劉永敏，段　萍，鄢文海，何　芳，唐　娜，鐘　華

（1.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室，新疆石河子832002；2.鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，河南鄭州450001；3.鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，河南鄭州450001）

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過(guò)表達(dá)microRNA-29a上調(diào)鋅脂蛋白91對(duì)大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡的影響*

劉永敏1，段萍2，鄢文海3，何芳1，唐娜1，鐘華1

（1.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室，新疆石河子832002；2.鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，河南鄭州450001；3.鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，河南鄭州450001）

摘要：目的建立高感染效率、穩(wěn)定過(guò)表達(dá)microRNA-29a（miR-29a）的大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞（PC12），探索miR-29a對(duì)PC12細(xì)胞凋亡的影響。方法將miR-29a前體表達(dá)載體、空白對(duì)照載體進(jìn)行慢病毒包裝，用病毒上清感染PC12并進(jìn)行抗性篩選。實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）檢測(cè)miR-29a的表達(dá)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)miR-29a穩(wěn)定過(guò)表達(dá)組、空質(zhì)粒對(duì)照組以及未感染組PC12細(xì)胞的凋亡情況，利用TargetScan 6.0數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)miR-29a的關(guān)鍵靶點(diǎn)，RT-qPCR以及Western blot檢測(cè)預(yù)測(cè)的miR-29a下游靶基因mRNA以及蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果經(jīng)抗性篩選后獲得穩(wěn)定表達(dá)miR-29a的PC12細(xì)胞系，熒光顯微鏡下觀(guān)察各組PC12細(xì)胞的感染效率均達(dá)80％以上，miR-29a過(guò)表達(dá)組凋亡率為（5.1±0.92）％，空質(zhì)粒對(duì)照組為（1.832±0.26）％，未感染組為（1.667±0.185）％，miR-29a過(guò)表達(dá)促進(jìn)PC12細(xì)胞凋亡（P＜0.01），空質(zhì)粒對(duì)照組與未感染組細(xì)胞凋亡率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；RT-qPCR檢測(cè)miR-29a過(guò)表達(dá)時(shí)鋅指蛋白91（ZFP91）的表達(dá)量升高，miR-29a過(guò)表達(dá)組ZFP91 mRNA的表達(dá)量是空質(zhì)粒對(duì)照組的1.835倍（P=0.000），空質(zhì)粒對(duì)照組與未感染組ZFP91 mRNA的表達(dá)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；Western blot檢測(cè)的ZFP91蛋白表達(dá)量與空質(zhì)粒對(duì)照組比較也升高。結(jié)論在PC12中miR-29a過(guò)表達(dá)促進(jìn)PC12細(xì)胞凋亡，過(guò)表達(dá)miR-29a也促進(jìn)ZFP91表達(dá)，其機(jī)制仍待進(jìn)一步闡明。

關(guān)鍵詞：microRNA-29a；鋅指蛋白91；細(xì)胞凋亡；大鼠；嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)

微小RNA（microRNA，miRNA）是一類(lèi)高度保守的、長(zhǎng)18～25 nt的非編碼小分子RNA。miRNA通過(guò)直接結(jié)合目標(biāo)基因的3'-非翻譯區(qū)（3'- untranslated region，3'-UTR）或編碼序列（coding sequence，CDS），調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄后水平，該調(diào)節(jié)可能通過(guò)抑制mRNA的蛋白質(zhì)翻譯或促進(jìn)降解mRNA。miR-29a是miR-29家族成員之一，于2001年Lagos-Quintana等［1］在人Hela細(xì)胞中克隆獲得的，定位于人染色體7q32.3的負(fù)鏈。目前，研究已確定人類(lèi)miR-29廣泛參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等多種生物學(xué)過(guò)程。

miRNA在調(diào)控細(xì)胞凋亡方面作用顯著，已有很多研究表明miR-29a在很多腫瘤組織中的表達(dá)下調(diào)（如腦膠質(zhì)瘤［2］，慢性淋巴細(xì)胞白血?。?］、急性髓性白血病等［4］），同時(shí)也有一些研究表明miR-29在心血管疾?。?］、神經(jīng)退行性疾?。?-7］、艾滋?。?-10］中也出現(xiàn)異常高表達(dá)，通過(guò)調(diào)控下游靶基因促進(jìn)正常細(xì)胞凋亡，從而引起相關(guān)疾病。miR29a對(duì)大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞（pheochromocytoma cells，PC12）凋亡的影響及其相應(yīng)靶基因的調(diào)控研究目前仍缺乏報(bào)道。本研究通過(guò)慢病毒介導(dǎo)miR-29a前體表達(dá)載體感染PC12細(xì)胞，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PC12細(xì)胞凋亡的變化，用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）、Western blot檢測(cè)下游靶基因鋅指蛋白91（zinc finger protein 91，ZFP91）表達(dá)的變化，進(jìn)一步豐富miR-29a促進(jìn)PC12細(xì)胞凋亡相關(guān)理論，為闡明miR-29在神經(jīng)退行性疾病發(fā)生中的作用機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)，為其防治提供新靶標(biāo)。

1材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

miRNA-29a前體表達(dá)克隆RmiR6139-MR03、對(duì)照質(zhì)粒CmiR60001-MR03，均帶有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP），以及Lenti-PacTMHIV Expression Packaging Kit均購(gòu)自廣州GeneCopoeia公司，無(wú)血清培養(yǎng)基Ⅰ購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，High glucose達(dá)爾伯克必需基本培養(yǎng)基（dulbecco's minimum essential medium，DMEM）、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）均購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司，藻紅蛋白-Annexin Apoptosis Detection Kit以及異硫氰酸熒光素-Annexin Apoptosis Detection Kit購(gòu)自美國(guó)BD公司，總RNA提取試劑盒（Trizol）購(gòu)自北京天根生化科技有限公司，cDNA第一鏈試劑盒、SybrGreen PCR Master Mix（2×）購(gòu)自大連寶生生物工程有限公司，ZFP91及β-Actin抗體均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，嘌呤霉素購(gòu)自北京Solabio公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

大鼠嗜鉻瘤PC12細(xì)胞由鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院干細(xì)胞中心饋贈(zèng)，人胚腎細(xì)胞293T細(xì)胞株由鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室陳萍老師饋贈(zèng)，兩種細(xì)胞均用High-glucose DMEM和10％FBS培養(yǎng)。

1.3 慢病毒包裝

包裝前24 h，分別接種4×106～5×106個(gè)293T細(xì)胞到2個(gè)100 mm培養(yǎng)皿中。按照慢病毒包裝試劑盒（Lenti-PacTMHIV Expression Packaging Kit）說(shuō)明書(shū)，分別包裝miRNA-29a前體表達(dá)質(zhì)粒、對(duì)照質(zhì)粒，孵育過(guò)夜（8～14 h）換新鮮培養(yǎng)基，再培養(yǎng)48 h收獲病毒上清，500×g離心10 min去除細(xì)胞碎片。病毒上清可馬上用于感染，或分裝置于-80℃冰箱冷凍保存。

1.4 慢病毒感染PC12細(xì)胞、抗性篩選以及計(jì)算感染效率

感染前24 h接種2×105個(gè)/孔的PC12細(xì)胞于6孔板，病毒感染時(shí)細(xì)胞50％～70％融合。每孔分別加miR-29a前體表達(dá)質(zhì)粒和對(duì)照質(zhì)粒的病毒上清液各200μl，并各加入終濃度為4μg/ml的聚凝胺。感染24 h后，吸出原培養(yǎng)基，換終濃度為1.5μg/ml嘌呤霉素培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。之后每3天更換抗性培養(yǎng)基，連續(xù)篩選14 d，分別命名這兩組細(xì)胞為miR29a-PC12和EGFP-PC12-control（空質(zhì)粒對(duì)照組）。計(jì)算感染效率有兩種方法：①通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)表達(dá)綠色熒光蛋白的細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比來(lái)計(jì)算感染效率，該方法得到的感染效率很精確；②通過(guò)4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）核染色，熒光顯微鏡下選取同一個(gè)視野，分別數(shù)熒光細(xì)胞個(gè)數(shù)，計(jì)算EGFP陽(yáng)性細(xì)胞百分比=EGFP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/DAPI陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)×100％，隨機(jī)選取幾個(gè)視野求均數(shù)，該方法可以粗略計(jì)算感染效率。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)兩組細(xì)胞的凋亡率

用0.25％的胰酶消化細(xì)胞，將細(xì)胞懸液移至流式管中，1 000 r/min離心5min，棄上清液，磷酸鹽緩沖溶液洗2遍，離心棄上清液。將細(xì)胞重懸于Annexin ⅤBinding Buff中，再各加入4μl PE-AnnexinⅤ和4μl 7-氨基放線(xiàn)菌素（7-AAD），輕柔混勻，室溫避光放置15 min，每管各加入200μl 1×AnnexinⅤBinding Buffer，混勻，1 h內(nèi)上機(jī)檢測(cè)。

1.6 RT-qPCR檢測(cè)miR-29a下游的靶基因

引物序列：ZFP91正向引物：TGCGACATGCGAA ACATCATA，反向引物：GTGTACTGCCAGATTGTGG GAAC。各組細(xì)胞總RNA提取，cDNA第一鏈逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄cDNA，在冰上配置反應(yīng)體系（20μl）：Sybr Premix Ex TaqTMⅡ（2×）10μl，PCR Forward Primer（10μmol）0.5μl，PCR Reverse Primer （10μmol）0.5μl，Rox Reference Dyell（50×）0.4μl，cDNA模板（≤100 ng）2.0μl，ddH2O 6.0μl。兩步法PCR擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火34 s。

1.7 Western blot檢測(cè)miR29a下游靶蛋白的變化

提取各組細(xì)胞的總蛋白并定量，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，調(diào)節(jié)電壓，使過(guò)分離膠120 V，基層膠60 V，以染料的前沿遷移至凝膠的底部為標(biāo)準(zhǔn)終止電泳。恒定電流70 mA轉(zhuǎn)膜1 h。5％脫脂奶粉封閉膜，一抗孵育4℃搖床過(guò)夜，加辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠lgG（1∶5 000）37℃孵育1 h，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色，顯影定影，沖洗膠片，對(duì)條帶進(jìn)行灰度分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1 慢病毒包裝

在倒置顯微鏡下觀(guān)察293T細(xì)胞，呈三角形，或多角形，貼壁生長(zhǎng)，排列整齊。病毒包裝前細(xì)胞達(dá)到70％～80％匯合（見(jiàn)圖1包裝前），病毒包裝48 h后，293T細(xì)胞胞體略微回縮變圓，細(xì)胞狀態(tài)變差，培養(yǎng)皿內(nèi)漂浮著少量死細(xì)胞（見(jiàn)圖1包裝后），熒光顯微鏡下觀(guān)察，在慢病毒包裝后293T細(xì)胞發(fā)出大量綠色熒光（見(jiàn)圖1熒光顯微鏡下包裝后）。

圖1　慢病毒包裝前后的293T細(xì)胞（×40）

2.2 穩(wěn)定過(guò)表達(dá)miR-29a細(xì)胞株建立

慢病毒感染后，經(jīng)過(guò)2周的嘌呤霉素篩選，分別篩選出穩(wěn)定過(guò)表達(dá)miR29a-PC12細(xì)胞株及EGFPPC12-control細(xì)胞株（見(jiàn)圖2），PC12細(xì)胞株的整個(gè)胞體都有綠色熒光蛋白表達(dá)，通過(guò)DAPI核染色熒光顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞核發(fā)出藍(lán)色熒光，通過(guò)計(jì)算EGFP陽(yáng)性細(xì)胞百分比，miR-29a-PC12的感染率為83.7％ （72/84），空質(zhì)粒對(duì)照組感染率為88.4％（93/105）。

圖2　中每一橫列為同一視野細(xì)胞在自然光下、熒光顯微鏡下DAPI核染色后藍(lán)色熒光以及熒光顯微鏡下綠色熒光蛋白的表達(dá)情況圖2　穩(wěn)定過(guò)表達(dá)miR29a-PC12細(xì)胞株及EGFP-PC12-control細(xì)胞株（×40）

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率

各組細(xì)胞凋亡率經(jīng)方差分析得出，各組細(xì)胞凋亡率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=12.099，P=0.008），進(jìn)一步兩兩比較發(fā)現(xiàn)，MiR-29a過(guò)表達(dá)PC12細(xì)胞凋亡率顯著高于空質(zhì)粒對(duì)照組（P＜0.01），說(shuō)明MiR過(guò)表達(dá)可以促進(jìn)PC12細(xì)胞凋亡，而空質(zhì)粒對(duì)照組與未感染組比較，細(xì)胞凋亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖3和表1。

圖3　過(guò)表達(dá)miR-29a對(duì)PC12細(xì)胞凋亡的影響

表1　各組PC12細(xì)胞的凋亡率比較（n=3，％，±s）

表1　各組PC12細(xì)胞的凋亡率比較（n=3，％，±s）

注：1）流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，計(jì)算方法：表達(dá)凋亡蛋白的細(xì)胞數(shù)（流式凋亡圖的Q4象限）/表達(dá)綠色熒光蛋白的細(xì)胞數(shù)× 100％；2）通過(guò)Dunnett（雙側(cè)）兩兩比較，將EGFP- PC12-control設(shè)為對(duì)照組，將其與其他各組進(jìn)行兩兩比較

組別　　細(xì)胞凋亡率1）F值　P值　P值2）（兩兩比較）未感染組　1.667±0.185 12.099　 0.008　 0.972空質(zhì)粒對(duì)照組　1.823±0.26　1.000 miR-29a過(guò)表達(dá)組　5.1±0.92　0.011

2.4 各組PC12細(xì)胞ZFP91 mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)水平

本研究前期利用Target Scan 6.0數(shù)據(jù)庫(kù)以及Pictar 5數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)ZFP91可能是MiR-29a下游的靶基因，通過(guò)RT-qPCR及Western blot對(duì)各組PC12細(xì)胞的ZFP91 mRNA和蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)驗(yàn)證，結(jié)果顯示，miR-29a過(guò)表達(dá)時(shí)ZFP91 mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)升高，miR-29a過(guò)表達(dá)組ZFP91的表達(dá)量是空質(zhì)粒對(duì)照組的1.835倍（P=0.000），未感染組與空質(zhì)粒對(duì)照組相比ZFP91 mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)量的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表2和圖4、5。

表2　各組ZFP91 mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)比較（n=3，±s）

表2　各組ZFP91 mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)比較（n=3，±s）

注：?與空質(zhì)粒對(duì)照組比較，P＜0.05

組別　ZFP91 mRNA　ZFP91蛋白相對(duì)倍數(shù)　F值　　相對(duì)倍數(shù)　F值　P值未感染組　1.113±0.048 14.320 0.000 0.941±0.211 21.990 0.000空質(zhì)粒對(duì)照組　1　1 P值miR-29a過(guò)表達(dá)組　1.835±0.211?2.17±0.47?

圖4　各組PC12細(xì)胞的ZFP91 mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)

圖5　Western blot檢測(cè)各組ZFP91蛋白的表達(dá)

3　討論

PC12細(xì)胞是大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞瘤分化細(xì)胞株，具有神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的一般特征。本實(shí)驗(yàn)擬以PC12細(xì)胞為研究對(duì)象，通過(guò)慢病毒介導(dǎo)的miR-29a前體感染PC12細(xì)胞，使miR-29a在PC12細(xì)胞中過(guò)表達(dá)，慢病毒感染后再經(jīng)過(guò)嘌呤霉素篩選，成功獲得穩(wěn)定過(guò)表達(dá)miR-29a的PC12細(xì)胞系，該細(xì)胞系可以穩(wěn)定傳代、凍存及復(fù)蘇，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定良好基礎(chǔ)。

miR-29a是miR-29家族中的一員，其存在于第7號(hào)染色體7q32上。已有很多研究證明miR-29a在腫瘤組織中低表達(dá)，提示miR-29a可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)凋亡，其機(jī)制主要有miR-29a過(guò)表達(dá)可抑制NF-ΚB信號(hào)途徑［11］，直接抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的活性［12］以及激活Caspase途徑［13］，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究也證實(shí)，miR-29a可促進(jìn)PC12細(xì)胞凋亡，而在細(xì)胞培養(yǎng)中本研究發(fā)現(xiàn)一些有意義的現(xiàn)象：①經(jīng)過(guò)相同的培養(yǎng)條件培養(yǎng)48 h后，miR-29a過(guò)表達(dá)組和對(duì)照組的培養(yǎng)基顏色明顯不同，miR-29a過(guò)表達(dá)組的培養(yǎng)基依舊為紅色，而空質(zhì)粒對(duì)照組和未感染組的培養(yǎng)基為橙黃色；②在相同的接種密度下，miR-29a過(guò)表達(dá)組細(xì)胞的增殖速度較空質(zhì)粒對(duì)照組慢。基于上述現(xiàn)象，筆者分析認(rèn)為由于培養(yǎng)液中有指示劑酚紅存在，故培養(yǎng)基顏色的變化可間接提示細(xì)胞生長(zhǎng)的狀態(tài)，miR-29a過(guò)表達(dá)可能抑制PC12細(xì)胞的增殖，使細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)變差，產(chǎn)酸減少，所以在經(jīng)過(guò)48 h細(xì)胞培養(yǎng)后培養(yǎng)基還為紅色，這也從另一個(gè)角度印證miR-29a過(guò)表達(dá)促進(jìn)PC12細(xì)胞凋亡而抑制其增殖。

ZFP91是編碼63.4 kD的核蛋白，含有5個(gè)連續(xù)的鋅指結(jié)構(gòu)域，屬于鋅指蛋白家族。ZFP91最早在人類(lèi)急性髓性白血病模型中被發(fā)現(xiàn)，認(rèn)為它在促進(jìn)細(xì)胞增殖以及抗細(xì)胞凋亡中起重要作用，抑制ZFP91的表達(dá)可顯著增加細(xì)胞凋亡率［14］。后續(xù)又有研究報(bào)道ZFP91在前列腺癌以及前列腺癌細(xì)胞系，例如前列腺淋巴結(jié)癌及人前列腺癌細(xì)胞、DU145、22Rv1中高表達(dá)［15］，其機(jī)制可通過(guò)泛素化和激活絲裂原活化蛋白激酶3K14進(jìn)而主動(dòng)調(diào)控非經(jīng)典的核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear transcription factor-κB，NF-κB）信號(hào)通路［15-16］。在結(jié)核桿菌感染子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞系模型中ZFP91隨感染時(shí)間先升高后降低，這與結(jié)核桿菌感染后泛素蛋白酶體系統(tǒng)活化有關(guān)［17］。本研究前期利用Target Scan 6.0數(shù)據(jù)庫(kù)以及Pictar 5數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)ZFP91的3'-非翻譯區(qū)有miR-29a的結(jié)合位點(diǎn)，ZFP91可能是miR-29a的靶基因，RT-qPCR 及Western blot驗(yàn)證后發(fā)現(xiàn)，miR-29a在PC12中長(zhǎng)期、穩(wěn)定地過(guò)表達(dá)時(shí)ZFP91的表達(dá)是上調(diào)的，這與傳統(tǒng)意義上miRNA通過(guò)結(jié)合到靶基因的3'-UTR或編碼序列進(jìn)而下調(diào)靶基因mRNA或蛋白質(zhì)的經(jīng)典理論不相符，提示miRNA調(diào)控下游靶基因的方式可能不止靶向抑制這一種，還可以通過(guò)穩(wěn)定和上調(diào)靶基因進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的增殖和凋亡以及生物學(xué)特性。筆者推測(cè)可能的原因是：①由于miRNAs的網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)特點(diǎn)，幾個(gè)miRNA可以共同調(diào)控一個(gè)基因的表達(dá)，miR-29a在PC12細(xì)胞中過(guò)表達(dá)，可能影響到其他miRNA或其他表觀(guān)遺傳學(xué)調(diào)控，進(jìn)而影響ZFP91的表達(dá)；②外源性miR-29a過(guò)表達(dá)抑制細(xì)胞增殖而促進(jìn)凋亡，而PC12細(xì)胞自身可能會(huì)產(chǎn)生應(yīng)激來(lái)抵抗這種作用。已有文獻(xiàn)報(bào)道，miR-29過(guò)表達(dá)可以抑制NF-κB信號(hào)通路的激活［11，18］，而ZFP91作為一個(gè)抗凋亡基因，其也是NF-κB信號(hào)通路的一個(gè)重要的調(diào)控元件，ZFP91通過(guò)泛素化作用，激活和穩(wěn)定E3泛素連接酶［19］及MAP3K14來(lái)激活非經(jīng)典的NF-κB信號(hào)途徑，以削減miR-29a過(guò)表達(dá)對(duì)NF-κB信號(hào)通路的抑制作用，它的表達(dá)量增加可以有效對(duì)抗miR-29a促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，miR-29a可以促進(jìn)PC12細(xì)胞凋亡，并提示ZFP91與miR-29a及細(xì)胞凋亡有著必然的聯(lián)系，其機(jī)制可能是ZFP91作為一個(gè)抗凋亡蛋白激活非經(jīng)典的NF-κB信號(hào)通路來(lái)抵制miR-29a的促凋亡作用，進(jìn)一步豐富miR-29a促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的相關(guān)理論，為神經(jīng)退行性疾病的防治提供新思路。

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（申海菊編輯）

Overexpression of microRNA-29a up-regulates zinc finger protein 91 expression and regulates cell apoptosis in PC12*

Yong-min Liu1，Ping Duan2，Wen-hai Yan3，F(xiàn)ang He1，Na Tang1，Hua Zhong1
（1. Department of Pathophysiology，Medical College of Shihezi University，Shihezi，Xinjiang 832002，China；2. Department of Physiology，3. Department of Pathophysiology，College of Basic Medical Sciences，Zhengzhou University，Zhengzhou，Henan 450001，China）

Abstract:Objective To establish a rat adrenal pheochromocytoma cell line（PC12）with highly-infective efficiency and stable overexpression of miR-29a，and to explore the role of miR-29a in apoptosis of PC12. Methods The miR-29a precursors expressing viral vectors（Lvx-miR-29a-eGFP）and control vector（LvxeGFP-control）were packaged to Lentivirus respectively，and PC12 cells were infected by Lentivirus and underwent resistance screening. Flow cytometry（FCM）was used to detect the cell apoptosis，and then real time quantitative PCR（RT-qPCR）and Western blot were used to measure the levels of targets gene mRNA and protein of miR-29a. Results PC12 cell lines with high infection efficiency and stable overexpression of miR-29a were established，the EGFP-positive cell percentage was over 80％in the infected PC12 cells. miR-29aoverexpression significantly increased cell apoptosis rate in PC12 when campared to the eGFP-control group and non-infection group（P＜0.01），and significantly up-regulated the mRNA and protein levels of zinc finger protein 91（ZFP91）in the PC12. Conclusions Our study demonstrated overexpression of miR-29a can effectively up-regulate ZFP91 expression and promote apoptosis of PC12. Its mechanism remains to be further elucidated.

Keywords:microRNA 29a；zinc finger protein 91；cell apoptosis；PC12；RT-qPCR；rat

中圖分類(lèi)號(hào)：R736.6

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

DOI:10.3969/j.issn.1005-8982.2016.11.004

文章編號(hào)：1005-8982（2016）011-0018-06

收稿日期：2015-12-28

*基金項(xiàng)目：石河子大學(xué)優(yōu)秀青年科技人才培育計(jì)劃（No：2013ZRKXYQ25）