劉 鋒，謝黎明，張志偉，唐海林，鄔力祥

1.中南大學公共衛(wèi)生學院，湖南 長沙，430100；2.南華大學腫瘤研究所，湖南 衡陽，421001

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miR-124在胃癌中的表達及臨床意義

劉 鋒1， 2，謝黎明2，張志偉2，唐海林2，鄔力祥1

1.中南大學公共衛(wèi)生學院，湖南 長沙，430100；2.南華大學腫瘤研究所，湖南 衡陽，421001

［摘要］背景與目的：miR-124在多種腫瘤中發(fā)揮抑癌基因樣功能，如肺癌、前列腺癌、膀胱癌和乳腺癌，但是其在胃癌中的表達及臨床意義尚不清楚。該研究旨在研究miR-124在正常胃黏膜上皮細胞與不同胃癌細胞及胃癌組織及正常胃黏膜組織中的表達，分析其表達與胃癌患者性別、年齡、組織學分級、T分期、TNM分期、淋巴結轉移及預后之間的相關性。方法：采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(real-time fluorescent quantitative polymerase chain-reaction，RTFQ-PCR)檢測miR-124在人胃黏膜上皮細胞及胃癌細胞中的表達，采用原位雜交法檢測miR-124在胃癌及癌旁正常組織中的表達。結果：RTFQ-PCR結果顯示，miR-124在胃癌MKN-74、MKN-28、MKN-45、MGC-803、SGC-7901及AGS細胞中的表達均低于GES-1細胞；原位雜交實驗結果顯示，miR-124在正常胃黏膜中呈強陽性表達，在胃腺癌組織中表達下降、局灶陽性或缺失；統(tǒng)計分析顯示，miR-124與胃腺癌患者組織學分級、TNM分期及淋巴結轉移密切相關，與患者的年齡、性別及腫瘤大小無關；Kaplan-Meier生存曲線統(tǒng)計分析顯示，miR-124低表達患者的總生存時間和無病生存時間顯明低于miR-124高表達患者；多因素分析結果提示，miR-124表達下調是影響患者生存的獨立預后因素。結論：miR-124在胃癌細胞及組織中表達下調，并且與患者的組織學分級、TNM分期、淋巴結轉移及預后密切相關。

［關鍵詞］胃癌；miR-124；臨床意義；原位雜交

Expression of miR-124 in gastric cancer and its clinical significance

現(xiàn)有大量研究證實，表觀遺傳學調控參與了腫瘤發(fā)生、發(fā)展的多個過程。非編碼RNA是近年來的研究熱點，miRNA是一類內源性的具有調控功能的非編碼RNA，其大小為17~25個核苷酸，在mRNAs的3’UTR區(qū)，miRNA與互補的序列結合導致抑制翻譯過程或者直接降解mRNA，從而在轉錄后調控基因的表達。miRNA參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展多個過程：細胞增殖、凋亡、周期阻滯、侵襲轉移、血管形成、上皮間質樣變及干細胞特性維持等［1-2］。miR-124在多種腫瘤中發(fā)揮抑瘤基因的功能，如膀胱癌、肺癌、乳腺癌和前列腺癌［3-6］。但是其在胃癌中的表達及功能尚不清楚。本次研究擬通過采用原位雜交技術和實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）檢測miR-124在不同胃癌細胞及胃癌組織中的表達，明確miR-124在胃癌中的表達情況，并統(tǒng)計分析miR-124與胃癌患者性別、年齡、分化程度、組織學分級、腫瘤大小、TNM分期、淋巴結轉移及預后之間的相關性。

1　材料和方法

1.1細胞系和組織樣本

1.1.1細胞系

人胃上皮細胞GES-1、人胃腺癌MKN-74、MKN-28、MKN-45、MGC-803、SGC-7901及AGS細胞購自美國模式培養(yǎng)物研究所(American Type Culture Collection，ATCC)，均用含10%胎牛血清、1%青霉素鏈霉素的DMEM培養(yǎng)，置于37℃、CO2體積分數(shù)為5%的恒溫培養(yǎng)箱中。

1.1.2臨床資料

收集2008年3月—2010年9月在南華大學附屬第一醫(yī)院就診的126例原發(fā)性胃腺癌患者的腫瘤組織及癌旁正常組織。其中，大于等于60歲的患者53例，小于60歲的患者73例；男性患者70例，女性患者56例；高、中分化患者32例，低分化或未分化患者94例；腫瘤分期1~2期的患者71例，3~4期患者55例；TNM分期I~Ⅱ期患者51例，Ⅲ~Ⅳ期患者75例；有淋巴結轉移者88例，無淋巴結轉移者38例。上述組織標本的使用經(jīng)南華大學倫理委員會同意。

1.2主要材料

miR-124原位雜交探針序列購自美國Exiqon公司，逆轉錄試劑盒 (#A3500)購自美國Promega公司，miRNAs PCR定量試劑盒購自美國復能基因公司，TRIzolTMReagent購自美國Invitrogen公司，SABC-POD、生物素化抗地高辛、胃蛋白酶、封閉液和預雜交液均購自武漢博士德生物工程有限公司，DEPC水購自廣州美津生物技術有限公司。

1.3RTFQ-PCR檢測

20 μL體系逆轉錄：U6反轉錄引物或miR-124反轉錄引物（1 mmol/L）1.2 μL，5×反轉錄緩沖液為4 μ L，總R N A為1 μg，dNTP （10 mmol/L）0.75 μL，RNasin （40μmol/μL）0.25 μL，DTT（1 mmol/L）2 μL，M-MLV反轉錄酶（200 μmol/μL）0.5 μL，無酶水補足至20 μL。將PCR管置于PCR儀內，反應條件為16℃ 30 min，42℃ 30 min，85℃ 10 min，4℃ 10 min，立即進行PCR擴增或-20℃保存；20 μL體系PCR擴增：miR-124或U6反轉錄化合物2.0 μL，2×SYBR Mix 10 μL，miR-124或U6特異性引物（5 μmol/L）0.4 μL，Taq DNA聚合酶5 μmol/μL）0.2 μL，無酶水7.4 μL。將PCR管放入PCR儀內進行擴增，反應條件為：95.0℃，3 min變性；95.0℃，12 s；62.0℃，35 s，共40個循環(huán)；熔解曲線檢測從62.0℃開始至95.0℃停止；計算各組CT值，用ΔCT評價miRNA的表達。

1.4原位雜交

將收集的組織標本進行取材、常規(guī)脫水、浸蠟、包埋、切片，切片厚度4 μm；石蠟切片放入65℃恒溫烤箱中烤片至石蠟成水樣，然后常規(guī)脫蠟至水，取出切片，擦干；在組織上滴適量3% H2O2滅活內源性酶；在切片上滴加3%胃蛋白酶37℃消化15 min，以暴露mRNA核酸片段；1%多聚甲醛/0.1 mol/L PBS(pH為7.2~7.6)，室溫下固定組織10 min，擦干切片；加預雜交液20 μL，42℃恒溫溫育3 h，擦干切片；加10 μL雜交液(miRNA探針∶雜交液=1∶250)，載玻片上用蓋玻片覆蓋，在雜交儀中55℃雜交過夜；依次于37℃ 2×SSC液、0.5×SSC液、0.2×SSC液中洗滌15 min；滴加封閉液，37℃恒溫溫育30 min；滴加生物素化鼠抗地高辛，室溫下溫育2 h；PBST液漂洗4次，每次5 min；在切片上加DAB顯色液，顯微鏡下控制觀察，待陽性切片出現(xiàn)棕黃色立即將切片放入水中終止顯色，充分水洗；蘇木精復染，最后中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

1.5原位雜交結果分析

根據(jù)組織陽性染色程度計分：陰性為1分；+為2分；++為3分；+++為4分；根據(jù)組織中的陽性細胞數(shù)計分：0%~25%為1分；26%~50%為2分；51%~75%為3分；76%~100%為4分。兩種計分方法得到的分數(shù)相乘，小于8為低表達，大于等于8為高表達。

1.6統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件分析，計量資料兩組或兩組以上采用Student t-test或One-way ANOVA分析；正常胃組織及胃癌組織中miRNA的表達與臨床參數(shù)關系的比較采用χ2檢驗和Fisher’s exact test分析；Kaplan-Meier生存曲線采用Log-rank檢驗，分析miRNA與胃癌患者的臨床預后。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結 果

2.1miR-124在胃癌細胞中的表達水平檢測

運用RTFQ-PCR技術檢測了人胃上皮細胞GES-1、人胃腺癌MKN-74、MKN-28、MKN-45、MGC-803、SGC-7901及AGS細胞中miR-124的表達。本研究結果表明，miR-124 在MKN-74中的表達為人胃上皮細胞GES-1的（0.834±0.076）倍，在NKN-28中的表達為GES-1的（0.428±0.041）倍，在MKN-45中的表達為GES-1的（0.037±0.002）倍，在MGC-803細胞中的表達為GES-1細胞中的（0.379±0.031）倍，在SGC-7901細胞中的表達為GES-1中的（0.046±0.003）倍，在A G S細胞中的表達為G E S - 1中的（0.062±0.005）倍。每組細胞株中實驗重復3次，最后取出平均值。miR-124在人胃腺癌細胞中的表達均低于人胃上皮細胞GES-1，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；在人胃腺癌細胞中，miR-124表達最高的為MKN-74細胞，最低的為MKN-45細胞(圖1)。

圖 1　RTFQ-PCR檢測miR-124在人胃上皮細胞GES-1、人胃腺癌MKN-74、MKN-28、MKN-45、MGC-803、SGC-7901 及AGS細胞中的表達Fig. 1 The expressions of miR-124 in human gastric mucosal epithelium cells GES-1 and gastric cancer cells MKN-74， MKN-28， MKN-45， MGC-803， SGC-7901 and AGS tested by RTFQPCR

2.2miR-124在胃癌組織中的表達與臨床病理參數(shù)的關系

采用原位雜交技術檢測了126例胃腺癌組織及癌旁正常組織中miR-124的表達。結果表明，miR-124在正常胃黏膜中呈強陽性表達，在高分化胃腺癌組織中表達下降，在中分化及低分化胃腺癌組織中的表達顯著降低、局灶陽性或缺失(圖2)。

圖 2　原位雜交檢測miR-124在胃腺癌組織及正常胃黏膜中的表達Fig. 2 Expression of miR-124 in gastric cancer tissues and matched para-cancerous tissues detected by in situ hybridization

miR-124在73例小于60歲患者中有43例表達下降，在53例大于等于60歲患者中有31例表達下降，差異無統(tǒng)計學意義(P=1.000)，說明miR-124表達與胃腺癌患者年齡無關；miR-124 在70例男性患者中有45例表達下降，在56例女性患者中有29例表達下降，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.203)，說明miR-124表達與胃腺癌患者性別無關；miR-124在32例高中分化胃腺癌組織中有24例表達下降，在94例低分化或未分化胃腺癌組織中有50例表達降低，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.038)，說明miR-124表達與胃腺癌組織學分級有關；miR-124在腫瘤大小1~2級71例患者中有38例表達下降，在腫瘤大小3~4級55例患者中有36例表達下降，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.204)，說明miR-124的表達與腫瘤大小無關；miR-124在TNM分期I~Ⅱ期51例患者中有23例低表達，在TNM分期Ⅲ~Ⅳ期75例患者中有51例低表達，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.016)，說明miR-124表達與胃腺癌患者TNM分期相關；在88例有淋巴結轉移患者中，miR-124表達下降的59例，在38例無淋巴結轉移患者中，miR-124表達下降的15例，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.006)，說明miR-124表達與胃腺癌患者淋巴結轉移相關(表1)。此結果說明，miR-124的表達與胃腺癌患者組織學分級、TNM分期及淋巴結轉移密切相關。

表 1　胃癌患者中miR-124的表達與臨床病理參數(shù)的關系Tab. 1 Correlations of miR-124 expression with pathological parameters of gastric cancer

2.3miR-124表達與胃癌患者預后的關系

本研究將所收集的胃癌病例分成miR-124高表達與低表達兩組，統(tǒng)計分析了miR-124表達與胃癌患者預后的關系。結果表明(圖3)，miR-124低表達組患者的總生存時間為4~56個月，平均生存時間為(22.1±11.9)個月；miR-124高表達組患者總生存時間為6~58個月，平均生存時間為(28.0±11.6)個月。Kaplan-Meier生存曲線統(tǒng)計分析顯示，miR-124低表達組患者總生存率低于miR-124高表達組，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.002)。miR-124低表達組患者的無病生存時間為3~56個月，平均無病生存時間為(12.8±16.8)個月；miR-124高表達組患者無病生存時間為6~58個月，平均無病生存時間為(23.2±14.1)個月(圖4)。Kaplan-Meier生存曲線統(tǒng)計分析顯示，miR-124低表達組患者無病生存率(disease-free survival，DFS)低于miR-124高表達組，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.008)。說明miR-124表達越低，胃腺癌患者預后越差，miR-124的表達與胃腺癌患者預后呈正比。多因素分析結果提示，miR-124表達下調(RR=2.57；95%CI：1.39~4.68；P=0.001)是影響患者生存的獨立預后因素。

圖 3　miR-124表達與胃癌患者總生存率的關系Fig. 3 Survival curve of miR-124 expression and its overall survival in gastric cancer

圖 4　miR-124表達與胃癌患者無病生存率的關系Fig. 4 Survival curve of miR-124 expression and its disease-free survival in gastric cancer

3　討 論

胃癌是危害人類健康的主要問題之一，每年有將近1 000 000的新發(fā)病例，是導致人類死亡的主要因素之一［7］。有研究顯示，70%的胃癌發(fā)生在亞洲，與其他的實體瘤相比，胃癌的5年存活率在過去的10年間有了顯著增加，提高了15%~27%，但這僅限于早期胃癌患者，中晚期患者的5年生存率仍低于5%，中位總生存時間小于1年［8］。

最近，很多研究者都在尋找miRNA的潛在用途。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在癌癥表型差異化方面似乎優(yōu)于mRNA。一項最近的報告顯示，胃癌預后信號主要包括4個危險性miRNA(miR-10b、miR-21、miR-233和miR-338，危害比大于1)和3個保護性miRNA(miR-30a-5p、miR-126 和let-7a，危害比小于1)，并且都與臨床結局相關［9］。另一項研究表明，miR-21和miR-181b的低表達與用S-1和去氧氟尿苷治療后的胃癌患者的存活之間有一定的聯(lián)系［10］。miR-125a-3p的低表達和腫瘤的大小、侵襲能力、轉移以及臨床分期有關，并且可作為一個獨立的胃癌預后標志物［11］。miR-200b與miR-200c在胃癌細胞與組織中低表達，并且其表達狀態(tài)與胃癌患者的臨床分期、淋巴結轉移及預后相關［12］。

有研究顯示，在非小細胞肺癌中，miR-124通過抑制STAT3的表達抑制細胞增殖［4］。miR-124也可通過抑制ROCK1的表達抑制胃癌細胞的遷移能力［13］，其在乳腺癌中也可通過抑制Ets-1的表達抑制細胞增殖和遷移［5］。miR-124通過抑制amotL1的表達抑制宮頸癌細胞血管生成擬態(tài)及細胞運動能力［14］。與很多miRNA一樣，miR-124還參與腫瘤EMT的調控。在前列腺癌細胞中，miR-124通過靶向Slug抑制TGF-α誘導的EMT［6］。miR-124通過增加腫瘤細胞對化療藥物的敏感性抑制腫瘤。miR-124通過靶向磷酸二酯酶增加彌漫性大B細胞淋巴瘤對糖皮質激素的敏感性［15］。同時，miR-124可通過抑制R-Ras和N-Ras的表達抑制膠質瘤細胞生長、增殖，并增加其化療敏感性［16］。上述研究表明，miR-124具有抑制腫瘤增殖、遷移、調控EMT轉化及增加化療敏感性的作用。

研究表明，多個miRNA在胃癌細胞及組織中表達發(fā)生改變。miR-124作為抑瘤因子在多種腫瘤中發(fā)揮抑瘤作用。本研究首先檢測了miR-124在人胃上皮細胞GES-1、人胃腺癌MKN-74、MKN-28、MKN-45、MGC-803、SGC-7901 及AGS細胞中的表達。結果表明，miR-124在人胃腺癌細胞中的表達均低于人胃上皮細胞GES-1，差異有統(tǒng)計學意義。隨后，本研究進一步檢測了miR-124在126例胃癌組織及癌旁正常組織中的表達，以確定miR-124在胃癌組織中的表達是否與胃癌細胞中一致。結果表明，miR-124在正常胃黏膜中呈強陽性表達，在高分化胃腺癌組織中表達下降，在中分化及低分化胃腺癌組織中的表達顯著降低、局灶陽性或缺失。相關性分析顯示，miR-124在胃癌組織中的表達與患者的組織學分級、TNM分期以及淋巴結轉移相關。本研究還統(tǒng)計分析了miR-124表達與胃癌患者預后的關系。Kaplan-Meier生存曲線統(tǒng)計分析顯示，miR-124低表達組患者無病生存率低于miR-124高表達組，差異有統(tǒng)計學意義。多因素分析結果提示，miR-124表達下調是影響患者生存的獨立預后因素。

綜上所述，miR-124在胃腺癌組織與細胞中均表達降低，這與miR-124在其他腫瘤中的表達一致。miR-124在胃癌組織中的表達狀態(tài)與胃癌患者的組織學分級、TNM分期、淋巴結轉移及預后明顯相關，并且miR-124表達下調是影響患者生存的獨立預后因素。這些結果均提示了miR-124可能參與胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程，為miR-124成為胃癌臨床預后生物學標志物以及可能的治療靶點提供了實驗證據(jù)。

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LIU Feng, XIE Liming, ZHANG Zhiwei, TANG Hailin, WU Lixiang (1.School of Public Health, Central South University, Changsha 430100, Huan Province, China; 2. Tumor Institute, Nanhua Univercity, Hengyang 421001, Huan Province, China)

Correspondence to: WU Lixiang E-mail: 12095569@qq.com

［Abstract］Background and purpose: miR-124 is considered to be a tumor suppressor in multiple tumors, including lung cancer, prostate cancer, bladder cancer, and breast cancer. However, its function is unclear in gastric cancer. This study aimed to explore the expression of miR-124 in human gastric mucosal epithelium cells and different gastric cancer cells, as well as gastric cancer tissues and matched para-cancerous tissues. The correlations of miR-124 expression with gender, age, histological grade, T stage, TNM stage, lymph node metastasis and prognosis of gastric cancer patients were analyzed. Methods: A real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction （RTFQ-PCR）was employed for detecting the expression of miR-124 in human gastric mucosal epithelium cells and gastric cancer cells. The expression of miR-124 in gastric cancer tissues and matched para-cancerous tissues was detected by in situ hybridization. Results: The RTFQ-PCR results indicated that the expression of miR-124 was down-regulated in MKN-74, MKN-28, MKN-45, MGC-803, SGC-7901 and AGS cells compared to GES-1 cells. In situ hybridization showed that miR-124 was strongly expressed in normal gastric mucosa. However, low expression, focal positive expression or lack of miR-124 expression were observed in gastric cancer tissues. Statistical analysis showed that miR-124 was closely correlated to histological stage, TNM stage and node metastasis of gastric cancer patients, but not the age, gender and tumor size. The OS and DFS of the patients with low expression of miR-124 were shorter than that of the patients with high expression of miR-124. Multivariate analysis suggested that miR-124 down-regulation was an independent prog-nostic factor for survival in patients with gastric cancer. Conclusion: miR-124 is down-regulated in gastric cancer cells and tissues. The expression of miR-124 is correlated to histological stage, TNM stage, node metastasis and prognosis.

［Key words］Gastric cancer； miR-124； Clinical significance； In situ hybridization

DOI:10.3969/j.issn.1007-3969.2016.03.003

中圖分類號：R735.2

文獻標志碼：A

文章編號：1007-3639(2016)03-0215-06

基金項目：國家自然科學基金（31100935）；湖南省醫(yī)藥衛(wèi)生科研基金（B2013-041）。

通信作者：鄔力祥 E-mail:12095569@qq.com

收稿日期：（2015-04-17 修回日期：2015-08-25）