有活化的或者說有功能的AhR？這將是研究環(huán)境病理因素與VDAC2蛋白表達(dá)增高相關(guān)疾病新的研究方向。

我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在-2000～+1000啟動(dòng)子區(qū)存在著調(diào)控VDAC2基因表達(dá)的重要元件，這將是我們進(jìn)行后續(xù)表觀研究的關(guān)鍵點(diǎn)［24］?；谖覀?010年的研究基礎(chǔ)，我們將繼續(xù)討論異常的DNA甲基化是否會(huì)引起VDAC2蛋白表達(dá)異常引起特發(fā)性弱精子癥。此外，隨著環(huán)境污染不斷嚴(yán)重，尤其是各類化學(xué)污染物，例如戴奧辛（2，3，7，8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin），通過調(diào)控VDAC2蛋白的表達(dá)來影響正常生理功能，并且這些是否是針對(duì)VDAC2基因啟動(dòng)子的改變？因此，我們?nèi)匀挥性S多工作要做來解答上述問題。

圖33　熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

用不同比例的報(bào)告基因載體psi_CHECK-2-VDAC2和psi_ CHECK-2-NC共轉(zhuǎn)染進(jìn)小鼠GC-2spd細(xì)胞中，24h后收獲細(xì)胞裂解后檢測上清中熒光素酶活性。與psi_CHECK-2-NC比較，*為P ＜0.05，表明長度為3000bp的啟動(dòng)子片段具有啟動(dòng)子活性

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（2015-09-17收稿）

doi：10.3969/j.issn.1008-0848.2016.03.002

中圖分類號(hào)R 321.1

*基金項(xiàng)目資助：國家自然科學(xué)基金（30872575，81200467）

Clones and the construction of luciferase report vector of human sperm VDAC2 promoter in GC-2spd cell lines

Xu Aiming， Zhang Jianzhong， Liu Changkun， Chen Wei， Zhao Kai，Hua Yibo， Wang Hainan， Xi Wei， Liu Bianjiang**， Wang Zengjun**
Department of Urology， the First Affi liated Hospital of Nanjing Medical University， Nanjing 210029， China Corresponding author： Liu Bianjiang， E-mail： bjliu@njmu.edu.cn； Wang Zengjun， E-mail： zengjunwang@njmu.edu.cn

AbstractObjectiveVoltage-dependent anion channel 2 （VDAC2） is an important member of VDAC family， and involves in many physiological activities and pathological changes in diseases. This study is mainly to identify and analyze the active of promoter of human VDAC2 gene for further investigation on its regulatory mechanism. MetthhooddssGenomic DNA from normal human ejaculated sperm was extracted. The promoter region was correctly amplifi ed using three pairs of primer. PDS_pisCHECK-2 carried the correct promoter sequence was transfected into GC-2spd cell line. 48h after cell transfection， a Dual-Luciferase? Reporter Assay Kit was used to detect the activity of VDAC2 gene promoter constructs. RessuullttssIt showed that the -2000～+1000bp located at upstream of VDAC2 had the highest activity. ConcluussiioonnThis study fi rst identify and analyze the activity of promoter region of VDAC2 in human sperm.

Key wordsVDAC2 gene；dual-luciferase reporter system；promoter regions （genetics）；spermatozoa

**共同通訊作者：劉邊疆，E-mail： bjliu@njmu.edu.cn； 王增軍，E-mail： zengjunwang@njmu.edu.cn