徐穎超， 劉　暢， 常曉杰

(錦州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院， 遼寧 錦州 121000)

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聚乙烯醇-海藻酸鈉-活性炭固定化大腸桿菌在不同水體中的毒性檢測

徐穎超， 劉暢*， 常曉杰

(錦州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院， 遼寧 錦州 121000)

摘要：為構(gòu)建以鐵氰化鉀為探針的電化學(xué)用于化學(xué)品的毒性檢測方法,初步探討了聚乙烯醇(PVA)與添加劑海藻酸鈉(SA)、活性炭(AC)共固定包埋大腸桿菌(E.coli)的活性微生物顆粒在實(shí)驗(yàn)室廢水、毒物3,5-二氯苯酚(DCP)、殺蟲劑乙嘧酚以及除草劑五氰磺草胺的水樣毒性分析中的應(yīng)用性能。結(jié)果表明：添加劑SA和AC的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為1%，交聯(lián)劑CaCl2的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%為本研究最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件，此時所測毒物對微生物固定化顆粒的呼吸抑制作用依次為DCP>乙嘧酚>五氰磺草胺>實(shí)驗(yàn)室廢水，抑制率分別是30.23%～55.35%、25.14%～46.23%、20.12%～38.33%和5.74%～27.89%，抑制率和靈敏度均明顯優(yōu)于僅由PVA-SA單獨(dú)固定包埋的大腸桿菌顆粒。

關(guān)鍵詞：添加劑； 微生物固定化； 電化學(xué)； 毒性檢測

聚乙烯醇(PVA)是一種無色無毒、生物相容性好、抗微生物降解能力強(qiáng)、化學(xué)性能穩(wěn)定且力學(xué)性能優(yōu)良的合成高分子聚合物，具有很好的成膜性，被認(rèn)為是最有效的固定化載體之一[1-5]。海藻酸鈉(SA)是一種天然多糖，具有很好的穩(wěn)定性和黏性，且價格低廉，廣泛應(yīng)用于固定活細(xì)胞和敏感細(xì)胞[6-11]。PVA中添加SA可以避免固定化顆粒制備過程中的粘連現(xiàn)象，改善PVA的成球性[12-16]。

目前，PVA-SA固定微生物技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于廢水處理領(lǐng)域，如去除廢水中氨氮、重金屬及水體富營養(yǎng)化等方面[13,17-22]。然而，PVA-SA固定化存在著機(jī)械強(qiáng)度較低、顆粒易破裂及微生物活性降低不利于長期使用等缺點(diǎn)[23-26]。因此，為了提高微生物活性和共混顆粒的機(jī)械強(qiáng)度,本研究嘗試同時混合PVA、SA與活性炭(AC)制備PVA-SA-AC共混顆粒，以改善PVA-SA固定化載體的缺陷，制備出更加優(yōu)良的共混顆粒應(yīng)用于工農(nóng)業(yè)的廢水處理。

根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)，電化學(xué)結(jié)合鐵氰化鉀探針可有效應(yīng)用于化學(xué)品的毒性檢測[27-28]。以此為基礎(chǔ)，本文通過監(jiān)測鐵氰化鉀還原產(chǎn)物量的變化，考察共混微生物顆粒的呼吸作用強(qiáng)度，從而對共混顆粒中的添加劑含量和交聯(lián)劑CaCl2含量進(jìn)行擇優(yōu)篩選，尋找最優(yōu)包埋條件。進(jìn)而研究在最優(yōu)條件下共混顆粒的菌種活性、機(jī)械強(qiáng)度及膨脹性，最終將其用于不同毒物的毒性檢測，并監(jiān)測其保存周期內(nèi)對毒物靈敏度的變化。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

菌種：大腸桿菌從遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院采集，純化后用體積分?jǐn)?shù)15%的甘油于-20 ℃冷凍保存。

LB培養(yǎng)基：酵母粉質(zhì)量濃度為5 g/L，NaCl質(zhì)量濃度為10 g/L，蛋白胨質(zhì)量濃度為10 g/L，調(diào)節(jié)pH值為7.0，于120 ℃下滅菌20 min后備用。

磷酸緩沖溶液(PBS)：KH2PO40.08 mol/L，Na2HPO40.12 mol/L，于120 ℃下滅菌20 min后備用。

葡萄糖-谷氨酸(GGA)標(biāo)準(zhǔn)溶液：葡萄糖質(zhì)量濃度為150 mg/L，谷氨酸質(zhì)量濃度為150 mg/L。

鐵氰化鉀母液的量濃度為0.33 mol/L。

3,5二氯苯酚(DCP)、乙嘧酚和五氰磺草胺母液質(zhì)量濃度均為100 mg/L。

鐵氰化鉀和標(biāo)準(zhǔn)GGA溶液均為使用當(dāng)天配制。AC和SA為化學(xué)純，除蛋白胨和酵母提取物外的其他試劑均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

CHI832C電化學(xué)分析儀，上海辰華儀器有限公司；KYC-100B空氣恒溫?fù)u床，上海福瑪實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司；721可見分光光度計(jì)，上海欣茂儀器有限公司；TG16-WS臺式高速離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋 HH-4，常州國華電器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌種處理方法 取200 μL大腸桿菌(Escherichcoli，E.coli)菌種接入330 mL的LB培養(yǎng)基中,于恒溫?fù)u床中培養(yǎng)14 h(37 ℃，120 r/min)，平行培養(yǎng)2份。將培養(yǎng)后的菌液在4 000 r/min下離心10 min，棄去上層培養(yǎng)基，菌體沉淀用PBS洗滌2次后，懸浮于20 mL PBS中。采用721可見分光光度計(jì)檢測菌懸液的光密度值(OD600)，檢測波長為600 nm，并將其調(diào)節(jié)為10.0后，放于4 ℃冰箱中備用。

1.3.2 固定化微生物顆粒制備將聚乙烯醇與一定量的SA和AC充分熱融，冷卻后與上述處理后的菌種均勻混合，保持總體積為10 mL，聚乙烯醇的終濃度為10 g/L，細(xì)菌OD600=10.0。隨后將混合液用針管注射器滴入到含一定量CaCl2的100 mL飽和H3BO3溶液(pH值為6.7)中，并不斷攪拌，形成固定化顆粒(平均直徑約1.5 mm)。于4 ℃冰箱內(nèi)，固定微生物的復(fù)合膠粒在CaCl2-H3BO3溶液中交聯(lián)24 h后，濾出凝膠顆粒，采用PBS洗滌后備用。

1.3.3 分析方法將固定化微生物顆粒放于已通入高純氮20 min的K3Fe(CN)6和GGA的混合培養(yǎng)液中，并保證混合培養(yǎng)液的總體積為10.0 mL，混合后懸液中的K3Fe(CN)6為45 mmol/L，GGA 為220 mg/L，3,5-二氯苯酚(3,5-Dichlorophenol，DCP)、乙嘧酚和五氰磺草胺的濃度范圍均為0～5 mg/L，實(shí)驗(yàn)室廢水體積為0.1～0.5 mL。37 ℃水浴通氮培養(yǎng)1 h后，取1 mL懸液(每份樣品平行取3份)于8 000 r/min離心3 min，結(jié)束反應(yīng)。其中，固定化微生物活性檢測時，混合培養(yǎng)液中毒物的質(zhì)量濃度為0 mg/L。

(1)

毒物毒性大小用毒物對微生物的抑制率表示，如式(2)所示

(2)

其中：Inor為正常微生物進(jìn)行新陳代謝的極限電流強(qiáng)度；Itox為加入毒物后微生物進(jìn)行新陳代謝的極限電流強(qiáng)度；Iinhibition為毒物對固定化微生物顆粒的抑制率。

1.4 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

1.4.1 添加劑及交聯(lián)劑用量對固定化微生物活性的影響分別選取海藻酸鈉(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%、1.0%、1.5%)及活性炭(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%、1.0%、1.5%)與質(zhì)量濃度10 g/L的聚乙烯醇混合包埋的固定化顆粒各3顆，于不含毒物的鐵氰化鉀和GGA的混合培養(yǎng)液中通氮保溫培養(yǎng)1 h后，采用電化學(xué)方法檢測添加劑與交聯(lián)劑的使用量對E.coli活性影響。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)如下。

實(shí)驗(yàn)條件:海藻酸鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為A(%)，活性炭的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為B(%)，交聯(lián)劑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)C(%)，以電流比值為主要評價指標(biāo)，各因素的取值范圍及其水平設(shè)計(jì)如表1所示。

1.4.2 添加劑對固定化微生物顆?；钚缘挠绊戨S機(jī)取固定化微生物顆粒30顆，放入培養(yǎng)皿中4 ℃真空冷藏保存，備用。每隔5天各選取固定化顆粒3顆，進(jìn)行檢測。用計(jì)時電流法檢測相同時段固定化微生物顆粒的生物活性。將各極限電流代入公式(1)，并繪制出活性隨存貯周期變化曲線。

1.4.3 固定化微生物顆粒的機(jī)械強(qiáng)度將所得的最優(yōu)條件下的30顆PVA-SA-AC包埋的微生物顆粒放入含100 mL PBS的反應(yīng)器內(nèi)，在25 ℃，120 r/min磁力攪拌器下均勻攪拌，記錄1～12 h內(nèi)固定化顆粒完好的個數(shù)占顆?？倲?shù)的比率以表示其機(jī)械穩(wěn)定性。

1.4.4 固定化微生物顆粒的膨脹性隨機(jī)取30顆固定化微生物顆粒，分別用游標(biāo)卡尺測定每顆顆粒的直徑；隨后將其放入250 mL含100 mL PBS的錐形瓶中4 ℃冷藏，用游標(biāo)卡尺記錄1～5 h存儲時間內(nèi)顆粒直徑的變化；根據(jù)顆粒在不同時間的平均溶脹直徑與初始顆粒的平均直徑之比來表示顆粒的膨脹性能。

1.4.5 固定化微生物顆粒在不同水體中的毒性檢測實(shí)驗(yàn)選取了毒物DCP、殺蟲劑乙嘧酚、除草劑五氰磺草胺和實(shí)驗(yàn)室廢水作為研究對象，用計(jì)時電流法考察優(yōu)化后的固定化微生物顆粒對上述毒物的響應(yīng)，并與只含有10 mg/LPVA-1% SA固定化E.coli的顆粒作對比。分別選取PVA-SA-AC或PVA-SA固定E.coli顆粒投入已通氮20 min的培養(yǎng)液中。培養(yǎng)液成分包括：45 mmol/L鐵氰化鉀，220 mg/L GGA及不同濃度的有機(jī)毒物或?qū)嶒?yàn)室廢水，其中DCP、乙嘧酚和五氰磺草胺的濃度范圍均為1～5 mg/L，實(shí)驗(yàn)室廢水的體積添加量為0.1～0.5 mL。繼續(xù)通氮恒溫(37 ℃)培養(yǎng)1 h后，離心結(jié)束反應(yīng)并檢測各樣品的極限電流，記為Itox。在相同培養(yǎng)條件下，固定化微生物顆粒在不含毒物的培養(yǎng)液中反應(yīng)1 h后，檢測得電流記為Inor。將所得電流值帶入公式(2)，以抑制率為縱坐標(biāo)，毒物濃度為橫坐標(biāo)，繪制曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 添加劑及交聯(lián)劑用量對固定化微生物

活性的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。交聯(lián)劑濃度過小時，交聯(lián)不完全，顆粒強(qiáng)度彈性差；交聯(lián)劑濃度過大，會降低小球的傳質(zhì)性能，因此選擇2%的CaCl2最為合適。而海藻酸鈉和活性炭濃度均為1%時達(dá)到最好的固定條件，低于或高于此濃度水平，都會影響微生物的活性。

分析結(jié)果顯示，各因素對兩種固定方法的影響順序均依次為：A—B—C，即海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)>活性炭質(zhì)量分?jǐn)?shù)>CaCl2質(zhì)量分?jǐn)?shù)。得到的實(shí)驗(yàn)理論最優(yōu)組合為A2B2C2，即海藻酸鈉和活性炭質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為1%，CaCl2質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%。對其進(jìn)行驗(yàn)證，得其活性比為7.47，效果較其他實(shí)驗(yàn)組合都好，故此配比將繼續(xù)應(yīng)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)制備固定化微生物顆粒。

2.2 固定化微生物顆粒的活性

添加劑和交聯(lián)劑含量影響微生物活性，進(jìn)而影響其存儲周期。圖1中曲線a和b分別表示由10 mg/LPVA -1%SA-1%AC及10 mg/LPVA-1% SA包埋的固定化微生物顆粒的活性隨時間變化趨勢。由圖可知，PVA-SA-AC包埋微生物顆粒的初始活性比為7.47，經(jīng)50 d后菌活性仍達(dá)55.29%，80 d后活性下降為19.54%；PVA-SA包埋微生物顆粒的初始活性比為6.95，50 d后菌活性為52.23%， 80 d后活性僅為0.14%?？梢?，添加了AC后固定化顆粒的傳質(zhì)能力增強(qiáng)，微生物與外界有機(jī)物和PBS等有利生長因素接觸更加充分，因此可有效地延長菌體活性，增加顆粒儲藏時間。此外，AC表面有大量含氧官能團(tuán)，例如羧基、內(nèi)酯基和酚羥基等，這次官能團(tuán)經(jīng)常應(yīng)用于修飾生物電極，以提供更好的生物相容性。

固定化微生物顆粒的機(jī)械強(qiáng)度隨時間的變化如圖2所示，30 min之內(nèi)固定化顆粒機(jī)械強(qiáng)度隨時間變化均勻降低。隨著時間增加，固定化顆粒的機(jī)械強(qiáng)度急速下降，原因可能是固定化微生物顆粒在測定過程中吸水使得顆粒逐漸膨脹，導(dǎo)致微生物顆粒的機(jī)械強(qiáng)度迅速下降。

2.4 固定化微生物顆粒的膨脹性能

顆粒經(jīng)過活化后開始出現(xiàn)水溶膨脹現(xiàn)象，這主要是因?yàn)镻VA與H3BO3進(jìn)行反應(yīng)形成凝膠時,硼酸上的3個羥基只部分地進(jìn)行了反應(yīng),尚未完全反應(yīng)的羥基基團(tuán)與水形成氫鍵，使凝膠顆粒發(fā)生水溶膨脹的現(xiàn)象。圖3為由10 mg/LPVA-1%SA-1%AC包埋的微生物顆粒的膨脹性(a線)與僅由10 mg/LPVA-1% SA 包埋的微生物顆粒的膨脹性(b線)的比較。由圖可知，0～1 h之間a線上升速度明顯快于b線，1 h時PVA-SA-AC及PVA-SA包埋的固定化微生物顆粒的水溶膨脹系數(shù)分別增加了55%和40%，其原因可能是，AC可以使原本結(jié)構(gòu)緊密的顆粒變得相對疏松，易在水中膨脹。隨著時間的增加，1～5 h之間a線上升速度逐漸慢于b線,5 h后相應(yīng)的膨脹系數(shù)分別增加了30%和31.25%?？梢娞砑覣C后更有利于長期的固定化顆粒中微生物活性的保存。

選定優(yōu)化微生物固定顆粒，即10 g/L的PVA、1%的SA以及1%的AC共混包埋E.coli，建立微生物電化學(xué)傳感平臺，分別應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室采集的水樣、毒物DCP、農(nóng)藥乙嘧酚和除草劑五氰磺草胺的毒性檢測，并以僅由10 g/L的PVA與1%的SA共混固定包埋的E.coli顆粒作為對照，結(jié)果如圖4所示：A、B、C和D分別為水樣、DCP、乙嘧酚和五氰磺草胺對固定化微生物顆粒的抑制曲線；曲線a和b分代表毒物對PVA-SA-AC固定的E.coli顆粒及PVA-SA固定的E.coli顆粒的抑制作用。

圖4A中水樣對優(yōu)化的固定微生物顆粒的作用隨水樣添加體積的增加而增加，其抑制率為5.74%～27.89%；而相同條件下，對照顆粒的抑制率僅為3.27%～17.78%。圖4B中，DCP的濃度為1～5 mg/L時對優(yōu)化的固定微生物顆粒的抑制率為30.23%～55.35%；相同條件下的DCP對對照顆粒的抑制率為18.21%～48.32%。圖4C為1～5 mg/L乙嘧酚對E.coli的抑制率，其中優(yōu)化顆粒被抑制為25.14%～46.23%，相應(yīng)的對照顆粒的被抑制為20.12%～38.33%。圖4D是1～5 mg/L五氰磺草胺對優(yōu)化顆粒的抑制率為23.11%～45.15%；同樣濃度范圍內(nèi)對對照顆粒的抑制率為19.32%～32.54%。結(jié)果顯示，所測毒物對E.coli的呼吸抑制作用大小順序?yàn)镈CP>乙嘧酚>五氰磺草胺>實(shí)驗(yàn)室廢水；經(jīng)優(yōu)化包埋的固定化顆粒對毒性的靈敏度明顯高于對照微生物顆粒，主要是因?yàn)锳C建立的疏松結(jié)構(gòu)在有利于營養(yǎng)物質(zhì)傳輸?shù)耐瑫r，也加強(qiáng)了毒物與固定微生物的接觸，使其更加敏感。

3 結(jié)論

本文采用PVA-SA-AC摻雜膠體對E.coli進(jìn)行包埋，形成固定化微生物顆粒。通過計(jì)時電流法對固定微生物的活性變化進(jìn)行監(jiān)測，檢測其對各種毒物的靈敏度；通過浸泡和機(jī)械攪拌考察固定化顆粒的膨脹性能和機(jī)械強(qiáng)度。結(jié)果表明，添加劑SA、AC以及交聯(lián)劑CaCl2的濃度對所固定的微生物顆?；钚浴C(jī)械強(qiáng)度及膨脹性能均有一定影響。其中添加劑SA與AC的最優(yōu)質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為1%，交聯(lián)劑CaCl2的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%。經(jīng)優(yōu)化的固定化微生物顆粒儲存80 d后活性仍可達(dá)19.54%，且其機(jī)械強(qiáng)度及膨脹性能均有所改善。相對于PVA-SA包埋E.coli顆粒，PVA-SA-AC固定化微生物顆粒對測試毒物具有更好的靈敏度，毒物毒性順序?yàn)镈CP>乙嘧酚>五氰磺草胺>實(shí)驗(yàn)室廢水?？梢?，經(jīng)優(yōu)化的PVA-SA-AC固定化方法可有效提高固定化顆粒的物理性能和對毒物的靈敏度，延長被固定菌株的活性，因此在水質(zhì)毒性檢測領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。

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〔責(zé)任編輯王勇〕

Application of polyvinyl alcohol-alginate-activated carbon immobilizedE.coliin testing toxicity of different wastewater

XU Yingchao， LIU Chang*， CHANG Xiaojie

(College of Pharmacy，Jinzhou Medical University，Jinzhou 121000，Liaoning, China)

Abstract:To construct electrochemical detection toxicity of chemicals in water using ferricyanide as a probe, the toxicity of chemicals in different wastewater including laboratory wastewater, and poison of 3,5-dichlorophenol (DCP), pesticide ethirimol, herbicide five cyanide alachlor were determined by polyvinyl alcohol-alginate-activated carbon immobilizedE.coli. The following optimal experimental conditions were obtained.The quality score of sodium alginate and activated carbon additive are 1%, amount of cross-linking agent CaCl2is 2%. The order in the respiratory depression effect of toxicants on the microorganisms immobilized on particle are as following, DCP > ethirimol > five cyanide alachlor > laboratory waste, inhibition rate range of 30.23%～55.35%, 25.14%～46.23%, 20.12 %～38.33%～27.89% and 5.74%, respectively, and the sensitivity was significantly better than that treated by the PVA-SA immobilizedE.coli.Keywords: addition agent; immobilized microorganism; electrochemistry; toxicity testing

文章編號：1672-4291(2016)03-0085-06

doi:10.15983/j.cnki.jsnu.2016.03.335

收稿日期：2015-06-25

基金項(xiàng)目：遼寧省自然科學(xué)基金(2014022037)； 遼寧醫(yī)學(xué)院博士啟動基金(Y2012B006)

*通信作者：劉暢，女，副教授，博士。E-mail:liuchang_198006@163.com

中圖分類號：X522

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A