叢斌斌，孫 曉，宋現(xiàn)讓?zhuān)軙陨?，劉雁冰，趙 桐，

田崇麟1，2，于金明4，王永勝21.濟(jì)南大學(xué)山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250200；2.山東大學(xué)附屬山東省腫瘤醫(yī)院乳腺病中心，山東 濟(jì)南 250117；3.山東大學(xué)附屬山東省腫瘤醫(yī)院基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250117；4.山東大學(xué)附屬山東省腫瘤醫(yī)院放療科，山東 濟(jì)南 250117

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新型前哨淋巴結(jié)示蹤劑的制備及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究

叢斌斌1，2，孫 曉2，宋現(xiàn)讓3，曹曉珊1，2，劉雁冰2，趙 桐2，

田崇麟1，2，于金明4，王永勝2
1.濟(jì)南大學(xué)山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250200；2.山東大學(xué)附屬山東省腫瘤醫(yī)院乳腺病中心，山東 濟(jì)南 250117；3.山東大學(xué)附屬山東省腫瘤醫(yī)院基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250117；4.山東大學(xué)附屬山東省腫瘤醫(yī)院放療科，山東 濟(jì)南 250117

［摘要］背景與目的：前哨淋巴結(jié)活檢是臨床腋窩淋巴結(jié)陰性早期乳腺癌患者治療的標(biāo)準(zhǔn)。準(zhǔn)確定位前哨淋巴結(jié)對(duì)分期、預(yù)后及治療至關(guān)重要。該研究將利妥昔單抗與熒光示蹤劑吲哚菁綠偶聯(lián)，制備新型前哨淋巴結(jié)示蹤劑，確定最佳偶聯(lián)比例，并對(duì)其生物學(xué)特性、安全限度及定位性能進(jìn)行研究。方法：直接偶聯(lián)法制備新型前哨淋巴結(jié)吲哚菁綠-利妥昔單抗，雙層析快速薄層層析-硅膠層析紙法測(cè)定標(biāo)記率，非還原型SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法和雙抗體夾心間接酶聯(lián)免疫測(cè)定法檢測(cè)新型示蹤劑中單抗分子完整性和免疫活性，按中華藥典要求檢測(cè)新型示蹤劑的安全限度及在小鼠體內(nèi)前哨淋巴結(jié)的定位性能。結(jié)果：新型示蹤劑中利妥昔單抗分子完整且保持了單抗的免疫活性，利妥昔單抗大分子上吲哚菁綠的標(biāo)記率為100%，新型示蹤劑為無(wú)菌、無(wú)致熱原的溶液且局部注射不會(huì)產(chǎn)生危害。利妥昔單抗與吲哚菁綠質(zhì)量比例為4∶1、6∶1偶聯(lián)形成的新型示蹤劑，前哨淋巴結(jié)顯像效果最佳。前哨淋巴結(jié)定位與核素法一致。結(jié)論：吲哚菁綠-利妥昔單抗偶聯(lián)的新型前哨淋巴結(jié)示蹤劑的制備工藝簡(jiǎn)單且無(wú)放射性危害，其中單抗的分子完整性和免疫活性無(wú)破壞，為無(wú)菌、無(wú)致熱原、無(wú)急性毒性的示蹤劑，能夠用于前哨淋巴結(jié)顯像。

［關(guān)鍵詞］前哨淋巴結(jié)；顯像劑；利妥昔單抗；吲哚菁綠；淋巴顯像

Correspondence to: WANG Yongsheng E-mail: wangysh2008@aliyun.com

前哨淋巴結(jié)(sentinel lymph node，SLN)是乳腺癌轉(zhuǎn)移的第一站淋巴結(jié)，其病理情況對(duì)乳腺癌外科手術(shù)方式及術(shù)后綜合治療有重要的指導(dǎo)價(jià)值。前哨淋巴結(jié)活檢(sentinel lymph node biopsy，SLNB)是乳腺癌淋巴結(jié)分期的技術(shù)手段，準(zhǔn)確定位SLN是乳腺癌SLNB研究一直關(guān)注的技術(shù)領(lǐng)域。SLN定位的示蹤劑包括染料、核素、熒光等，這些均為非特異性示蹤劑，利用淋巴結(jié)內(nèi)巨噬細(xì)胞吞噬作用將示蹤劑滯留在SLN內(nèi)。此類(lèi)顆粒型示蹤劑顆粒直徑為50～200 nm，大小不均，每次注入顆?？倲?shù)不易控制，容易出現(xiàn)術(shù)中檢出次級(jí)淋巴結(jié)的情況。本研究將淋巴結(jié)特異性結(jié)合的利妥昔單抗(rituximab)與熒光示蹤劑吲哚菁綠(indocyanine green，ICG)偶聯(lián)，制備新型SLN示蹤劑ICG-利妥昔單抗，并對(duì)其體外特性、安全限度及定位性能進(jìn)行研究。

1　材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

BALB/c小鼠40只，18～20 g，雌性，無(wú)菌級(jí)，購(gòu)自北京華阜康生物技術(shù)股份有限公司。

1.2主要實(shí)驗(yàn)試劑

利妥昔單抗，100 mg，購(gòu)自瑞士巴塞爾豪夫邁羅氏有限公司；ICG(注射用吲哚菁綠)，25 mg，購(gòu)自丹東醫(yī)創(chuàng)藥業(yè)有限責(zé)任公司；滅菌注射用水，5 mL，購(gòu)自天津藥業(yè)集團(tuán)新鄭股份有限公司；半透膜直徑22 mm，截留分子量4×103~6×103，購(gòu)自美國(guó)光譜醫(yī)學(xué)公司；熒光成像儀(MDM-I型熒光脈管系統(tǒng))，購(gòu)自廊坊明德生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；γ探測(cè)儀(Neoprobe 2000)購(gòu)自美國(guó)強(qiáng)生公司；磷屏顯像儀(Cyclone磷屏成像系統(tǒng))購(gòu)自美國(guó)Packard公司；雙層硅膠層析紙(ITLC-SG)購(gòu)自德國(guó)Gelman公司；ELISA試劑盒(兔ELISA試劑盒)購(gòu)自上海拜力生物科技有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；PowerPac Basic電泳裝置購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；其他試劑為國(guó)產(chǎn)AR級(jí)。

1.3新型示蹤劑的制備

室溫下，按照無(wú)菌操作原則將100 mg利妥昔單抗用10 mL滅菌注射用水配制成10 mg/mL的溶液，置于50 mL無(wú)菌離心管內(nèi)冷藏(2~8℃)保存?zhèn)溆?；?5 mg ICG用10 mL滅菌注射用水配制成濃度為2.5 mg/mL的溶液，置于50 mL無(wú)菌離心管內(nèi)避光保存?zhèn)溆?。室溫下，分別取6份體積為0.5 mL的已配制完成的10 mg/mL利妥昔單抗溶液置于10 mL離心管中，取利妥昔單抗與ICG質(zhì)量比為3∶1、4∶1、6∶1、12∶1、30∶1 及32∶1的相應(yīng)體積的2.5 mg/mL ICG溶液，將ICG溶液緩慢滴入利妥昔單抗溶液中。觀(guān)察離心管內(nèi)偶聯(lián)反應(yīng)后有無(wú)沉淀生成，若有沉淀產(chǎn)生，則將裝有偶聯(lián)反應(yīng)物的離心管進(jìn)行離心沉淀(2012×g，20 min)去除離心管底部的沉淀后，取上清液置于半透膜制成的透析袋中；若無(wú)沉淀產(chǎn)生則將混合液直接置于透析袋中，室溫避光條件下以偶聯(lián)反應(yīng)物混合液與滅菌注射用水體積比為1∶200的比例進(jìn)行透析，先用流水透析5 min，之后置于滅菌注射用水的容器中繼續(xù)透析，每2 h更換滅菌注射用水透析液，取每次透析結(jié)束更換的透析液進(jìn)行熒光成像儀檢測(cè)，確定偶聯(lián)物中有無(wú)游離的小分子ICG，通過(guò)此方法將透析袋中的小分子ICG完全洗脫出去，然后收集ICG-利妥昔單抗偶聯(lián)物。

1.4新型示蹤劑的體外特性

1.4.1標(biāo)記率測(cè)定

采用雙層析快速薄層層析-硅膠層析紙(ITLC-SG)法測(cè)定標(biāo)記率。體系1為V吡啶∶V乙醇∶V水=5∶2∶1，體系2為丙酮。用體系1時(shí)ICG在原點(diǎn)，新型示蹤劑在前沿；用體系2時(shí)利妥昔單抗和新型示蹤劑在原點(diǎn)，ICG在前沿。

1.4.2分子完整性測(cè)定

8%非還原型SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法檢測(cè)新型示蹤劑中單抗分子的完整性，利妥昔單抗為陽(yáng)性對(duì)照，確定新型示蹤劑中單抗分子的完整性。

1.4.3免疫活性檢測(cè)

采用雙抗體夾心間接酶聯(lián)免疫吸附(enzymelinked immunosorbent assay，ELISA)法檢測(cè)新型示蹤劑中單抗分子的免疫活性。兔抗鼠IgG-Fab抗體為包被抗體，采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的牛血清白蛋白封閉1 h，加入利妥昔單抗與ICG質(zhì)量比為4∶1、6∶1、12∶1、30∶1及32∶1的新型示蹤劑，在室溫條件下避光反應(yīng)2 h，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgG-Fc段抗體，在室溫條件下避光反應(yīng)1 h，鹽酸鄰苯二胺顯色，酶聯(lián)儀測(cè)定D412 nm值。

1.5安全限度檢測(cè)

1.5.1細(xì)菌檢測(cè)

分別將0.5 mL利妥昔單抗與ICG質(zhì)量比為4∶1、6∶1、12∶1、30∶1及32∶1的新型示蹤劑移入含有10%胎牛血清培養(yǎng)液的RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行細(xì)菌檢測(cè)，在37℃下培養(yǎng)1周，觀(guān)察有無(wú)細(xì)菌產(chǎn)生。

1.5.2致熱原檢測(cè)

以大腸桿菌內(nèi)毒素(1 U/mL)為陽(yáng)性對(duì)照，無(wú)菌、無(wú)致熱原注射用水為陰性對(duì)照，應(yīng)用鱟試驗(yàn)檢測(cè)新型示蹤劑是否存在致熱原。用1 mL注射用水溶解鱟試劑，將待測(cè)樣品加入到已溶解的鱟試劑中，于37℃下溫育1 h。試劑若呈膠凍狀為有致熱原；若為澄清液體，則無(wú)致熱原。

1.5.3急性毒性實(shí)驗(yàn)

BALB/c小鼠20只，雌性，體質(zhì)量為(20±0.1)g，分為5組，每組4只。每組小鼠后肢腳墊皮下分別以1.2和12 mg/kg劑量注射5種不同質(zhì)量比的新型示蹤劑，相當(dāng)于人體用量的10和100倍。觀(guān)察1周內(nèi)小鼠的生存情況。

1.6SLN定位性能

分別將10 μL 5種不同質(zhì)量比的新型示蹤劑分別注射于50只(每組10只)小鼠的后肢足墊皮下，用熒光成像儀持續(xù)觀(guān)察24 h，詳細(xì)記錄出現(xiàn)SLN及次級(jí)淋巴結(jié)的時(shí)間。另外，將注射了新型示蹤劑且已經(jīng)利用熒光成像儀明確定位SLN位置的10只小鼠的后肢足墊皮下注射10 μL SLN標(biāo)準(zhǔn)示蹤劑99mTc-硫膠體（10 μCi，185 kBq)。注射后2 min用γ探測(cè)儀定位放射性活性SLN位置并用磷屏顯像儀進(jìn)行小鼠腹股溝SLN顯像，以明確新型示蹤劑定位的SLN位置是否與核素法定位的一致。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。兩組獨(dú)立樣本間的比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié) 果

2.1新型示蹤劑的體外特性

在制備過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，5種不同質(zhì)量比的利妥昔單抗與ICG新型示蹤劑在透析12 h之后均未見(jiàn)ICG浸入透析液，說(shuō)明ICG經(jīng)過(guò)偶聯(lián)反應(yīng)完全結(jié)合到利妥昔單抗上，而質(zhì)量比為3∶1混合偶聯(lián)時(shí)會(huì)出現(xiàn)沉淀，經(jīng)過(guò)分析確定為ICG成分濃度過(guò)高引起的沉淀，其他質(zhì)量比例的制備過(guò)程中均未見(jiàn)沉淀。鑒于沉淀會(huì)影響SLN顯像的情況，因此3∶1質(zhì)量比的新型示蹤劑未進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。

ITLC-SG法檢測(cè)顯示，在5種不同質(zhì)量比的利妥昔單抗與ICG的新型示蹤劑中，利妥昔單抗大分子上ICG的標(biāo)記率為100%。

5種不同質(zhì)量比的利妥昔單抗與ICG的新型示蹤劑，8%非還原型SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法檢測(cè)顯示未見(jiàn)明顯降解條帶，說(shuō)明新型示蹤劑中單抗分子完整(圖1)。

圖 1　8%非還原型SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法確定新型示蹤劑單抗分子完整性Fig. 1 The new tracer was analyzed for molecular integrity by 8% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis

ELISA法顯示，不同比的ICG-利妥昔單抗和利妥昔單抗顯色反應(yīng)均呈陽(yáng)性，酶聯(lián)儀測(cè)定D412 nm值未見(jiàn)明顯差異，說(shuō)明新型示蹤劑中單抗分子保持了利妥昔單抗的免疫活性。

2.2安全限度檢測(cè)

經(jīng)過(guò)細(xì)菌檢測(cè)和致熱原檢測(cè)顯示，新型示蹤劑為無(wú)菌、無(wú)致熱原的溶液。分別注射了相當(dāng)于人體用量10倍和100倍新型示蹤劑的20只小鼠，48 h內(nèi)注射局部及全身均未見(jiàn)明顯異常，常規(guī)飼養(yǎng)1周均未見(jiàn)死亡，說(shuō)明5種不同質(zhì)量比的利妥昔單抗與ICG新型示蹤劑的LD50大于12 mg/kg，局部注射不會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生危害。

圖 2　新型示蹤劑前哨淋巴結(jié)定位性能的小鼠實(shí)驗(yàn)Fig. 2 Mouse experiment for SLN detection of new tracer

2.3SLN定位性能

5種不同質(zhì)量比的ICG-利妥昔單抗新型示蹤劑的SLN顯像情況見(jiàn)表1。用熒光成像儀探測(cè)注射4∶1、6∶1的新型示蹤劑的小鼠，SLN均顯像清晰，而12∶1、30∶1及32∶1新型示蹤劑的小鼠均有無(wú)SLN顯像的情況出現(xiàn)，因此利妥昔單抗與ICG質(zhì)量比為4∶1、6∶1的新型示蹤劑是進(jìn)行SLNB顯像的最佳示蹤劑。注射了這兩種質(zhì)量比例示蹤劑的小鼠首次出現(xiàn)腹股溝SLN的時(shí)間分別為(13.62±1.79)min和(10.07±1.40)min(表1)，而且48 h后仍只有SLN顯像而未見(jiàn)次級(jí)淋巴結(jié)顯像。明確定位SLN位置的10只小鼠的后肢足墊皮下注射10 μL99mTc-硫膠體，探測(cè)儀定位的SLN位置與新型示蹤劑定位的SLN位置一致，熒光成像儀中的圖像與磷屏顯像儀中的SLN的位置也一致（圖2）。

表 1　ICG-利妥昔單抗新型示蹤劑首次出現(xiàn)SLN的時(shí)間 （min）Tab. 1 The first appearance time of SLN in new tracer ICG-rituximab

3　討 論

SLNB作為一項(xiàng)腋窩準(zhǔn)確分期的微創(chuàng)活檢技術(shù)，代表著乳腺癌外科治療的發(fā)展水平［1］。目前，SLN定位的示蹤劑包括染料、核素、熒光等，這些均為非特異性示蹤劑［2］。其中染料法(美蘭、專(zhuān)利藍(lán)和納米碳)定位SLN主要是通過(guò)術(shù)前在乳腺原發(fā)腫瘤周?chē)?或)皮下注射染料，然后于腋窩區(qū)域循著被染料染色的淋巴管精細(xì)解剖找到第一枚被染色的淋巴結(jié)，從而確定SLN的具體位置，然而這種方法需要精湛的外科解剖技巧，并且經(jīng)過(guò)學(xué)習(xí)曲線(xiàn)后仍存在較高的SLNB假陰性率，這導(dǎo)致SLNB的準(zhǔn)確性難以把握［3-5］；而核素法(99mTc-硫膠體)定位SLN是通過(guò)術(shù)前于乳腺原發(fā)腫瘤周?chē)袤w和(或)皮下注射放射性核素，術(shù)中利用γ探測(cè)儀探測(cè)放射性計(jì)數(shù)，依據(jù)放射性計(jì)數(shù)找到計(jì)數(shù)較高的淋巴結(jié)，從而確定SLN(大于最高放射性計(jì)數(shù)10%的淋巴結(jié))的具體位置，雖然該方法SLNB的準(zhǔn)確率高、特異性好，但是目前部分國(guó)內(nèi)醫(yī)院無(wú)核醫(yī)學(xué)科受到儀器設(shè)備條件的限制，以及在實(shí)際操作時(shí)存在放射性核素污染及醫(yī)務(wù)人員放射性恐懼的問(wèn)題，而且99mTc-硫膠體中的硫膠體并未通過(guò)中國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局的批準(zhǔn)，這些都限制了其在我國(guó)臨床實(shí)際工作中的應(yīng)用［6］；熒光法定位SLN的方法與染料法相似，通過(guò)術(shù)前在乳腺原發(fā)腫瘤周?chē)?或)皮下注射熒光示蹤劑，術(shù)中利用熒光成像儀循熒光顯像發(fā)亮的淋巴管找到第一枚熒光顯像的淋巴結(jié)，從而定位SLN的位置，然而由于淋巴管內(nèi)滯留的熒光示蹤劑較少，其被激發(fā)所釋放出的熒光較弱，導(dǎo)致淋巴管熒光顯像不明顯，所以活檢過(guò)程中很難發(fā)現(xiàn)位置較深的淋巴管，從而導(dǎo)致很難循熒光顯像的淋巴管找到第一枚熒光顯像的淋巴結(jié)，造成SLN的漏檢，而位置較淺的淋巴管雖然可以清晰地發(fā)現(xiàn)熒光顯像但在離斷后其內(nèi)的熒光示蹤劑隨淋巴液一起漏出，極易造成淋巴管周?chē)M織熒光示蹤劑顯像污染，導(dǎo)致難以辨識(shí)淋巴管的位置，最終造成SLN漏檢［7］，這也不是理想的SLN示蹤劑。

ICG是目前乳腺癌SLNB的示蹤劑之一，是一種具有含硫活性基團(tuán)的小分子化合物，可以被熒光脈管系統(tǒng)成像儀前的近紅外光源(760 nm)激發(fā)產(chǎn)生熒光(820~830 nm)，所產(chǎn)生的熒光可以穿透人體脂肪組織。因?yàn)榱馨徒Y(jié)中滯留的ICG比淋巴管中的多，所以淋巴結(jié)熒光顯像明顯，利用成像儀可清晰直觀(guān)地觀(guān)察到淋巴結(jié)的顯像位置。但是由于ICG分子量小并易于彌散造成了在SLNB方面的顯像率高、敏感性高和準(zhǔn)確性低，且極易導(dǎo)致SLN以外的次級(jí)淋巴結(jié)顯像［7-8］。而利妥昔單抗是針對(duì)淋巴結(jié)中B淋巴細(xì)胞膜上CD20分子的特異性人源化單克隆抗體，能夠與淋巴結(jié)內(nèi)CD20+的分子特異性結(jié)合，并且結(jié)合后不易解離［9］，另外其具備有與其他小分子結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，能夠與小分子物質(zhì)進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)［10］。我們將大分子的利妥昔單抗與小分子的ICG進(jìn)行偶聯(lián)，其原理為小分子ICG中的含硫活性基團(tuán)在室溫中性環(huán)境條件下與大分子利妥昔單抗中的自由氨基(主要為賴(lài)氨酸的ε-氨基)相結(jié)合，每個(gè)大分子的利妥昔單抗能偶聯(lián)15~20個(gè)小分子ICG，新形成的偶聯(lián)物綜合了以上兩種試劑的特點(diǎn)，既能夠在近紅外線(xiàn)的激發(fā)下使SLN熒光顯像又能特異的定位SLN。本研究中的新型示蹤劑為一種顆粒大小穩(wěn)定的偶合物，通過(guò)投射電鏡確認(rèn)其粒徑為200~300 nm，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示大劑量（100 μL）新型示蹤劑注射能夠出現(xiàn)小鼠腹腔和盆腔內(nèi)次級(jí)淋巴結(jié)顯像，而通過(guò)劑量梯度實(shí)驗(yàn)之后，適當(dāng)劑量（10 μL）新型示蹤劑小鼠足墊下注射僅能夠使SLN顯像，其原理為新型示蹤劑進(jìn)入SLN后與淋巴結(jié)中B淋巴細(xì)胞膜上CD20分子特異性結(jié)合，當(dāng)劑量過(guò)大時(shí)示蹤劑與CD20分子結(jié)合達(dá)到飽和，過(guò)量的示蹤劑將向下一級(jí)淋巴結(jié)進(jìn)行引流，而劑量適中時(shí)示蹤劑與CD20分子結(jié)合未達(dá)到飽和，僅在SLN中滯留而不會(huì)向次級(jí)淋巴結(jié)引流。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該新型示蹤劑進(jìn)行SLNB時(shí)，通過(guò)濃度梯度實(shí)驗(yàn)獲得SLN顯像的示蹤劑最佳濃度(10 μL），使得示蹤劑只能滯留在SLN中而不向次級(jí)淋巴結(jié)引流。因此在人體進(jìn)行應(yīng)用時(shí)需通過(guò)濃度梯度試驗(yàn)獲得SLN顯像最佳濃度，通過(guò)該濃度的新型示蹤劑指導(dǎo)進(jìn)行SLNB時(shí)，不必再循熒光顯像的淋巴管找尋SLN，只需術(shù)中用紅外線(xiàn)熒光顯像系統(tǒng)探測(cè)熒光顯像的SLN的位置，將SLN周?chē)M織解剖游離后，直接解剖檢出熒光顯像定位的SLN，從而避免了SLN的漏檢和周?chē)M織熒光顯像污染的情況。

本研究結(jié)果表明，所制備的新型示蹤劑ICG-利妥昔單抗中，利妥昔單抗大分子上ICG的標(biāo)記率為100%，保持了抗體分子的完整性并保留了免疫活性，為無(wú)菌、無(wú)致熱原和無(wú)急性毒性的溶液。本研究在核素示蹤劑的前期小鼠實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，10 μL99mTc-硫膠體注射于小鼠后肢足墊后，2 min時(shí)只存在SLN顯像(盆腔腹腔解剖后)，30 min后才有可能出現(xiàn)次級(jí)淋巴結(jié)顯像，因此選擇2 min時(shí)進(jìn)行磷屏顯像，以確定新型熒光示蹤劑的SLN定位效果與核素示蹤劑的效果一致。利妥昔單抗與ICG質(zhì)量比例為4∶1、6∶1偶聯(lián)形成的新型示蹤劑，適當(dāng)劑量（10 μL）進(jìn)行小鼠后肢足墊注射后，SLN顯像效果最佳，且與核素法定位的SLN相一致，說(shuō)明新型示蹤劑與核素示蹤劑一樣能夠準(zhǔn)確定位SLN，用于SLN定位顯像。

總之，ICG-利妥昔單抗偶聯(lián)的新型SLN示蹤劑的制備工藝簡(jiǎn)單、標(biāo)記率高且無(wú)放射性危害，其中單抗的分子完整性和免疫活性無(wú)破壞，為無(wú)菌、無(wú)致熱原、無(wú)急性毒性的示蹤劑，能夠用于SLN顯像，具有較好的臨床應(yīng)用前景。本研究結(jié)果為臨床應(yīng)用提供了依據(jù)。

［參 考 文 獻(xiàn)］

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The preparation and experimental study of a new sentinel lymph node tracer

CONG Binbin1,2, SUN Xiao2, SONG Xianrang3, CAO Xiaoshan1,2, LIU Yanbing2, ZHAO Tong1, TIAN Chonglin1,2, YU Jinming4, WANG Yongsheng2(1.School of Medicine and Life Sciences, University of Jinan and Shandong Academy of Medical Sciences, Jinan 250200, Shandong Province, China; 2.Breast Cancer Center, Shandong Cancer Hospital Affiliated to Shandong University， Jinan 250117， Shandong Province， China； 3.Basic Laboratory，Shandong Cancer Hospital Affiliated to Shandong University， Jinan 250117， Shandong Province， China；4.Radiotherapy Department， Shandong Cancer Hospital Affiliated to Shandong University， Jinan 250117，Shandong Province, China)

［Key words］Sentinel lymph node; Imaging agent; Rituximab; Indocyanine green; Lymphoscintigraphy

［Abstract］Background and purpose: Sentinel lymph node biopsy is regarded as the standard of care in patients without clinical axillary lymph node metastases in early-stage breast cancer. Accurate detection of sentinel lymph node is an important step for staging, prognosis, and treatment. In this study, a new sentinel lymph node tracer was produced by the rituximab to combine with the fluorescence tracer （indocyanine green， ICG）， and to identify the most appropriate combination ratio of the two agents. Its biological property and safety limitation were evaluated. Methods: Rituximab was combined directly with ICG. The new tracer was analyzed for labeled rate by instant thin-layer chroma-tography-silica gel, molecular integrity by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis and molecular immune activity by ELLAS. The safety limitation was tested according to the Chinese Pharmacopeia. The localization ability of sentinel lymph node was tested in mice. Results: The new tracer was intact and kept the immune activity of rituximab. The ICG labeled rate of rituximab was 100%. The new tracer was bacteria and pyogen free, and was safe to body with location injection. The most appropriate combination ratio of rituximab and ICG was 4∶1 and 6∶1 with the best sentinel lymph node imaging. The location of sentinel lymph node identified by the new tracer was accorded with the radiotracer. Conclusion: The preparation method of the new sentinel lymph node tracer is simple and no radioactive injury. The new tracer has no bacteria, no pyogen and no acute toxicity, and can be used in sentinel lymph node visualization.

DOI:10.3969/j.issn.1007-3969.2016.03.007

中圖分類(lèi)號(hào)：R73-35

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1007-3639(2016)03-0245-06

基金項(xiàng)目：山東省自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（ZR2014HZ003）。

通信作者：王永勝 E-mail:wangysh2008@aliyun.com

收稿日期：（2015-07-03 修回日期：2015-10-26）