孫瑯，劉建華，聶彤穎，胡辛欣，李聰然，游雪甫

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萬古霉素非敏感腸球菌的篩選和基因型分析

孫瑯，劉建華，聶彤穎，胡辛欣，李聰然，游雪甫

【摘要】

目的對實驗室保存的 325 株腸球菌進行萬古霉素非敏感腸球菌篩選，并對篩選出的菌株進行耐藥表型、耐藥基因型、菌株同源性分析。

方法采用瓊脂平皿二倍稀釋法篩選萬古霉素非敏感腸球菌，并檢測菌株對替考拉寧的敏感性；采用 PCR 方法檢測萬古霉素非敏感腸球菌的耐藥基因型；通過腸道細菌基因間重復一致序列（ERIC）PCR 技術、脈沖場凝膠電泳（PFGE）技術、多位點序列分型（MLST）技術進行菌株的同源性分析。

結果從 325 株臨床分離腸球菌中共篩選出 17 株萬古霉素非敏感腸球菌，包括 1 株糞腸球菌、11 株屎腸球菌和5 株鶉雞腸球菌。其中 1 株糞腸球菌和 11 株屎腸球菌對萬古霉素顯示高水平耐藥，對替考拉寧耐藥或中介耐藥，PCR 檢測結果顯示 vanA 型；5 株鶉雞腸球菌對萬古霉素中介耐藥，對替考拉寧敏感，PCR 檢測結果顯示 vanC1 型。ERIC 同源性分析顯示同基因型的大多數(shù)菌株顯示相似的分型；PFGE 同源性分析顯示，17 株臨床萬古霉素非敏感腸球菌分型不同，不屬于單克隆流行播散；MLST 同源性分析顯示，1 株臨床萬古霉素非敏感糞腸球菌屬于 ST4，11 株臨床萬古霉素非敏感屎腸球菌共分為 6 個 ST 型，其中 4 株屬于 ST78，是屎腸球菌出現(xiàn)頻率最高的 ST 型。

結論我國萬古霉素耐藥菌在糞腸球菌中分離率較低，但屎腸球菌中萬古霉素耐藥情況較嚴重，并且耐藥菌株攜帶易于傳播和轉移的 vanA 基因。同源性分析結果顯示萬古霉素耐藥存在同源性傳播的可能性。

【關鍵詞】糞腸球菌；屎腸球菌；萬古霉素抗藥性；基因型；多位點測序分型；腸道細菌基因間重復一致序列

www.cmbp.net.cn中國醫(yī)藥生物技術, 2016, 11(3):206-215

作者單位：100050 北京，中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院醫(yī)藥生物技術研究所藥理室（孫瑯、聶彤穎、胡辛欣、李聰然、游雪甫）；075000 張家口，河北北方學院附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科（劉建華）

腸球菌是一種較常見的革蘭陽性條件致病球菌，可導致人體多臟器感染，其中糞腸球菌和屎腸球菌是導致人體感染的常見腸球菌，而其他類型腸球菌如鉛黃腸球菌、鶉雞腸球菌等也時有致病情況出現(xiàn)。萬古霉素為糖肽類抗生素，被用作“最后一道防線”治療對其他抗生素無效的嚴重革蘭陽性菌感染，如嚴重腸球菌感染。而萬古霉素耐藥腸球菌（vancomycin resistant enterococci，VRE）的出現(xiàn)對臨床治療帶來了極大的困難。1988 年，英國倫敦首次報道 VRE［1-2］，此后在多個國家都分離出VRE 菌株，并且 VRE 分離率出現(xiàn)明顯上升趨勢。美國 VRE 感染率 1989 年為 0.4%，而 2005 年則上升到 28% 左右［3］，2013 年 VRE 院內(nèi)感染率達到了 30%。美國每年約有 20 000 人感染 VRE，約 1300 人死亡［4］。在歐洲，由于阿伏帕星早期在畜牧業(yè)的廣泛應用，導致動物腸道 VRE 菌株大量存在［5］。我國 VRE 發(fā)生率相對較低，一直穩(wěn)定在3% ～ 5% 之間，但近年來屎腸球菌在整個腸球菌中所占的比例在上升，而 VRE 主要出現(xiàn)在屎腸球菌中。CHINET 細菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)數(shù)據(jù)結果顯示，萬古霉素耐藥屎腸球菌分離率 2005 年為 0.35%［6］，而2014 年上升至 4.2%［7］。

目前還沒有有效治療 VRE 感染的藥物，臨床上主要通過 VRE 耐藥表型來選擇治療藥物。根據(jù)菌株對萬古霉素和替考拉寧的不同耐藥水平及耐藥基因簇的差異，可將 VRE 分為 9 種表型，vanA、vanB、vanC（C1、C2、C3）、vanD、vanE、vanG、vanL、vanM 和 vanN［8-12］。其中 vanA、vanB、vanD 和 vanM 型介導合成以 D-丙氨酸-D-乳酸結尾的肽聚糖前體，而 vanC、vanE、vanG、vanL 和vanN 型介導合成以 D-丙氨酸-D-絲氨酸結尾的肽聚糖前體，兩種前體對糖肽類親和力降低（與天然的以 D-丙氨酸-D-丙氨酸結尾的前體相比），從而表現(xiàn)出對糖肽類的耐藥性。vanA 型和 vanB 型是具有重要臨床意義的耐藥表型，兩者耐藥菌株多見于屎腸球菌和糞腸球菌。vanA 型耐藥的 VRE 對萬古霉素呈現(xiàn)高水平耐藥（MIC 64 ～ ＞ 512 μg/ml），可以由萬古霉素和替考拉寧誘導產(chǎn)生，多由質粒介導，耐藥基因位于轉座子 Tn1546 上，易于轉移。vanB 耐藥表型對萬古霉素呈現(xiàn)異質性的耐藥，而對替考拉寧表現(xiàn)為敏感。vanB 型耐藥基因多位于宿主染色體上，也可存在于質粒上，耐藥性也可被轉移。vanC 耐藥多見于低水平萬古霉素耐藥（MIC 4 ～ 32 μg/ml）的天然菌株，如鉛黃腸球菌或鶉雞腸球菌等，并且對替考拉寧敏感。本研究中，我們對實驗室保存的 2006 - 2012 年臨床分離的 325 株腸球菌進行了萬古霉素耐藥性的篩選，并對篩選出的 VRE 進行了耐藥基因型分析，以期為應對VRE 感染和抗 VRE 藥物研發(fā)提供支持和參考。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株實驗菌株為 2006 - 2012 年從北京地區(qū)醫(yī)院患者尿液、痰液、血液、分泌物等標本中分離的 325 株腸球菌，包括 208 株糞腸球菌，111 株屎腸球菌和 6 株其他腸球菌（鉛黃腸球菌、鶉雞腸球菌）。質控菌糞腸球菌 ATCC29212、糞腸球菌 ATCC51299（vanB）、糞腸球菌 ATCC700802、糞腸球菌 ATCC51575、屎腸球菌 ATCC700221 （vanA）購自美國模式培養(yǎng)物中心（ATCC），菌株經(jīng) VITEK 2-compact 全自動細菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)鑒定后使用。對于篩選出的萬古霉素非敏感菌株用 16S rRNA 測序法再次確定菌株類型。

1.1.2試劑萬古霉素、替考拉寧為中國食品藥品檢定研究院標準品；BHI 瓊脂為美國 BD 公司產(chǎn)品；GoTaq Green MasterMix 為美國 Promega 公司產(chǎn)品；溶菌酶為上海生工生物工程有限公司產(chǎn)品；變?nèi)芫貫槊绹?Sigma 公司產(chǎn)品；蛋白酶 K、限制性內(nèi)切酶 Sma I 為日本 Takara 公司產(chǎn)品；MidRange PFG marker I 為美國 BioLabs 公司產(chǎn)品；PCR 引物的合成和產(chǎn)物測序由上海英駿生物技術有限公司完成。

1.1.3主要儀器PCR 擴增儀為美國 AB 公司產(chǎn)品；全自動微生物分析鑒定儀為法國 Bio-Merieux公司產(chǎn)品；凝膠成像儀和脈沖場凝膠電泳儀為美國Bio-Rad 公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1萬古霉素非敏感腸球菌篩選通過瓊脂平皿二倍稀釋法測定受試腸球菌對萬古霉素的敏感性（最小抑菌濃度），篩選萬古霉素非敏感腸球菌。所用培養(yǎng)基為含 5% 無菌羊血的 MH 瓊脂。實驗過程中將過夜培養(yǎng)的新鮮菌液適當稀釋后，接種于含不同萬古霉素濃度的血平皿中，使接種量為104CFU/點，37 ℃ 培養(yǎng) 24 h，肉眼觀察無菌生長的最低藥物濃度即為最小抑菌濃度。萬古霉素受試濃度為 0.03 ～ 128 μg/ml。以萬古霉素敏感菌糞腸球菌ATCC29212 和萬古霉素耐藥糞腸球菌ATCC51299 為質控菌。腸球菌的萬古霉素敏感性標準為：≤ 4 μg/ml，敏感；8 ～ 16 μg/ml，中介；≥32 μg/ml，耐藥［13］。

1.2.2萬古霉素非敏感腸球菌的耐藥表型測定對篩選出的萬古霉素非敏感腸球菌，測定其對替考拉寧的敏感性，根據(jù)菌株對萬古霉素和替考拉寧的 MIC 值獲得其耐藥表型特征。菌株對替考拉寧的最小抑菌濃度測定方法同萬古霉素，替考拉寧受試濃度范圍為 0.03 ～ 128 μg/ml。腸球菌的替考拉寧敏感性標準為：≤ 8 μg/ml，敏感；16 μg/ml，中介；≥ 32 μg/ml，耐藥［13］。

1.2.3萬古霉素非敏感腸球菌耐藥基因的 PCR檢測對篩選出的萬古霉素非敏感腸球菌，用 PCR方法檢測萬古霉素耐藥基因 vanA、vanB、vanC1、vanC2/3。參考文獻［14］設計引物，所用引物及擴增片段大小見表1。水煮法提取染色體 DNA 制備PCR 模板，方法為取劃線于 BHI 瓊脂平皿上的新鮮菌落 3 ～ 5 個，懸于 50 μl ddH2O 中，煮沸 10 ～15 min；離心取上清。PCR 反應條件為 95 ℃ 預變性 3 min；95 ℃ 變性 30 s，56 ℃ 退火 30 s，72 ℃延伸 45 s，重復 35 個循環(huán)，而后再 72 ℃ 延伸5 min。PCR 結束后用 1.5% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，并取不同基因型陽性菌株條帶測序鑒定。實驗過程中不含耐藥基因的萬古霉素敏感菌糞腸球菌ATCC29212 為陰性質控，而含耐藥基因 vanA 或vanB 的糞腸球菌 ATCC51299（vanB）、糞腸球菌ATCC700802（vanB）、糞腸球菌 ATCC51575 （vanB）、屎腸球菌 ATCC700221（vanA）為陽性質控。每個菌株至少重復 2 次實驗。

1.2.4ERIC-PCR 技術進行菌株的同源性分析用 ERIC-PCR 分析［15］實驗菌株的同源性。所用引物為 ERIC-P，序列見表1。菌株總 DNA 提取方法如前所述。ERIC-PCR 體系為 20 μl，引物終濃度為 0.25 μmol/L。PCR 反應條件為 95 ℃ 預變性 7 min；94 ℃ 變性 1 min，36 ℃ 退火 1 min，65 ℃ 延伸 8 min，重復 32 個循環(huán)；而后再 65 ℃延伸 16 min。PCR 結束后用 1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，根據(jù)菌株 ERIC-PCR 條帶特點分型，主、副帶均相同判定為同一型；主帶相同、副帶不同判定為同一型的不同亞型；主帶不同判定為不同型。

1.2.5PFGE 技術進行菌株的同源性分析對篩選得到的臨床非敏感腸球菌，采用 PFGE 分析菌株同源性［16］。挑取單個菌落于 4 ml 腦心湯液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 靜止培養(yǎng)過夜至 OD610 nm為 1.3 ～ 1.4，取 300 μl 菌液離心取沉淀（12 000 r/min、2 min）。用 150 μl CSB 緩沖液（100 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L EDTA，pH 8.0）重懸菌體沉淀，加入3 μl 濃度為 100 mg/ml 的溶菌酶和 3 μl 濃度為1 kU/ml 變?nèi)芫赜?37 ℃ 孵育 5 min，向菌體中加入 150 μl 1% 低熔點瓊脂糖灌注模型。模塊凝固后置于加入 35 μl 溶菌酶和 10 μl 變?nèi)芫氐?00 μl TE 緩沖液（10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，pH 8.0）中孵育 4 h，棄去裂解液，用 TE 緩沖液洗滌 2 遍，加入 1 ml CLB（50 mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L EDTA，pH 8.0，加 1% 十二烷基肌氨酸鈉）緩沖液和 40 μl 濃度為 20 mg/ml的蛋白酶 K，于 54 ℃ 條件下消化過夜。用 1 ml水洗 2 次，再用 TE 洗 3 遍，在第 1、2 次洗滌時加入 1 mmol/L PMSF 使殘余的蛋白酶 K 失活。用刀片切下約 2 mm 的膠，加入 40 U 限制性內(nèi)切酶 Sma I 于 37 ℃ 下酶切 2 h，上樣跑膠。糞腸球菌、屎腸球菌電泳程序為電壓：6 V，脈沖時間：1 ～ 20 s，電泳時間：20 h。鶉雞腸球菌電泳程序為電壓：6 V，脈沖時間：1 ～ 15 s，電泳時間：20 h。采用 Quantity One 軟件繪制菌株進化樹。

表1　萬古霉素耐藥基因 PCR 檢測及 ERIC 分型所用引物Table 1　Primers used in PCR detection of the vancomycin resistance gene and ERIC typing

表2　屎腸球菌 MLST 分型 7 個等位基因所用引物Table 2　Primers used in MLST of Enterococcus faecium

1.2.6MLST 技術進行菌株的同源性分析擴增7 個內(nèi)源性管家基因，反應條件及引物序列參考MLST 網(wǎng)站（http：//www.mlst.net/），屎腸球菌擴增基因分別是 adk、atpA、ddl、purK、pstS、gyd、gdh，引物序列見表2，糞腸球菌擴增基因分別是gdh、gyd、pstS、gki、aroE、xpt、yiqL，引物序列見表3，所有 PCR 產(chǎn)物進行雙向測序，參考eBURST v.3 軟件系統(tǒng)確定單克隆復雜性菌株之間的單個位點的變異信息，從而快速獲得該菌株的流行病學方面信息。

表3　糞腸球菌 MLST 分型 7 個等位基因所用引物Table 3　Primers used in MLST of Enterococcus faecalis

2　結果

2.1萬古霉素非敏感腸球菌篩選

測定 325 株腸球菌的萬古霉素最小抑菌濃度，結果顯示有 17 株為萬古霉素非敏感菌，包括1 株糞腸球菌，11 株屎腸球菌和 5 株鶉雞腸球菌。208 株糞腸球菌中檢測出 1 株萬古霉素耐藥菌，檢出率為 0.5%。111 株屎腸球菌中共檢出11 株萬古霉素耐藥菌，檢出率為 10%。6 株其他腸球菌中共檢出 5 株萬古霉素中介耐藥腸球菌，檢出率為 83.3%。檢出的萬古霉素非敏感腸球菌對萬古霉素的最小抑菌濃度見表4。

2.2萬古霉素非敏感腸球菌的耐藥表型測定

對篩選出的 17 株萬古霉素非敏感腸球菌（12 株萬古霉素耐藥腸球菌和 5 株萬古霉素中介耐藥腸球菌），進一步測定其對替考拉寧的敏感性，根據(jù)菌株對萬古霉素和替考拉寧的MIC 值獲得菌株的糖肽類耐藥表型特征。實驗結果顯示，1 株萬古霉素耐藥糞腸球菌和 9 株萬古霉素耐藥屎腸球菌對萬古霉素和替考拉寧均顯示較高水平的耐藥；2 株屎腸球菌對萬古霉素顯示較高水平的耐藥，而對替考拉寧顯示中介耐藥（MIC = 16 μg/ml）；5 株鶉雞腸球菌對萬古霉素顯示中介耐藥（MIC = 8 μg/ml），對替考拉寧敏感（MIC 范圍為 0.06 ～ 0.5 μg/ml）。

2.3萬古霉素非敏感腸球菌耐藥基因的 PCR 檢測

對篩選出的萬古霉素非敏感腸球菌，用 PCR方法檢測萬古霉素耐藥基因 vanA、vanB、vanC1、vanC2/3。實驗過程中平行進行萬古霉素敏感腸球菌（臨床菌及標準菌）和萬古霉素耐藥標準腸球菌的耐藥基因擴增，作為陰性和陽性對照，實驗結果見表4，實驗菌株電泳圖譜見圖1。所有 17 株萬古霉素非敏感腸球菌中均檢測到萬古霉素耐藥基因，其中 1 株萬古霉素耐藥糞腸球菌和 11 株萬古霉素耐藥屎腸球菌為 vanA 型，對萬古霉素中介耐藥的 5 株鶉雞腸球菌為 vanC1 型，所有菌株中均未擴增出 vanB 基因。將部分陽性菌株 PCR 產(chǎn)物送樣測序，測序結果顯示與 PubMed 數(shù)據(jù)庫一致。

2.4用 ERIC-PCR 技術進行菌株的同源性分析

應用 ERIC-PCR 技術對包括萬古霉素非敏感臨床分離腸球菌、萬古霉素敏感標準菌、萬古霉素耐藥標準菌及萬古霉素敏感臨床分離菌的共 28 株菌進行同源性分析，結果見表4 和圖2。根據(jù)ERIC 圖譜特點，28 株菌株共分為 9 個譜型。糞腸球菌 VSE 標準菌 ATCC29212 顯示出與臨床分離 VSE 糞腸球菌 0911 相似的 A 型 ERIC 圖譜。VanB 型 VRE 糞腸球菌 ATCC51299、糞腸球菌 EFL4041、糞腸球菌 ATCC700802 具有相似的B 型 ERIC 圖譜，并且該圖譜與糞腸球菌 HH22相近，而同屬于 VanB 型的糞腸球菌 ATCC51575則顯示出與此不同的 C 型圖譜，說明該菌株與上述菌株同源性較差。VanA 型糞腸球菌 0909 顯示出與 VSE 糞腸球菌 0910 相似的 E 型譜圖。VanA 標準屎腸球菌 ATCC700221 與臨床分離VSE 屎腸球菌 0809 和臨床分離 VanA 型屎腸球菌 1202 顯示相似的 G 型譜圖。而大多數(shù) VanA屎腸球菌則顯示 F 型譜圖。VanA 型屎腸球菌的其他譜圖類型還包括 H 型和 I 型。VanA 型屎腸球菌 0607、0925、1104 和 VanC1 型鶉雞腸球菌0610 未檢測出 ERIC 圖譜，而 VanC1 型鶉雞腸球菌均顯示 D 型譜圖。

表4　實驗所用腸球菌表型、基因型及 ERIC 分型結果Table 4　Phenotype， genotype and ERIC typing analysis results for the tested enterococci

A： vanA； B： vanB； C： vanC1； 1： E. faecalis ATCC29212 （VSE）； 2： E. faecalis 0910 （VSE）； 3： E. faecium ATCC700221 （vanA positive）； 4： E. faecalis 0909；5： E. faecium 1103； 6： E. faecalis ATCC51299 （vanB positive）； 7： E. faecalis ATCC51575 （vanB positive）； 8： E. faecalis EFL4041； 9： E. gallinarum 0810；10： E. gallinarum 0926； 11： E. gallinarum 0610； 12： E. gallinarum 0614； M： Marker圖1　萬古霉素非敏感腸球菌基因型檢測代表性圖譜Figure 1　Electrophoresis analysis figures for genotype detection of representative vancomycin nonsusceptible enterococci

M： Marker； 1 - 6， 8 - 10： E. faecalis ATCC29212， ATCC51299， EFL4041， ATCC700802， ATCC51575， HH22， 0909， 0910， 0911； 7， 11， 13， 14，15： E. gallinarum 0810， 0926， 0609， 0610， 0614； 12， 16 - 28： E. faecium 0607， 0628， 0629， ATCC700221， 0809， 0810， 0811， 0830， 0921， 0925， 1103， 1104，1201， 1202圖2　萬古霉素非敏感腸球菌的 ERIC-PCR 電泳檢測圖譜Figure 2　Electrophoresis analysis of ERIC-PCR results from vancomycin nonsusceptible enterococci

2.5用 PFGE 技術進行菌株的同源性分析

采用 PFGE 技術對 17 株萬古霉素非敏感腸球菌進行同源性分析，屎腸球菌采用ATCC700802作為對照，糞腸球菌采用 ATCC29212 作為對照，結果見圖3 和圖4。結果顯示，17 株腸球菌表現(xiàn)出不同的同源性，糞腸球菌、屎腸球菌、鶉雞腸球菌不同種屬之間差異較大，同源性系數(shù)均在 50%以下，同屬于屎腸球菌的 11株 vanA 型耐藥菌株不屬于同一型，可見不屬于單克隆流行播散。

2.6用 MLST 技術進行菌株的同源性分析

采用 MLST 技術對 11株臨床萬古霉素非敏感屎腸球菌和 1 株萬古霉素非敏感糞腸球菌進行同源性分析。屎腸球菌以 ATCC700221 作為對照，糞腸球菌以 ATCC51299 作為對照，結果見表5和表6。萬古霉素非敏感屎腸球菌共分為 6 個 ST型，其中兩株為 ST17，兩株為 ST323 型，四株為ST78，另三株分別屬 ST571、ST262、ST203，ST78、ST203、ST17 屬于同一個克隆復合型 CC17。1 株臨床的萬古霉素非敏感糞腸球菌屬于 ST4 型。

M： MidRange PFG marker I （15.0， 33.5， 48.5， 63.5， 82.0， 97.0， 112.0， 130.5， 145.5， 160.5， 179.0， 194.0， 209.0， 227.5， 242.5， 257.5， 276.0， 291.0）； 1， 2， 4 - 12：E. faecium ATCC700802， 0607， 0628， 0629， 0811， 0830， 0921， 0925， 1103， 1201， 1202； 13 - 14： E. faecalis ATCC29212， 0909； 3， 15 - 18： E. gallinarum 0610，0609， 0614， 0810， 0926圖3　萬古霉素非敏感腸球菌的 PFGE 電泳圖Figure 3　Electrophoresis analysis of PFGE results from vancomycin nonsusceptible enterococci

圖4　萬古霉素非敏感腸球菌的 PFGE 聚類圖Figure 4　Hierarchical cluster analysis of PFGE results from vancomycin nonsusceptible enterococci

3　討論

萬古霉素作用于細菌細胞壁，通過與細菌胞壁上的以 D-丙氨酸-D-丙氨酰為末端的肽聚糖前體小肽特異性結合使細菌細胞壁合成受阻而死亡。萬古霉素耐藥腸球菌由于可產(chǎn)生一種以 D-丙氨酸-D-乳酸或 D-丙氨酸-D-絲氨酸為末端的肽聚糖前體，使萬古霉素與之無法結合而耐藥。根據(jù)菌株對萬古霉素和替考拉寧的不同耐藥水平，VRE 可分為多種表型，其中具有重要臨床意義的耐藥表型為vanA 型以及 vanB 型，兩者耐藥菌株多見于屎腸球菌和糞腸球菌，表現(xiàn)對萬古霉素的高水平耐藥或異質性耐藥，并且易于轉移。而 vanC 型耐藥通常是固有型的，主要存在于鶉雞腸球菌（vanC1 型）或鉛黃腸球菌、黃色腸球菌（vanC2/3）等［17-18］，對萬古霉素低水平耐藥。

本研究中，我們通過瓊脂平皿篩選法對實驗室保存的 325 株北京地區(qū)臨床分離腸球菌進行了VRE 菌株篩選，并進一步檢測了這些菌株對替考拉寧的敏感性。結果共篩選出 17 株萬古霉素非敏感菌，包括 1 株糞腸球菌，11 株屎腸球菌和 5 株鶉雞腸球菌。其中 208 株糞腸球菌中檢測出 1 株VRE，檢出率為 0.5%。111 株屎腸球菌中檢出11 株 VRE，檢出率為 10%。而 6 株其他腸球菌中共檢出 5 株萬古霉素中介耐藥腸球菌，檢出率為 83.3%。結果與已有報道相近，VRE 在我國糞腸球菌中檢出率低，但在屎腸球菌中占有較高的比例［6-7， 18-19］，值得注意。對這些菌株進一步的替考拉寧敏感度測定結果顯示，糞腸球菌 VRE 和大多數(shù)屎腸球菌 VRE 菌對替考拉寧耐藥，呈現(xiàn) VanA 型表型；5 株鶉雞腸球菌 VRE 對替考拉寧敏感，呈現(xiàn) VanC 型表型。

表5　糞腸球菌 MLST 分型結果Table 5　MLST typing analysis results for the tested Enterococcus faecalis

表6　屎腸球菌 MLST 分型結果Table 6　MLST typing analysis results for the tested Enterococcus faecium

對萬古霉素非敏感腸球菌進行 vanA、vanB、vanC 的 PCR 檢測結果顯示，與表型一致，萬古霉素耐藥、替考拉寧耐藥的糞腸球菌和屎腸球菌VRE 顯示 vanA 陽性 PCR 結果，而萬古霉素中度敏感、替考拉寧敏感的鶉雞腸球菌則顯示 vanC1陽性結果，實驗過程中未發(fā)現(xiàn) vanB 型 VRE。VanA型萬古霉素耐藥腸球菌對萬古霉素和替考拉寧均耐藥，并且耐藥性易于轉移至其他腸球菌，甚至金黃色葡萄球菌［20］，對臨床危害大。

用于分子流行病學研究的技術包括擴增片段長度多態(tài)性分析（amplified fragment length polymorphism，AFLP）、限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性分析（restriction fragment length polymorphism，RFLP）、隨機引物擴增 DNA 多態(tài)性分型（random amplified polymorphim DNA，RAPD）、PFGE、MLST、ERIC-PCR 等，其中 ERIC-PCR 具有操作簡單，靈敏度高等特點，在分子流行病學領域得到廣泛應用。ERIC 序列［14］是主要存在于腸道細菌基因間的重復序列，可以形成穩(wěn)定的莖環(huán)結構，定位于基因組內(nèi)可轉錄的非編碼區(qū)域或者與轉錄有關的區(qū)域。該序列長 124 ～ 127 bp，并且在其中心存在高度保守、長約 40 bp 的核心反向重復序列。ERIC-PCR 技術是利用 ERIC 核心的高度保守序列設計引物進行 PCR，擴增兩個 ERIC 序列之間的 DNA 片段。本研究中以 ERIC 序列為引物的結合位點，通過聚合酶鏈反應擴增腸球菌的基因，對其進行分子流行病學研究。ERIC 受試菌株共分為9 個 ERIC 譜型，其中本次實驗中檢測出的臨床分離 vanA 型 VRE 糞腸球菌 0909 顯示出與 VSE糞腸球菌 0910 相似的 E 型譜圖。11 株 vanA 型臨床分離 VRE 屎腸球菌中，3 株未檢測到 ERIC譜圖，5 株顯示 F 型譜圖，1 株顯示 H 型譜圖，1 株顯示 I 型譜圖，而臨床分離 vanA 型屎腸球菌 1202 與 vanA 型標準屎腸球菌 ATCC700221和臨床分離 VSE 屎腸球菌 0809 顯示相似的 G型譜圖。4 株 vanC1 型鶉雞腸球菌顯示 D 型譜圖，而 1 株vanC1 型鶉雞腸球菌 0610 未檢測到ERIC 條帶。上述結果顯示，檢測到 ERIC 條帶的8 株 vanA 型屎腸球菌 5 株具有相似的 ERIC 圖譜（F 型），說明萬古霉素耐藥存在同源性傳播的可能性。同時，vanA 型糞腸球菌 0909 和 vanA 型屎腸球菌 1202 分別與相應的敏感菌株具有類似的 ERIC 圖譜，說明耐藥菌株可能經(jīng)由敏感菌株獲得 vanA 耐藥基因而產(chǎn)生。PFGE 適用于比較確定的高度變異片段，具有高分辨力，但是不適用于進行全面的流行病學調(diào)查，且不同實驗室間重復性較差，而 MLST 具有一套標準化的技術，在不同實驗室間重復性較好，可用來比較進化較慢的位點。采用 PFGE 技術和 MLST 技術分析臨床萬古霉素非敏感腸球菌分子流行病學特征，PFGE 實驗結果表明萬古霉素非敏感屎腸球菌 81.8%（9/11）相似性在 55% 以上，屎腸球菌、糞腸球菌、鶉雞腸球菌不同種屬之間差異較大。MLST 分型結果將所有的萬古霉素非敏感屎腸球菌分成六型（ST17、ST78、ST203、ST323、ST571、ST262），其中 ST17、ST203、ST571、ST262 占 9.1%，ST78 占 36.3%，ST323 占 18.2%。萬古霉素耐藥屎腸球菌分型結果與國內(nèi)發(fā)現(xiàn)的萬古霉素耐藥腸球菌的流行株分型情況相似［21-23］，均含有 ST78 和 ST203，ST78 是傳播最為廣泛的一個 ST 型，ST17、ST203、ST78、ST323 屬于同一個克隆復合型 CC17。CC17 克隆株是醫(yī)院的優(yōu)勢菌群，已分布在世界各地，曾多次造成院內(nèi)暴發(fā)流行［24-25］。僅有的一株萬古霉素耐藥糞腸球菌為 ST4 型，屬于 CC4 克隆株，這株克隆株并不屬于臨床大量出現(xiàn)的菌株，但是此克隆株曾在其他的亞太國家造成嚴重感染。

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Author Affiliations: Department of Pharmacology， Institute of Medicinal Biotechnology， Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College， Beijing 100050， China （SUN Lang， NIE Tong-ying， HU Xin-xin， LI Cong-ran， YOU Xue-fu）；Department of Respiratory Medicine， First Affiliated Hospital of Hebei North University， Zhangjiakou 075000， China （LIU Jian-hua）

www.cmbp.net.cnChin Med Biotechnol, 2016, 11(3):206-215

·協(xié)會之窗·

Screening and genotype analysis of vancomycin-non-susceptible enterococci

SUN Lang， LIU Jian-hua， NIE Tong-ying， HU Xin-xin， LI Cong-ran， YOU Xue-fu

【Abstract】

ObjectiveTo screen vancomycin-non-susceptible enterococci from 325 strains of clinical enterococci isolated from 2006 to 2012，and to further conduct the resistance phenotype， resistance genotype and homology analysis of the vancomycin-non-susceptible enterococci.

MethodsScreening of the vancomycin-non-susceptible enterococci and detection of the susceptibility to teicoplanin were conducted by blood agar dilution method. Resistance genotypes were determined by PCR method. Homology analysis was carried out by ERIC-PCR， PFGE and MLST technology.

ResultsTotally 17 strains of vancomycin-non-susceptible enterococci were screened out from 325 strains of clinical enterococci，including 1 strain of E. faecalis， 11 strains of E. faecium， and 5 strains of E. gallinarum. 1 strain of E. faecalis and 11 strains of E. faecium showed high level resistance to vancomycin， and resistance or intermediate resistance to teicoplanin， PCR results suggesting vanA genotype. 5 strains of E. gallinarum demonstrated intermediate resistance to vancomycin， and susceptibility to teicoplanin，PCR results suggesting vanC1 genotype. ERIC homology analysis results showed that most of isolates with the same genotype demonstrated similar ERIC profiles. Pulsed-field gel electrophoresis results of 17 strains of vancomycin-non-susceptible enterococci showed differences in PFGE type. 1 strain of E. faecalis displayed ST4 in multilocus sequence typing analysis， and 11 strains of E. faecium isolates were typed into six different sequence types （STs）， including ST17， ST78， ST203， ST323， ST571， ST262. Four of the E. faecium isolates belonged to ST78， which was the most prevalent ST type in E. faecium of this study.

ConclusionsIn our country， vancomycin resistance rate is low in E. faecalis， but vancomycin resistance is relatively a seriousproblem in E. faecium. And the resistant isolates usually carry the vanA gene favoring resistance transfer between different isolates. Homology analysis of vancomycin resistant isolates suggests the possibility of homologic transfer of vancomycin resistance.

【Key words】Enterococcus faecalis；Enterococcus faecium；Vancomycin resistance；Genotype；Multilocus sequence typin；Enterobacterial repetitive integenic consensus

DOI：10.3969/j.issn.1673-713X.2016.03.003

基金項目：國家高技術研究發(fā)展計劃（863 計劃）（2014AA021101）； “十二五” 國家科技重大專項（2012ZX09301002-005）

通信作者：李聰然，Email：cong5885@aliyun.com；游雪甫，Email：xuefuyou@hotmail.com

收稿日期：2016-01-22

Corresponding Authors: LI Cong-ran， Email： cong5885@aliyun.com； YOU Xue-fu， Email： xuefuyou@hotmail.com